郝 勝 吳 瀅 何威遜 康郁林 黃文彥 朱光華

上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學附屬兒童醫(yī)院腎臟風濕科（上海 200040）

兒童原發(fā)性腎病綜合征腎組織瞬時受體電位陽離子通道蛋白6表達及意義

郝 勝 吳 瀅 何威遜 康郁林 黃文彥 朱光華

上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學附屬兒童醫(yī)院腎臟風濕科（上海 200040）

目的探討原發(fā)性腎病綜合征（PNS）患兒腎組織中瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（TRPC6）的表達與足細胞損傷的關系及其臨床意義。方法獲取18例PNS患兒的腎組織，常規(guī)切片染色光鏡觀察腎臟組織病理改變，電鏡觀察足細胞的結構變化，分別用qPCR和免疫組化測定組織中TRPC6 mRNA和蛋白的表達，并將TRPC6 mRNA表達分別與血清白蛋白（Alb）、肌酐（Cr）、三酰甘油（TG）、膽固醇（Tch）、補體C3水平及24 h尿蛋白定量和評估的腎小球濾過率（eGFR）進行相關性分析。結果PNS患兒腎組織中TRPC6 蛋白表達較對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PNS患兒腎組織中TRPC6 mRNA的相對表達量與腎組織TRPC6蛋白表達呈顯著正相關（r=0.508，P＜0.05），與血清Alb、Cr、TG、Tch、補體C3、eGFR水平以及24 h尿蛋白定量無相關性（P＞0.05）。結論PNS患兒的病理類型仍以足細胞病變?yōu)橹鳎淠I小球足細胞中TRPC6蛋白表達升高。TRPC6檢測可能有助于足細胞病變診斷。

腎病綜合征； 足細胞； 兒童

原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是兒童時期最常見的腎臟疾病之一，而腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）的發(fā)病機制目前仍未完全闡明，大量蛋白尿被認為是NS發(fā)病機制中的關鍵環(huán)節(jié)，蛋白尿的形成主要是由于腎小球濾過膜對血漿蛋白的通透性增高所致。足細胞是腎小球濾過屏障形成的關鍵部分[1]，在維持腎小球濾過膜的完整性中起重要作用[2]，其胞體向外伸出的足突包繞腎小球的毛細血管，構成了腎小球濾過屏障的最外層，相鄰足突間形成的裂孔隔膜（slit diaphragm，SD）像分子篩一樣使濾過膜具有選擇通透性，這種結構的破壞導致其通透性增高，從而產(chǎn)生蛋白尿。近年發(fā)現(xiàn)的瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（transient receptor potential channels，TRPC6）是SD結構的重要組成部分。本研究通過檢測TRPC6在兒童PNS患者腎組織中的表達，探討其在PNS腎小球足細胞損傷中的變化，為兒童PNS的機制研究以及治療提供理論基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2012年1月至2013年6月入住上海交通大學附屬兒童醫(yī)院腎臟風濕科并確診為PNS的患兒為研究對象。入選標準：①符合兒童原發(fā)性腎病綜合征的診斷標準[3]；②行腎組織穿刺活檢術明確病理類型；③排除繼發(fā)性及先天性腎病綜合征。對照組為同期住院的泌尿系統(tǒng)腫瘤切除患兒，取遠離腫瘤的正常腎組織。研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，家長簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 腎活檢組織處理 腎組織石蠟切片常規(guī)行蘇木精-伊紅（HE）、PAS、PASM以及Masson三色染色，光鏡下觀察腎組織病理改變；冰凍切片直接行免疫熒光標記；電鏡組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、染色后在透射電鏡下觀察。電鏡設備為日立公司的H600型透射電子顯微鏡。

1.2.2 腎小球TRPC6蛋白檢測 取厚石蠟（4μm）切片，常規(guī)脫蠟，在甲醇中3% H2O2封閉30 min，微波修復10 min，1%BSA室溫封閉1 h。滴加一抗TRPC6兔抗人抗體（Santa Cruz，MA，1∶100），4 ℃孵育過夜。PBS漂洗，加辣根過氧化物酶標記二抗（Pierce，USA）37℃孵育30 min。PBS漂洗，顯微鏡下DAB顯色，復染，脫水干燥，透明，封固。陰性對照為同等濃度的兔血清IgG（Pierce，USA）染色切片。結果分析應用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)，計數(shù)每例患兒至少3個完整腎小球視野（200倍光學顯微鏡下隨機選取），選定拍攝圖片上腎小球具有染色調(diào)的區(qū)域（AOI area of interesting），測定其面積和積分光密度（IOD），計算平均吸光度（IOD/ area），即為腎小球TRPC6蛋白表達量。

1.2.3 腎組織TRPC6 mRNA檢測 采用實時定量聚合酶聯(lián)反應（real-time quantitative PCR detecting system，qPCR）檢測。腎組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，其后參照SYBR Green qPCR SuperMix反應試劑盒（Invitrogen公司）說明書進行qPCR，定量PCR儀為ABI PRISM?7500 Sequence Detection System。β-actin、TRPC 6引物由上海銳金生物醫(yī)藥科技有限公司公司合成；β-actin引物序列：上游5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3' ，下游5'-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3'；TRPC6引物序列：上游 5'-ACTTCCTGTCCCCTTCAATC-3'，下游5'-GTTTGTTGTGTGCCAACTGA-3'；以β-actin為內(nèi)參，計算目的基因2－ΔΔCt值作為其相對表達水平。

1.2.4 臨床生化常規(guī)檢測 腎活檢前一天采集血清及尿液送檢臨床常規(guī)各生化指標。各患兒血清白蛋白（Alb）、肌酐（Cr）以及24 h尿蛋白定量采用日立7060全自動生化儀，補體C3檢測采用德靈全自動分析儀（DADE BEHRING BN ProSpec），并根據(jù)Schwatz公式計算出患兒的腎小球濾過率（eGFR）。并將PNS患兒TRPC6 mRNA表達分別與其蛋白的表達和以上指標進行相關性分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用SAS6.12統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差描述，兩組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用秩和檢驗。兩組變量之間采用Pearson或Spearman相關分析。采用Kappa檢驗對兩位病理醫(yī)師的評判結果進行一致性檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

PNS患兒18例，男12例、女6例，中位年齡7（3～9）歲；對照組11例，男7例、女4例，中位年齡7（5～9）歲。兩組在性別構成比（Fisher精確概率法，P=1.000）、年齡（Z=0.23，P=0.820）方面差異無統(tǒng)計學意義。18例PNS患兒中激素敏感14例，其中激素依賴10例；激素耐藥4例。18例PNS患兒中，病理類型為微小病變（minimal change disease，MCD）12例，局灶節(jié)段硬化（focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS）4例，系膜增生性腎小球腎炎（mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）2例，兩位病理醫(yī)師的評判結果具有一致性（Kappa=0.40，P=0.026）。

2.2 腎組織TRPC6蛋白表達

根據(jù)免疫組織化學染色顯示，11例對照組腎小球的足細胞、內(nèi)皮細胞和系膜細胞有少量TRPC6表達（圖1），在腎小管上皮細胞和間質(zhì)血管壁上也有表達，其平均IOD/area為（0.048±0.026）；而PNS組的腎組織中表達分布相同，但其腎小球TRPC6蛋白的表達較對照組明顯升高（0.082±0.037），差異有統(tǒng)計學意義（t=2.66，P=0.013），而PNS各病理類型的差別不明顯。

圖1 TRPC6 免疫組織化學染色（×200）

2.3 腎組織TRPC6mRNA表達

qPCR結果顯示，18例PNS患兒腎組織中TRPC6 mRNA的相對表達量（Ct）為2.89（1.52～6.15），與11例對照組2.26（1.54～3.08）比較，差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.08，P=0.281）。

2.4 PNS患兒腎組織TRPC6mRNA表達與TRPC6蛋白及各臨床指標的相關性

18例PNS患兒腎組織中TRPC6 mRNA相對表達量與腎組織TRPC6蛋白表達呈顯著正相關（r=0.508，P=0.032），而與血清白蛋白（Alb）、肌酐（Cr）、三酰甘油（TG）、膽固醇（Tch）、補體C3、eGFR水平以及24 h尿蛋白定量之間的相關性不顯著（P＞0.05）。見表1。

3 討論

腎小球濾過膜由帶窗孔的毛細血管內(nèi)皮細胞、腎小球基底膜（Glomerular basement membrane，GBM）和腎小球上皮細胞足細胞三部分組成。SD是腎小球濾過屏障的最外層，阻擋絕大多數(shù)分子量較大的蛋白質(zhì)通過，足細胞是復雜結構的高度分化細胞，足細胞損傷和缺失被認為是導致腎小球硬化的啟動因素[4]，也是蛋白尿產(chǎn)生的原因，由于其代償功能有限，當損傷/缺失超過30%，就會產(chǎn)生持續(xù)性非選擇性蛋白尿、腎小球硬化和慢性腎臟疾病的進展[5,6]。在NS患兒的腎組織病理檢查中可以觀察到足細胞的結構異常，而這種結構異常在兒童PNS常見的病理類型MCD和FSGS中尤為典型。本研究中，18例患兒中有16例被發(fā)現(xiàn)為足細胞病變，其中MCD 12例，F(xiàn)SGS 4例，表現(xiàn)為電鏡下彌漫足突融合、缺失。

表1 腎組織TRPC6的表達量與常規(guī)指標的相關性分析

業(yè)已發(fā)現(xiàn)的 Nephrin（NPHS 1）、Podocin（NPHS2）、PLCE1（NPHS3）、TRPC6和CD2AP等6種SD相關蛋白分子與蛋白尿發(fā)生和激素耐藥都有著密切關系[7-10]，SD所導致的足突細胞結構和功能改變是NS發(fā)病機制研究的重要部分。人類TPRC定位于染色體11q21-q22，含有13個外顯子，其表達的TRPC6蛋白位于足細胞的胞體并臨近SD，為含有931個氨基酸的6次跨膜蛋白，其N端和C 端均在胞內(nèi)，由第5和第6跨膜結構域共同構成非選擇性陽離子通道，在Ca2+信號傳導通路中有著非常重要的作用[11]，而且TRPC6被整合到與Nephrin、podocin、α-輔肌動蛋白-4（α-actinin-4，ACTN4）等一些對足細胞功能關鍵的蛋白質(zhì)相互作用的信號復合物中[12]。Winn等[13]于2005年首次證實了TRPC6基因突變可導致大量蛋白尿，從而引起家族性局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）。同時，Reiser等[9]對71個家族性FSGS家系進行TRPC6基因突變篩查，發(fā)現(xiàn)5個單雜合突變，家族性FSGS中的TRPC6基因突變檢出率約為7%。除此之外，在一些繼發(fā)性腎小球疾病如糖尿病腎病中發(fā)現(xiàn)TRPC6表達也顯著增加[14]，說明TRPC6的異常表達在腎臟疾病中比較常見。

目前關于兒童PNS患者TRPC6在腎組織中表達的研究較少，且多為動物及細胞實驗。本研究發(fā)現(xiàn)，兒童PNS患者TRPC6在腎組織中的蛋白表達上調(diào)，而大部分患兒為足細胞病變，這說明TRPC6表達增加與足細胞形態(tài)改變及其SD結構破壞有著密切聯(lián)系，雖然其因果關系需進一步明確，但也可以說明TRPC6在蛋白尿以及腎小球節(jié)段硬化的形成過程中起到了一定的作用。由此推測，TRPC6表達增加導致細胞裂隙膜鈣內(nèi)流增加而使細胞內(nèi)鈣離子濃度增高形成鈣超載，改變了足細胞足突收縮結構，進而破壞了SD的結構，引起腎小球濾過率增加，同時鈣離子內(nèi)流增加還可以導致細胞凋亡、脫落，增殖減少[15]。也有研究發(fā)現(xiàn)，TRPC6高表達可通過增加足細胞胞內(nèi)Ca2+濃度以及RhoA酶的活化，引起足細胞骨架的重構、纖維狀肌動蛋白（F-actin）分布紊亂以及nephrin和synaptopodin表達下調(diào)，RhoA酶抑制后上述現(xiàn)象恢復正常[16]。本研究發(fā)現(xiàn)腎病綜合征的患兒存在TRPC6的高表達，本課題組在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)兒童腎病綜合征患者CD2AP的mRNA表達和蛋白表達下調(diào)[17]，既往我們也曾發(fā)現(xiàn)PNS兒童FSGS組ACTN4 mRNA表達明顯高于對照組[18]，說明TRPC6同其他SD蛋白一起在維持足細胞的功能及結構中有重要作用，而激活的TRPC6可能通過Ca2+介導細胞內(nèi)骨架蛋白的變化引起足細胞損傷。此外，本研究免疫組化實驗顯示，正常腎組織中TRPC6在腎小球的足細胞、內(nèi)皮細胞和系膜細胞有少量表達，在腎小管上皮細胞和間質(zhì)的血管壁上也有表達，但在兒童PNS患者腎組織中，TRPC6在腎小球中表達增加，證實兒童PNS的發(fā)病與TRPC6有關，但本組中4例FSGS患兒相對于其他病理類型（MCD）并沒有發(fā)現(xiàn)更加明顯的TRPC6表達升高，可能與實驗病例數(shù)還較少以及兒童腎組織病理特點有關，需要更大規(guī)模的實驗和多種方法測定人組織中TRPC6蛋白的變化。我們推測PNS患兒存在TRPC6表達上調(diào)，促使足細胞形態(tài)和數(shù)量改變，造成SD的穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)性下降，從而使SD的結構和功能異常，因此TRPC6參與了PNS大量蛋白尿的發(fā)病機制。

前文已經(jīng)提到TRPC6基因的突變可能導致蛋白尿的發(fā)生，本次實驗已發(fā)現(xiàn)兒童PNS患者TRPC6在腎組織中蛋白表達增加，但課題組在試驗中對本組18例患兒的TRPC6基因外顯子進行了檢測卻未發(fā)現(xiàn)突變，我們曾在前期研究中發(fā)現(xiàn)PNS患兒的CD2AP基因的啟動子有突變序列[19]，那么PNS患兒也可能存在基因調(diào)控水平上的異常導致了TRPC6表達增加，需要進一步研究明確。

腎病綜合征表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥（高膽固醇血癥）以及不同程度的水腫，臨床上相關的生化指標是疾病的起始、緩解、反復/復發(fā)的判斷依據(jù)，這些現(xiàn)象正是足細胞受損后所引起的人體內(nèi)的物質(zhì)變化，因此本研究中對TRPC6的表達量與臨床常用指標進行相關性分析，但并未發(fā)現(xiàn)包括24h尿蛋白定量在內(nèi)的臨床檢測指標與TRPC6的表達量相關，可能還需要更大規(guī)模和更進一步的實驗與統(tǒng)計分析。

兒童PNS根據(jù)激素治療的效果分為激素敏感和耐藥，激素發(fā)揮效應的具體機制未明，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)足細胞相關基因的突變導致了激素耐藥，本組中激素敏感14例，激素耐藥4例，而大部分病例類型仍為MCD，故激素耐藥型腎病和病理類型為FSGS的患兒足細胞SD蛋白的異常情況有待進一步研究。除此之外，腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活是公認的慢性腎臟疾病進展危險因素，血管緊張素Ⅱ（angiotensin，AngⅡ）可通過TRPC6在足細胞的高表達引起足細胞凋亡[20]，而TRPC6作為離子通道，其深入研究可以為臨床中關于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin converting enzymein-hibitors，ACEI）和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑（包括CsA和FK506等）的應用提供理論基礎。

綜上所述，TRPC6的發(fā)現(xiàn)豐富了對足細胞濾過屏障的認識，它通過觸發(fā)鈣離子內(nèi)流引起足細胞形態(tài)改變，因此SD并不是單純的分子濾過網(wǎng)，而是一個“多點調(diào)控”的“動態(tài)分子網(wǎng)”。TRPC6的異常表達可能是NS發(fā)病的重要因素，為進一步明確腎病綜合征及蛋白尿發(fā)生的機制及其防治開拓了新的領域。兒童PNS患者腎小球足細胞中TRPC6的表達升高，提示TRPC6高表達可能是兒童足細胞病變（MCD和FSGS）為主的原發(fā)性腎病綜合征的重要指標之一，而TRPC6檢測可能對足細胞病變的診斷有一定的幫助。

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（本文編輯： 梁 華）

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《臨床兒科雜志》編輯部

Expression of TRPC 6 in renal tissue and its signi fi cance in children with primary nephrotic syndrome

HAO Sheng,WU Ying, HE Weixun, KANG Yulin, HUANG Wenyan, ZHU Guanghua (Department of Nephrology and Rheumatology, Shanghai Children’s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200040, China)

ObjectiveTo explore the relationship between the expression of transient receptor potential cation channel subfamily C member 6 (TRPC6) and podocyte injury in children with primary nephrotic syndrome (PNS) and its clinical significance.MethodsThe renal tissue of 18 children with PNS was obtained. The pathological changes of kidney were observed by routine section staining and light microscopy. The structural changes of podocyte were observed by electron microscope. The mRNA and protein expressions of TRPC6 in tissues were determined by qPCR and immunohistochemistry,respectively. Further the correlation of TRPC6 mRNA with serum levels of albumin (Alb), creatinine (Cr), triacylglycerol (TG),cholesterol (Tch), complement C3 and 24 h urinary protein quantitation and estimated glomerular fltration rate (eGFR) were analyzed respectively.ResultsThe expression of TRPC6 protein in renal tissue of children with PNS was higher than that in the control group, and the difference was statistically different (P＜0.05). The relative expression of TRPC6 mRNA in renal tissue of children with PNS was positively related to the expression of TRPC6 protein (r=0.508,P＜0.05), but there was no correlation of expression of TRPC6 mRNA with serum levels of Alb, Cr, TG, Tch, C3, eGFR and 24h urinary protein quantitation (P＞0.05).ConclusionThe pathological types of PNS were mainly podocyte lesions, and the expression of TRPC6 protein was increased in podocytes. TRPC6 detection may be helpful in the diagnosis of podocyte lesions.

nephrotic syndrome; podocyte; child

2016-12-16）

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.07.006

上海市衛(wèi)生局級青年課題（No.2009Y048）；上海市衛(wèi)生局級課題（No.2009094）；上海 市兒童醫(yī)院優(yōu)秀青年培養(yǎng)計劃（2013）

朱光華 電子信箱：ghzhu301@aliyun.com