李海濤 齊天杰 李帥 張魯濤 王伯麗

·論著·

差異基因分析揭示多耐藥鮑曼不動桿菌生物被膜特性

李海濤 齊天杰 李帥 張魯濤 王伯麗

目的 探索多藥耐藥鮑曼不動桿菌生物被膜狀態(tài)獨特的基因表達(dá)。方法 選取多藥耐藥鮑曼不動桿菌菌株，在同一菌株兩種不同狀態(tài)下，處于快速生長期的浮游菌體和生物被膜固著生長的菌體，兩個樣本間進行mRNA的提取和全基因基因表達(dá)的分析比對，比較兩者間基因表達(dá)的差異。研究表達(dá)差異的基因在基因功能上的體現(xiàn)。結(jié)果 同一菌株兩種不同狀態(tài)下，處于快速生長期的浮游菌體和生物被膜固著生長的菌體，兩個樣本間進行全基因組基因表達(dá)的分析比對，兩者間基因表達(dá)存在差異。同株細(xì)菌的生物被膜狀態(tài)，是一種獨特的存在方式，具有自己獨特的生物行為和基因的表達(dá)。在兩個樣本對比中，發(fā)現(xiàn)有106個基因表達(dá)上調(diào)，92個基因表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 表達(dá)差異基因所編碼蛋白，大多參與了生物被膜形成和形態(tài)維持。細(xì)菌生物被膜形成和形態(tài)維持，是通過特殊的信號通路以及信號因子、轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)節(jié)的；在浮游細(xì)菌的狀態(tài)，它們不表達(dá)或者沒有顯著表達(dá)。

多藥耐藥鮑曼不動桿菌；基因分析；生物被膜;高通量測序

近期，多藥耐藥鮑曼不動桿菌已經(jīng)被列入六大最危險機會致病病原菌之一[1]。目前多重耐藥的鮑曼不動桿菌，對目前臨床所應(yīng)用的大多數(shù)抗生素均是耐藥的，治療困難，是目前臨床亟待解決的難題。多重耐藥的鮑曼不動桿菌，其耐藥基因在菌落間可以快速獲得和穩(wěn)定遺傳，增加了臨床治療難度。鮑曼不動桿菌可以快速對臨床應(yīng)用多種抗生素耐藥，是由于β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，外排泵，孔蛋白，甲基化酶等多種機制，其中還有個更重要的機制，是由于菌體生物被膜的產(chǎn)生[2,3]。鮑曼不動桿菌常常會采用固著的生活方式，不同于浮游細(xì)菌狀態(tài)；分泌多種胞外基質(zhì)，將菌落包裹其中，形成生物被膜[4]。在傳統(tǒng)意義上，人們常常認(rèn)為細(xì)菌的生物被膜就是一團細(xì)菌的組合和堆疊，菌落不可逆的黏附在醫(yī)療器械或者生物體的表面；然而，近期一些學(xué)者通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析以及轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜不單單只是細(xì)菌菌體簡單混合物。不同于浮游細(xì)菌狀態(tài)，生物被膜下的菌體具有自己獨特的生物行為和基因的表達(dá)[5]。存在于生物被膜內(nèi)的細(xì)菌，更加耐多種抗生素，耐干燥，耐各種環(huán)境壓力，甚至是紫外線的照射[2]。這就導(dǎo)致了，在生物被膜狀態(tài)下，細(xì)菌會持續(xù)存在于各種醫(yī)療器械和導(dǎo)管內(nèi)表面，難以清除；形成了持續(xù)穩(wěn)定釋放菌體的感染源[6]。鮑曼不動桿菌形成生物被膜的能力，已經(jīng)成為評估其致病力的主要因素之一[7]。細(xì)菌生物被膜所引起的相關(guān)感染過程包括，細(xì)菌的慢性定植、細(xì)菌生物被膜穩(wěn)固的黏附于生物和非生物(中心靜脈置管、導(dǎo)尿管、置入支架、人工瓣膜和隱形眼鏡等)的表面，引發(fā)慢性感染包括心內(nèi)膜炎、慢性骨髓炎，還會導(dǎo)致細(xì)菌長期定植于患者下呼吸道及肺組織[8]。細(xì)菌的生物被膜，可以幫助細(xì)菌適應(yīng)不利的外環(huán)境和躲避宿主的攻擊，使得細(xì)菌菌體可以在生物被膜的保護下持久的存在，形成穩(wěn)定釋放細(xì)菌的慢性感染源；因此就使得這些致病菌難以治療和徹底清除[9]。生物被膜實際上是菌體微生物的功能性的聚集體，形成有序的、動態(tài)穩(wěn)定的動態(tài)結(jié)構(gòu)。正是由于生物被膜的保護，鮑曼不動桿菌才能持續(xù)的存在于宿主的上皮細(xì)胞表面或其他無機物表面[10]。形成生物被膜，就像形成了病原菌的慢性感染源，細(xì)菌可以遷移感染至下呼吸道及肺組織，導(dǎo)致肺炎反復(fù)發(fā)生甚至導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病[11]。細(xì)菌生長在生物被膜內(nèi)，得到持久有效的保護，不會被抗菌藥物殺滅和清除，導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥能力和致病力的增加，使得多藥耐藥鮑曼不動桿菌成為致命性病原菌[12]。因此，探索多藥耐藥鮑曼不動桿菌生物被膜黏附、形成機制，是揭示其獨特致病性，揭示其導(dǎo)致慢性感染遷延不愈和反復(fù)發(fā)生的關(guān)鍵步驟。

1 資料與方法

1.1 細(xì)菌菌株的收集 所有多藥耐藥鮑曼不動桿菌菌株，篩選自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院臨床檢驗科細(xì)菌室，自2015至2016年，共篩選多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株608株。菌株入選標(biāo)準(zhǔn)為：(1)鑒定為鮑曼不動桿菌菌屬；(2)藥敏檢測對三類或三類以上抗生素同時耐藥。對篩選合格的菌株，采用重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)(REP-PCR)方法，進行DNA同源性分析，分析細(xì)菌亞型。分離尋找優(yōu)勢菌株，最后選取數(shù)量最多優(yōu)勢菌株多藥耐藥鮑曼不動桿菌Acinetobacter baumannii BJAB0868作為研究對象。

1.2 樣品的制備 選取多藥耐藥鮑曼不動桿菌Acinetobacter baumannii BJAB0868菌株，培養(yǎng)在MH肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫且持續(xù)搖晃的微量振蕩器上培養(yǎng)7～8 h。獲得快速生長期菌株(檢測OD600=0.4)。同一菌株，用無菌肉湯配制濃度為0.7 Mac的菌懸液制備生物被膜。在50 ml微發(fā)酵罐中，37℃恒溫培養(yǎng)96 h。另有一個空白微發(fā)酵罐，作為空白對照。96 h后，用PBS液清洗3次，無菌環(huán)境中常溫風(fēng)干，加入1%結(jié)晶紫2 ml，染色30 min。再用PBS清洗3次，無菌環(huán)境中常溫風(fēng)干，再加入2 ml 95%的乙醇，脫色15 min，用酶標(biāo)儀測定600 nm吸光度值。均值為空白對照的2倍以上者為生物膜形成陽性。然后電子顯微鏡鏡下觀察生物被膜生長情況。

1.3 菌體mRNA的提取和高通量測序 取自同一菌株兩種不同狀態(tài)下的樣品，處于快速生長期的浮游菌體和生物被膜固著生長的菌體，2個樣本間進行mRNA的全基因組的提取和分析比對，比較兩者間基因表達(dá)的差異。首先向提取上述兩個樣本的細(xì)菌的總RNA。使用RNAprotect Bacteria Reagent和RNeasy Mini Kit試劑盒。取懸浮菌液，離心，用溶菌酶消化菌體，再加入裂解液，反復(fù)收集、提純，剔除樣本中的DNA和蛋白質(zhì)。得到上述兩個樣本的細(xì)菌總RNA后，再進一步提純mRNA，進行mRNA的高通量測序分析，應(yīng)用life-tech Ribominus系列試劑盒提取。首先分離菌體總RNA，對提取的總RNA進行量和質(zhì)的檢測；其純度應(yīng)用NanoPhotometer?spectrophotometer檢測。提取樣本總RNA完整性的檢測和評估應(yīng)用RNA Nano 6000 Assay Kit of the Agilent Bioanalyzer 2100 system。之后，再將上述2個樣本進行mRNA的純化， mRNA的破碎；然后進行反轉(zhuǎn)錄、末端修復(fù)、PCR擴增。得到樣本的基因測序，與公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進行比較，通過基因的相似性進行功能注釋。

1.4 差異基因GO富集分析 GO(Gene Ontology)是基因功能國際標(biāo)準(zhǔn)分類體系。研究表達(dá)差異的基因在基因功能上的體現(xiàn)和表達(dá)。GO富集分析方法為GOseq，通過對基因長度的偏好性進行評估，更加準(zhǔn)確的計算GOterm中差異基因富集的概率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 兩個基因樣本間基因表達(dá)的差異性檢測，統(tǒng)計學(xué)分析fisher精確檢驗方法，差異表達(dá)基因定義為P<0.001，具有統(tǒng)計學(xué)意義。檢測樣本生物學(xué)重復(fù)、偏倚的篩選方法，采用DEseq進行差異分析，篩選閾值為qvalue<0.001且|Fold Change|>2。

2 結(jié)果

2.1 同一菌株不同狀態(tài)下mRNA表達(dá)差異 同一菌株兩種不同狀態(tài)下的樣本，處于快速生長期的浮游菌體和生物被膜固著生長的菌體，兩個樣本間進行mRNA的提取和分析比對，兩者間進行全基因組基因表達(dá)的兩兩對比，以P<0.001為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，我們發(fā)現(xiàn)，兩個樣本間基因表達(dá)確實存在差異。結(jié)果表明，同株細(xì)菌的生物被膜狀態(tài)，確實是一種獨特的存在方式，具有自己獨特的生物行為和基因的表達(dá)。在2個樣本對比中，我們發(fā)現(xiàn)有106個基因表達(dá)上調(diào)，92個基因表達(dá)下調(diào)。見表1～3。

表1 2組樣本間基因表達(dá)差異統(tǒng)計結(jié)果

2.2 表達(dá)差異基因GO富集分析 GO(Gene Ontology)富集分析，是基因功能國際標(biāo)準(zhǔn)分類體系。研究樣本中差異基因在功能上的體現(xiàn)。表達(dá)差異的基因主要編碼參與菌體生物被膜生成和形態(tài)維持的蛋白。見表4，圖1。

表2 浮游菌狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)的全基因組信息

3 討論

細(xì)菌生成的生物被膜，在過去被認(rèn)為是細(xì)菌將自身菌落包埋其中，進入自身分泌的多種細(xì)胞外基質(zhì)和復(fù)合物中，形成不可逆的黏附的一種動態(tài)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。近期蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，生物被膜狀態(tài)細(xì)菌有著自身獨特的基因表達(dá)。在生物被膜狀態(tài)下的菌株，無論是其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性，還是致病性等，都與浮游狀態(tài)細(xì)菌有著顯著的差異；尤其是對抗生素和宿主的免疫系統(tǒng)，具有更強的抵抗力。細(xì)菌生物被膜，為菌體提供持續(xù)的防護，造成了菌體獨特的致病性，以及耐藥性的增加和院內(nèi)慢性感染的反復(fù)發(fā)生。

表3 表達(dá)上調(diào)差異基因

細(xì)菌從浮游細(xì)菌菌狀態(tài)到生物被膜固著狀態(tài)，是一系列的復(fù)雜過程轉(zhuǎn)變。需要復(fù)雜的信號因子調(diào)控，包括形成足夠密度的菌落，適宜的營養(yǎng)物質(zhì)和外環(huán)境，適宜的陽離子濃度等等，當(dāng)然還包括復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。生物被膜形成從初始黏附表面，到逐漸成熟，需要復(fù)雜的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，協(xié)調(diào)各種基因時間順序表達(dá)，包括動態(tài)移動、黏附、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)等[13]。生物被膜形成，最重要的步驟中包括初始黏附和信號因子的調(diào)控。最初，細(xì)菌與生物或非生物表面之間，通過非特異性力相互黏附。之后，細(xì)菌與之黏附表面之間，菌落內(nèi)的菌體之間，黏附力逐漸增加，加之細(xì)胞外基質(zhì)大量分泌合成，使得黏附力逐漸增加，形成不可逆的黏附。此后，菌落間，菌體內(nèi)會分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，信號因子，維持生物被膜動態(tài)穩(wěn)定[14]。

表4 差異基因GO富集分析前30個散點圖

圖1 差異基因GO富集分析前30個散點圖

縱軸表示GO基因名稱，橫軸表示GO對應(yīng)的Rich factor，P-value的大小用點的顏色來表示，P-value越小則顏色越接近紅色

這些表達(dá)差異基因所編碼蛋白，都參與了生物被膜形成和形態(tài)維持。細(xì)菌生物被膜形成和形態(tài)維持，是通過特殊的信號通路以及信號因子、轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)節(jié)的；在浮游細(xì)菌的狀態(tài)，它們不表達(dá)或者沒有顯著表達(dá)。表達(dá)差異的基因中，包含多種酶類。在生物被膜生成階段，多種酶類被激活，氧化還原多種氨基酸及多肽類，激活三羧酸循環(huán)，參與了菌體生物被膜的生成和菌體間的信號交互作用，幫助菌體外膜蛋白表達(dá)增加，增加生物被膜與表面的黏附。

我們發(fā)現(xiàn)，Csu基因簇在生物被膜狀態(tài)過塑表達(dá)，也是生物被膜形成必要條件之一。Csu基因簇介導(dǎo)菌毛過度表達(dá)，而菌毛會參與介導(dǎo)生物被膜的初始粘附，還會促使鮑曼不動桿菌粘附運動[15]。

外膜蛋白OmpA也在生物被膜狀態(tài)下過度表達(dá)。生物被膜狀態(tài)下的菌體，會大量分泌OmpA，參與生物被膜的生成。OmpA可以介導(dǎo)生物被膜的初始粘附，還可以與菌毛特異性結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)菌粘附于宿主上皮細(xì)胞。

在表達(dá)差異的基因中，還存在多種氨基酸代謝和運輸?shù)南嚓P(guān)基因。各種氨基酸的代謝和運輸，在生物被膜的形成和形態(tài)維持中，也發(fā)揮著重要的作用。生物被膜的生成依賴于氨基酸代謝的顯著升高。例如色氨酸的代謝和轉(zhuǎn)運在生物被膜成熟過程中，發(fā)揮重要作用[16]。氨基酸的代謝以及相關(guān)調(diào)控因子，在生物被膜形成和發(fā)展階段起到了至關(guān)重要的作用。

綜上所述，生物被膜生物被膜不單單只是細(xì)菌菌體簡單混合物，它具有自己獨特的生物行為和基因的表達(dá)；并且為細(xì)菌菌體提供持續(xù)的保護。GO基因功能研究揭示了生物被膜狀態(tài)下獨特的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)，我們將會進一步研究，期待能夠在此基礎(chǔ)上找到抑制生物被膜形成的新方向。

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The unique characteristics of multidrug resistant Acinetobacter baumannii biofilm revealed by difference gene analysis

LIHaitao,QITianjie,LIShuai,etal.

DepartmentofRespiratoryDiseases,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Hebei,Shijiazhuang050000,China

Objective To investigate the unique gene expression of multidrug resistnat Acinetobacter baumannii biofilm,and to expore its acton mechanism.Methods The multidrug resistant Acinetobacter baumannii strains were selected, and the cells were grown in two different status including floatings thallus at rapid growth phase and thw thallus that growed on biofilm. The two samples were used to extract mRNA and analyze the whole gene expression,and to compare the differences of gene expression.Finally the materialization of expression difference gene in gene function was analyzed.Results In the two different states of the same strain,the two genes which growed at rapid growth phase on biofilm were all extracted and analyzed.The expression of the two genes was different.The biofilm status was indeed a unique way of existence,with its own unique biological behavior and gene expression.In comparison between the two samples,that the expressions of 106 genes were up-regulated,however, the expressions of the other 92 genes were down-regulated.Conclusion The proteins encoded by expression differences genes are involved in biofilm formation and morphous maintenance,which are regulated by specific signaling pathways,signaling factors and transcription factor.In floatings bacteria status,they were not expressed or were not obviously expressed.

multidrug resistance Acinetobacter baumannii; genetic analysis; biofilm; high-flux sequencing

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.16.003

項目來源：河北省衛(wèi)生廳青年科技課題(編號：20130503)

050000 石家莊市,河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸一科

齊天杰，050000 石家莊市,河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸一科；

E-mail:qitianjie2008@sina.com

R 378

A

1002-7386(2017)16-2414-06

2017-05-16)