王海竹，曲紅云，周婷婷，徐啟江

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茄萼花色苷合成相關(guān)基因和克隆及表達(dá)分析

王海竹1，曲紅云2，周婷婷1，徐啟江1

（1東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150040）

【目的】花色苷是一類通過類黃酮途徑合成的水溶性次生代謝產(chǎn)物，既能使植物的不同器官呈現(xiàn)紅、紫、藍(lán)等顏色，還有利于人體健康。紫茄富含花色苷，但是有關(guān)茄萼花色苷生物合成的分子機(jī)制還不是很清楚。本研究旨在通過克隆茄萼花色苷合成相關(guān)基因和，測(cè)定其在不同發(fā)育時(shí)期不同顏色茄萼中的表達(dá)量，探究和在茄萼花色苷合成中的作用?！痉椒ā窟x用綠萼和紫萼長(zhǎng)茄（L.）果萼為試材，測(cè)定不同pH條件下茄萼花色苷含量；通過RACE方法分離克隆和cDNA全長(zhǎng)序列，分析和的保守結(jié)構(gòu)域及序列特征；分別對(duì)DFR和MYB及其同源蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹來進(jìn)一步分析鑒定基因；使用ExPASy網(wǎng)站提供的在線分析軟件SOPMA預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)目的基因在不同發(fā)育階段果萼中的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】從綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼中克隆了和片段，分別命名為、和、，GenBank登錄號(hào)分別為：KX224250、KX224251和KX224253、KX224254。和全長(zhǎng)分別為1 285 bp和1 249 bp，開放閱讀框?yàn)?58 bp和864 bp，分別編碼285個(gè)和287個(gè)氨基酸；和全長(zhǎng)分別為969 bp和959 bp，開放閱讀框均為462 bp，編碼153個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明α-螺旋和無規(guī)則卷曲均為兩個(gè)DFR蛋白和兩個(gè)MYB蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。序列比對(duì)表明DFR蛋白具有NADPH結(jié)構(gòu)域（NADPH binding domain）和底物特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Substrate specific binding domain），屬于NADB-Rossmann超基因家族；MYB蛋白屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，具有R2、R3兩個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域和bHLH結(jié)合域。和與和具有相對(duì)較高的同源性；和與同源性較高?；ㄉ蘸繙y(cè)定顯示，紫萼果茄萼花色苷含量較高且隨著果實(shí)的發(fā)育成熟而逐漸增加；而綠萼茄萼幾乎檢測(cè)不到花色苷。熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，和在紫萼長(zhǎng)茄果萼中表達(dá)量均遠(yuǎn)高于綠萼長(zhǎng)茄；從初蕾期到盛花期，紫萼長(zhǎng)茄果萼中和表達(dá)量逐漸升高，而綠萼長(zhǎng)茄則幾乎沒有變化，與兩個(gè)品種茄萼顏色變化相一致。【結(jié)論】和屬于NADB-Rossmann超基因家族，和為典型R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，和在紫萼長(zhǎng)茄果萼中表達(dá)明顯高于綠萼長(zhǎng)茄。推測(cè)和在茄萼呈色中發(fā)揮作用，并且參與花色苷生物合成。

萼片；花色苷；；；基因表達(dá)；茄

0 引言

【研究意義】茄（）為茄科（）茄屬（）一年生草本植物，是在世界范圍內(nèi)廣泛種植的一種重要茄果類蔬菜作物[1]。紫茄富含花色苷，其濃度分別約為葡萄和洋蔥的2.34和7.08倍[2]。花色苷是一種天然水溶性類黃酮物質(zhì)，存在于植物的葉、花和果實(shí)中，不僅使各種蔬菜、花卉和果實(shí)呈現(xiàn)紅色、紫色和藍(lán)色，而且具有一定營(yíng)養(yǎng)和藥理作用，如清除自由基、預(yù)防心血管疾病、神經(jīng)疾病、癌癥、糖尿病、炎癥等[3-4]。目前，對(duì)茄萼花色苷合成的分子調(diào)控機(jī)理知之甚少。因此，深入開展茄萼花色苷合成關(guān)鍵基因的研究有助于揭示茄萼與果皮花色苷合成分子調(diào)控機(jī)理的異同，為茄品質(zhì)育種提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】植物花瓣、組織和果實(shí)等顏色主要由植物次生代謝產(chǎn)物花色苷決定，屬于類黃酮物質(zhì)?；ㄉ招枰幌盗忻附?jīng)過3個(gè)階段合成，目前已對(duì)如矮牽牛[5]（）、玉米[6]（）及金魚草[7]（）等花色苷生物合成途徑有了較深入的研究。二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）是花色苷多酶合成途徑中最終形成色素的關(guān)鍵酶，在花色苷生物合成途徑的下游發(fā)揮重要作用，屬于NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）依賴的短鏈還原酶家族[8]，能夠催化二氫黃酮醇類物質(zhì)，如二氫堪非醇（dihydrokaempferol，DHK）、二氫榭皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM），在C4位發(fā)生立體特異的還原反應(yīng)，分別生成無色花葵素、無色花青素和無色翠雀素[9]。不同物種的DFR具有較高同源性，存在保守的NADPH結(jié)合域和底物特異性結(jié)合域，對(duì)底物的特異性結(jié)合通常是由第134位氨基酸殘基決定[8]。在高等植物中，多數(shù)花色苷生物合成往往受諸多轉(zhuǎn)錄因子在不同時(shí)空上的組合調(diào)控。如R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子和WD40蛋白等，三者形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體MYB-bHLH-WD40（MBW）而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[10-11]。作為一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，R2R3-MYB的上調(diào)能夠激活參與花色苷合成的某個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而使植物組織積累花色苷。該基因已從箭葉淫羊藿（）[12]、梨（）[13]和甜櫻桃（L.）[14]等物種中克隆，并對(duì)其功能進(jìn)行了解析。蘋果中調(diào)控花色苷合成途徑中所有結(jié)構(gòu)基因的協(xié)同表達(dá)[15]；‘紅陽(yáng)’獼猴桃中促進(jìn)花色苷積累[16]；過表達(dá)番茄編碼MYB的，上調(diào)、、和轉(zhuǎn)錄水平[17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】茄從果萼和果皮顏色上劃分，一般有紫色萼紫色果皮、綠色萼紫色果皮和綠色萼白色果皮3種，關(guān)于茄果皮花色苷合成分子機(jī)制已有較深入研究[18-19]。但是，有關(guān)紫萼花色苷合成的分子機(jī)制還不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼為試驗(yàn)材料，通過RACE方法克隆和，并對(duì)其編碼的產(chǎn)物進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析和在果萼生長(zhǎng)過程中的表達(dá)模式，為深入闡釋茄子果萼中花色苷生物合成的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014—2016年在東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

以采摘自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院園藝分院的綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼為試驗(yàn)材料，于2014年6月將上述兩種茄子分別分成初蕾期、盛蕾期、初花期和盛花期4個(gè)時(shí)期進(jìn)行取材（圖1），液氮冰凍，保存于-80℃冰箱。

1.2 茄萼花色苷含量測(cè)定

參考WrolstanD等[20]的方法，采用不同pH條件下分光光度計(jì)方法測(cè)定茄萼花色苷含量。利用公式TA=A×MW×5×100×V/?；A=[A510nm（pH 1.0）-A700nm（pH 1.0）]-[A510nm（pH 4.5）-A700nm（pH 4.5）]計(jì)算花色苷的含量，其中花色苷總含量由TA表示，V代表混合液的體積（mL），摩爾吸收率26900由?表示，標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量449.2由MW表示，花色苷的總含量單位為mg/100 g。

1.3 RNA提取及基因全長(zhǎng)克隆

采用TRIzol Plant（全式金公司，北京）試劑盒提取總RNA，利用P19E（表1）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金公司，北京）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板，進(jìn)行特異性擴(kuò)增。

表1 綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼DFR和MYB基因克隆引物

利用cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）法克隆3′-cDNA序列，登陸NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）參照已發(fā)表的馬鈴薯和番茄等基因序列設(shè)計(jì)PCR上游引物3′RACE（表1），同時(shí)找到茄科植物與花色苷合成相關(guān)基因序列信息，根據(jù)番茄、矮牽牛、馬鈴薯、煙草和辣椒序列，在基因DNA結(jié)合域保守區(qū)設(shè)計(jì)PCR上游引物3′RACE（表1），上述引物設(shè)計(jì)均使用Primer Premier5.0，下游引物為P18E（表1）。PCR反應(yīng)體系為20 μL：10×TransTaq HiFi BufferⅡ2 μL，dNTP Mixture 2 μL（2.5 mmol·L-1），模板cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL（20 μmol L-1），TransTaq HiFi DNA聚合酶0.2 μL（5 U μL-1），其余用蒸餾水補(bǔ)充。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；30個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s，56℃（）、55℃（）退火30 s，72℃延伸1 min）；最后72℃延伸7 min。目的條帶經(jīng)膠回收純化后，連接到pEASY-T5載體（全式金，北京）上，送至北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

根據(jù)所得的3′-cDNA序列，設(shè)計(jì)5′RACE特異性引物ou-5'RACE GSP1、ou-5'RACE GSP2、dong-5′RACE GSP1、dong-5′RACE GSP2和-5′RACE GSP1、-5′RACE GSP2、dong-5′RACE GSP2、dong- 5′RACE GSP2（表1），用于巢式PCR。利用5′RACE GSP1和錨定引物Anchor（表1）以加dA尾的cDNA為模板進(jìn)行5′-RACE擴(kuò)增。為保證克隆片段的特異性，再用引物5′RACE GSP2和接頭引物Adaptor（表1）進(jìn)行第二次5′-RACE擴(kuò)增，克隆5′-cDNA序列，PCR反應(yīng)體系、產(chǎn)物的回收純化、克隆、測(cè)序同3′-RACE。

1.4 綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼、生物信息學(xué)分析

用ORF Finder在線工具（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf. html）查找基因開放閱讀框（ORF）并推導(dǎo)其氨基酸序列；利用BLAST（http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)克隆的目的序列進(jìn)行同源分析；利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)，采用MEGA6.0軟件中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；使用ExPASy網(wǎng)站提供的在線分析軟件SOPMA預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼、實(shí)時(shí)熒光定量分析

分別提取綠萼長(zhǎng)茄和紫萼長(zhǎng)茄果萼4個(gè)時(shí)期的總RNA，用PrimeScript?RT reagent Kit Perfect Real Time（寶生物，大連）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA備用。用7500 fast型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和Power SYBR?Green PCR Master Mix試劑盒以上述cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，所用引物如表1。20 μL反應(yīng)體系：8.4 μL稀釋的cDNA模板（10 μg cDNA加200 μL水稀釋），上、下游引物各0.8 μL（10 μmol L-1），Power SYBR?Green PCR Master Mix（2×）10 μL。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性2 min；40個(gè)循環(huán)（95℃ 10 s，60℃ 45 s）。以表達(dá)水平為內(nèi)參，引物為-F：CACTTAGCACCTTCCAGCAGATGT和-R：CTACAACAGCAGACCTGAGTTCACT。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用2–ΔΔCT法分析目的基因表達(dá)水平。

表2 綠萼和紫萼長(zhǎng)茄萼片DFR和MYB基因表達(dá)分析引物

2 結(jié)果

2.1 果萼中花色苷含量分析

綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼的4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期見圖1，花色苷含量的測(cè)定結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，綠萼長(zhǎng)茄果萼花色苷含量基本保持不變；而紫萼長(zhǎng)茄隨生長(zhǎng)時(shí)期的推移而呈現(xiàn)花色苷含量增加的趨勢(shì)，該變化趨勢(shì)與茄萼顏色逐漸加深成正相關(guān)趨勢(shì)，且在盛花期，花色苷積累更為明顯，并且在該時(shí)期紫萼長(zhǎng)茄果萼花色苷含量約是綠萼長(zhǎng)茄的5倍。

圖1 不同發(fā)育階段的綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼

圖2 綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼花色苷含量變化

2.2和的全長(zhǎng)cDNA克隆及序列分析

克隆得到綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼（GenBank登錄號(hào)為KX224250）和（GenBank登錄號(hào)為KX224251）的cDNA全長(zhǎng)序列。全長(zhǎng)1 285 bp，開放閱讀框長(zhǎng)858 bp，編碼285個(gè)氨基酸；全長(zhǎng)1 249 bp，開放閱讀框長(zhǎng)864 bp，編碼287個(gè)氨基酸。SOPMA預(yù)測(cè)的DFR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖3-A、B）表明，和編碼的285和287個(gè)氨基酸殘基中，α螺旋分別占31.23%和32.06%、β轉(zhuǎn)角分別占11.93%和11.15%、無規(guī)則卷曲分別占35.79%和36.59%、延伸鏈分別占21.05%和20.21%。ouSmDFR和dongSmDFR氨基酸序列比對(duì)（圖4）發(fā)現(xiàn)，與dongSmDFR氨基酸序列相比，ouSmDFR在C末端缺少兩個(gè)氨基酸，并且在第229位氨基酸位點(diǎn)存在差異，但由于這些差異位點(diǎn)不在功能域內(nèi)，因而推測(cè)不會(huì)影響二氫黃酮醇4-還原酶的功能。

a：α螺旋；b：延伸鏈；c：β轉(zhuǎn)角；d：無規(guī)則卷曲

多重氨基酸序列比對(duì)結(jié)果（圖4）表明，和基因編碼的氨基酸序列一致性高達(dá)98%，此外還發(fā)現(xiàn)ouSmDFR和dongSmDFR蛋白是NADPH依賴型的還原酶，屬于NADB-Rossmann超基因家族（NADB-Rossmann superfamily），該基因家族具有兩個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域，分別為NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)域和底物特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能將黃烷酮醇還原為無色花色素。

利用Mega6.0通過鄰位相連法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。結(jié)果表明，綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼DFR蛋白與其他的茄科作物，如矮牽牛（×）、馬鈴薯（）和煙草（）親緣關(guān)系較近，且與StDFR序列相似性達(dá)73%左右，其次是與旋花科和龍膽科植物。綠萼長(zhǎng)茄和紫萼與StDFR和GtDFR等DFR蛋白聚為一枝。

2.3和的全長(zhǎng)cDNA克隆及序列分析

綠萼長(zhǎng)茄（GenBank登錄號(hào)為KX224253）和紫萼長(zhǎng)茄（GenBank 登錄號(hào)為KX224254）基因cDNA全長(zhǎng)分別為969 bp和959 bp，開放閱讀框長(zhǎng)均為462 bp，編碼153個(gè)氨基酸。SOPMA預(yù)測(cè)的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖6-A、B）表明，和編碼的153個(gè)氨基酸殘基中，α螺旋均占39.22%、β轉(zhuǎn)角均占9.80%、無規(guī)則卷曲均占41.83%、延伸鏈均占9.15%，形成螺旋-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)。

方框處分別表示NADPH結(jié)合位點(diǎn)和底物特異性結(jié)合位點(diǎn)

多重氨基酸序列比對(duì)結(jié)果（圖7）表明，和基因所編碼的氨基酸序列具有兩個(gè)不完全重復(fù)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別為R2結(jié)構(gòu)域和R3結(jié)構(gòu)域，屬于典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。由于MYB轉(zhuǎn)錄因子往往與bHLH蛋白形成復(fù)合物發(fā)揮作用，因此在R3結(jié)構(gòu)域內(nèi)還存在一個(gè)bHLH結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

依據(jù)與DFR蛋白相同的方法構(gòu)建MYB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8），結(jié)果表明，綠萼長(zhǎng)茄和紫萼長(zhǎng)茄與箭葉淫羊藿（）進(jìn)化關(guān)系最近，與葡萄（）、草莓（x）、玉米（）和馬鈴薯（）等親緣關(guān)系也相對(duì)較近，與擬南芥進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。此外，ouSmMYB和dongSmMYB與AtMYB1和MdMYB10a等11個(gè)MYB蛋白聚為一枝，而AtPAP1和AtPAP2這兩個(gè)蛋白聚為另一枝。

基因登錄號(hào)分別是：AtDFR，NP_199094.1；StDFR，AAQ54578.1；NtDFR，ABN80437.1；PhDFR，AAF60298.1；SsDFR，ABP57077；IbDFR，BAA34637.1；GtDFR，BAA12736；LeDFR，BAF49318；PoDFR，ABF21084.1；SaDFR，ABQ97018；HaDFR，ABU93477；VmDFR，AF483835；DcDFR，AAD56578；HvDFR，AAB20555.1；CaDFR，NP_001311706.1；AhDFR，AID59206.1；RcDFR，BAH24302；PcDFR，AKV89243.1；OsDFR，AAD24584.3；SlDFR，NP_001234408.1；系統(tǒng)發(fā)育樹樹枝上面或下面的數(shù)字代表自舉值

a：α螺旋；b：延伸鏈；c：β轉(zhuǎn)角；d：不規(guī)則卷曲

直線方框處分別表示R2和R3保守結(jié)構(gòu)域，虛線方框處表示bHLH結(jié)合結(jié)構(gòu)域

基因登錄號(hào)分別是：VvMYBA1，BAD18977.1；VvMYBA2，BAD18978.1；VvMYBA3，BAD18979.1；VvMYBPA1，CAJ90831.1；MdMYB10a，ABB84753.1；AtMYB1，AAG42001.1；AtPAP1，EFH52994.1；AtPAP2.，EFH66345.1；StMYB113，ALA13583.1；SlMYB1，AAQ55181.1；ZmMYBPL，AAA33482.1；FaMYB1，AAK84064.1；EsMYB1，AFH03053.1。系統(tǒng)發(fā)育樹樹枝上面或下面的數(shù)字代表自舉值

2.4和基因的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果（圖9）表明，在綠萼長(zhǎng)茄果萼中表達(dá)量最低，并且隨著生長(zhǎng)，該基因的相對(duì)表達(dá)量幾乎無變化；而在紫萼長(zhǎng)茄果萼中，從初蕾期到盛花期，相對(duì)表達(dá)量不斷增加，尤其是由初花期到盛花期生長(zhǎng)時(shí)，增幅最為明顯，并且在盛花期高峰度表達(dá)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在綠萼長(zhǎng)茄果萼中的表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量約是綠萼長(zhǎng)茄的10倍。

圖9 ouSmDFR、dongSmDFR相對(duì)表達(dá)量

實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果（圖10）表明，在綠萼長(zhǎng)茄果萼前三個(gè)時(shí)期表達(dá)量幾乎無變化，在第4個(gè)時(shí)期即盛花期出現(xiàn)小幅增加，但整體表達(dá)水平仍然較低；紫萼長(zhǎng)茄，隨著生長(zhǎng)，果萼中相對(duì)表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)，并且從初花期到盛花期生長(zhǎng)時(shí)，表達(dá)陡然增加，盛花期高峰度表達(dá)。此外，不論在哪個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，在果萼中表達(dá)量均為紫萼長(zhǎng)茄高于綠萼長(zhǎng)茄，盛花期最為明顯，盛花期在紫萼長(zhǎng)茄果萼中相對(duì)表達(dá)量大約是綠萼長(zhǎng)茄的8倍。

圖10 ouSmMYB、dongSmMYB相對(duì)表達(dá)量

3 討論

本研究克隆綠萼長(zhǎng)茄果萼和和紫萼長(zhǎng)茄果萼和，對(duì)和編碼氨基酸序列與其他植物DFR進(jìn)行多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)均具有NADPH的結(jié)合位點(diǎn)和底物特異性結(jié)合位點(diǎn)，且高度保守，屬于NADB超基因家族[17]。前人研究發(fā)現(xiàn)不同物種中DFR與底物結(jié)合區(qū)氨基酸序列的改變決定其底物的種類[22-23]。研究者在棉花（）[24]、玫瑰（）[25]和葡萄風(fēng)信子（）[26]等物種中克隆到同樣具有上述兩種結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析表明，ouSmDFR和dongSmDFR與StDFR（）和SlDFR（）具有相對(duì)較高的同源性。

MYB蛋白序列分析和進(jìn)化分析表明ouSmMYB和dongSmMYB轉(zhuǎn)錄因子與其他植物中花色苷途徑相關(guān)的MYB蛋白的氨基酸序列具有較高的同源性，在其N端具有2個(gè)DNA結(jié)合域，分別為R2結(jié)合域和R3結(jié)合域，屬于典型R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子，還存在一個(gè)bHLH結(jié)合結(jié)構(gòu)域[27-28]，為形成MBW復(fù)合物提供bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)[29-30]。其結(jié)構(gòu)特征與月季（）[31]和大豆（）[32]等其他植物的具有相同性。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，和與（）具有相對(duì)較高的同源性，推測(cè)在花色苷生物合成過程中具有相同的功能，還需通過生物工程試驗(yàn)深入鑒定和的生物學(xué)功能。

和表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，4個(gè)時(shí)期中和在兩種茄子的果萼中都有表達(dá)，且紫萼長(zhǎng)茄高于綠萼長(zhǎng)茄。相對(duì)表達(dá)量與呈正相關(guān)的關(guān)系，由于MYB轉(zhuǎn)錄因子往往是通過調(diào)控結(jié)構(gòu)基因表達(dá)而影響花色苷合成，所以筆者推測(cè)MYB可能與存在相互作用，上調(diào)紫萼長(zhǎng)茄果萼中表達(dá)，使其果萼呈現(xiàn)紫色。但是盛花期出現(xiàn)小幅增加，推測(cè)可能該基因可能還參與其他物質(zhì)的合成途徑。此外，參與花色苷生物合成途徑的基因分前期基因和后期基因，前期基因包括PAL（苯丙氨酸裂解酶）、CHI（查爾酮異構(gòu)酶）、CHS（查耳酮合酶）和F3H（黃烷酮3-羥化酶）等相關(guān)基因，后期基因除了DFR還包括ANS /LDOX（花色苷合成酶/無色花色苷雙加氧酶）和UFGT（類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶）等相關(guān)基因，兩種茄子果萼顏色差異是否僅僅源于MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)表達(dá)的調(diào)控仍需要進(jìn)一步研究。‘馬克斯’紅洋梨的出現(xiàn)時(shí)因?yàn)镻yMYB10正調(diào)控的表達(dá)[33]；蘋果MdMYB3參與調(diào)控蘋果花色苷合成[34]；葡萄漿果中VvMYBPA1調(diào)控表達(dá)，VvMYBA2促進(jìn)表達(dá)，進(jìn)而影響葡萄花色苷積累[35-36]；蕪菁（L.）中發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)花色苷積累[37]。所以后續(xù)將克隆參與綠萼長(zhǎng)茄和紫萼長(zhǎng)茄果萼花色苷合成途徑中所有結(jié)構(gòu)基因，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行分析，選取與表達(dá)趨勢(shì)一致的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行酵母單雜交試驗(yàn)，確定MYB轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控哪個(gè)或是哪幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因來影響果萼中花色苷積累，為闡釋綠萼長(zhǎng)茄和紫萼長(zhǎng)茄果萼顏色差異的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，茄果皮花色苷的合成除受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控外，一定程度上還受光信號(hào)的影響，‘藍(lán)山’茄果皮為紫色，而套袋處理后其果皮呈白色，但是，果萼顏色仍為紫色[19]，推測(cè)存在不同的調(diào)控機(jī)制分別調(diào)控茄果萼和果皮花色苷的生物合成，通過比較二者機(jī)制異同，完全理解花色苷合成和調(diào)節(jié)的因子以及相關(guān)酶類相互作用，為提高茄中花色苷含量、選育優(yōu)質(zhì)茄品種提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

成功克隆綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼R和的cDNA序列，其中和編碼的氨基酸序列屬于NADB超基因家族，而ouSmMYB和dongSmMYB則具有R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子的典型特征，其N端具有R2、R3兩個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域，C端高度特異。進(jìn)化分析表明，ouSmDFR和dongSmDFR與馬鈴薯的DFR同源性較高；ouSmMYB和dongSmMYB與箭葉淫羊藿的MYB同源性較高。R和的表達(dá)分析推測(cè)其可能在綠萼和紫萼長(zhǎng)茄果萼顏色差異形成中發(fā)揮作用。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Cloning and Expression Analysis of Anthocyanin Biosynthesis-associatedandGenes in Calyx of Eggplant (L.)

Wang HaiZhu1, Qu HongYun2, Zhou TingTing1, Xu QiJiang1

(1College of Life Science, Northeast Forestry University/State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040;2Horticultural Branch, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150040)

【Objective】Anthocyanins are the water-soluble secondary metabolites synthesized via the flavonoid pathway responsible for red, violet, and blue indifferent kinds of plant organs. These pigments are of benefit to human health. Eggplant is rich in anthocyanins. The molecular mechanism of anthocyanin biosynthesis in eggplant calyx is still unclear. The primary objectives of this experiment are to cloneandgenes in the eggplant, detect their expression at different developmental stages and in calyx with different colors, explore the role ofandin anthocyanin synthesis in calyx of eggplant. This work expanded our knowledge about the molecular mechanism of anthocyanin biosynthesis in eggplant peel and calyx. 【Method】Green calyx and purple calyx of eggplants were used as materials. The content of anthocyanins in the calyx was measured by spectrophotometry at different pH. cDNA sequence of theandwere isolated and cloned by using RACE techniques.Analyze theconserved domains and characteristics of DFR protein were analyzed. Phylogenetic analysis of homologous protein sequences of other plants and DFR was conducted, the phylogenetic tree was constructed to further analyze and identify genes. To predict its secondary structure, SPOMA was used on-line which provided by the ExPAsy website. The bioinformatics analysis of MYB was the same as DFR. Expression ofandgenes in calyx with different colors were investigated through quantitative real-time PCR.【Result】In this study, two full-length cDNA sequences ofwere successfully cloned and denoted asand(GenBank accession Nos KX224250 and KX224251).is 1 285 bp in cDNA length with an open reading frame of 858 bp corresponding to 285 amino acid residues.is 1 249 bp in cDNA length with an open reading frame of 864 bp, which encoding 287 amino acids. Two full-length cDNA sequences ofgene were cloned and denoted asand(GenBank accession Nos KX224253 and KX224254). The corresponding cDNAs are 969 bp and 959 bp in length and the deduced proteins contained 153 amino acids, respectively. Results of secondary structure analysis exhibited that α-Helix and random coil were primary secondary structural components of the two DFR genes and two MYB genes. Sequence analysis showed that ouSmDFR and dongSmDFR have a NADPH-binding domain and substrate specific binding domain. ouSmMYB and dongSmMYB belonged to the R2R3-MYB transcription factors, which have R2 and R3 conserved domains and a bHLH binding domain. Phylogenetic tree analysis indicated thatandhave a close relation withand,andhave the closest genetic relationship with. Results of total anthocyanins measurement showed that high contents of anthocyanins were detected in purple calyx and increased gradually, while no anthocyanins were detected in green calyx. The qRT-PCR analysis indicated that the expression ofandgenes in the purple calyx were much higher than that in the green calyx. Moreover, from early budding to full flowering,the expression ofandincreased gradually. However,andalmost had no change, which were consistented with the color variation of calyx.【Conclusion】andbelong to the NADB-Rossmann superfamily,andare typical R2R3-MYB transcription factors. The expression ofandin the purple calyx is significantly higher than that in the green calyx. Therefore, it is speculated that the DFR and MYB genes play a role in the color of eggplants’ calyx. Furthermore, DFR and MYB are involved in the process of anthocyanin biosynthesis.

calyx; anthocyanins;;; gene expression;L.

2017-01-09；接受日期：2017-03-21

國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金（J1210053）、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（DL12CA10，2572014EA03）、林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)新項(xiàng)目（2013A06，2013B010）、黑龍江省博士后科研啟動(dòng)金（LBH-Q14011）

王海竹，E-mail：18686870296@163.com。通信作者徐啟江，E-mail：qijiangxu@126.com