瞿印權(quán)，徐雯，沈露，何天友，施成坤，榮俊冬，陳禮光，鄭郁善*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建福州350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)藝術(shù)學(xué)院園林學(xué)院，福建福州350002; 3.福建省東山赤山國有防護林場，福建漳州363400)

花吊絲竹ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

瞿印權(quán)1，徐雯1，沈露1，何天友2，施成坤3，榮俊冬1，陳禮光1，鄭郁善1*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建福州350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)藝術(shù)學(xué)院園林學(xué)院，福建福州350002; 3.福建省東山赤山國有防護林場，福建漳州363400)

建立關(guān)于花吊絲竹的ISSR－PCR反應(yīng)體系，為花吊絲竹種質(zhì)資源鑒定提供理論基礎(chǔ)。采用單因素試驗法，對影響PCR擴增效果的Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度及模板DNA用量等5個PCR反應(yīng)體系主要成分以及退火溫度和循環(huán)次數(shù)進行分析，并利用建立的優(yōu)化反應(yīng)體系和擴增程序?qū)?00條候選引物進行篩選。結(jié)果表明，適合花吊絲竹的ISSR－PCR反應(yīng)體系為:20 μL的反應(yīng)液中含3.0 mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTPs、1.25 U Taq DNA聚合酶、0.6 μmol/L引物、10 ng模板DNA、2 μL 10×Buffer、8.55 μL ddH2O。擴增程序為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，52.7℃退火30 s，72℃延伸90 s，40個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。建立的花吊絲竹的ISSR－PCR反應(yīng)體系能夠擴增出清晰、多態(tài)性較高的條帶，且篩選出的16條引物具有高度多態(tài)性。表明該體系具有較高的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和適用性。

花吊絲竹;ISSR;反應(yīng)體系;優(yōu)化

花吊絲竹(Dendrocalamus minor var.amoenus)屬于竹亞科(Bambusoideae)牡竹屬(Dendrocalamus)的叢生竹，主要生長于我國廣東、廣西、貴州等地。因其桿有異色條紋，外形美觀，可作庭園觀賞竹，亦可劈篾編結(jié)竹席、籮筐等竹器［1］。叢生竹林在生物固碳領(lǐng)域也有巨大作用［2］，同等面積下的竹林較樹林可多釋放出35%的氧氣，具有很好的生態(tài)效益［3］。

ISSR(inter-simple sequence repeat)是在SSR序列的基礎(chǔ)上，加上1～4個核苷酸作為ISSR－PCR反應(yīng)的引物，從而使得DNA序列放大，表現(xiàn)出較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性［4］。SSR序列在高等生物的染色體內(nèi)廣泛存在，所以利用ISSR技術(shù)可以得到較多的分子標記，呈現(xiàn)出較高的多態(tài)性［5］。ISSR分子標記技術(shù)具有穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、多態(tài)性好、產(chǎn)物特異性強的特點［6］，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物的種質(zhì)收集、品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、標記輔助選擇等諸多領(lǐng)域［7-8］。本研究采用單因素試驗方法對花吊絲竹ISSR－PCR擴增反應(yīng)體系中的主要組成成分(Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA)的濃度或含量進行篩選優(yōu)化，建立花吊絲竹ISSRPCR反應(yīng)的最佳體系，為花吊絲竹地理種源的遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系的鑒定和指紋圖譜的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

2016年9月，于福建省漳州市東山赤山國有防護林場花吊絲竹地理種源試驗樣地采集幼嫩葉片，盡快轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存，以備DNA的提取。

1.2 主要試劑與儀器

所用Taq DNA聚合酶、dNTPs Mixture、Mg2+、RNA降解酶、DNA Ladder Marker、10×PCR Buffer、6×Loading Buffer均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;瓊脂糖、核酸染料均購自北京賽西盛公司。引物參考哥倫比亞大學(xué)公布的100條引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取與檢測采用博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒從花吊絲竹的葉片中提取DNA，用紫外分光光度計檢測其濃度、純度，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性及是否有降解現(xiàn)象。

1.3.2 原初擴增程序和反應(yīng)體系設(shè)定的原初擴增程序為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。原初擴增反應(yīng)體系(20 μL)含2.5 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、1 U Taq DNA聚合酶、0.6 μmol/L引物、50 ng模板DNA、2 μL 10×Buffer、9.8 μL ddH2O。原初擴增程序和反應(yīng)體系均參考李炎梅［9］的方法。

1.3.3 ISSR引物的初選經(jīng)過初步的引物篩選，引物UBC845能產(chǎn)生清晰度高、多態(tài)性好的條帶，故可以用于ISSR－PCR體系的篩選(圖1)。

圖1 ISSR部分引物初始篩選

1.3.4 ISSR－PCR擴增體系的優(yōu)化采用單因素試驗法，對影響PCR反應(yīng)的Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA用量5個組成因素進行優(yōu)化篩選(表1)并建立最優(yōu)反應(yīng)體系。

1.3.5 退火溫度和循環(huán)次數(shù)的篩選一般引物的退火溫度要求低于理論退火溫度5℃［10］，因此，設(shè)置退火溫度最低為50℃，最高為60℃。利用PCR儀自動對退火溫度生成12個梯度，循環(huán)次數(shù)分別設(shè)置為30、35、40次。在建立的最優(yōu)反應(yīng)體系中篩選出最佳退火溫度和最佳循環(huán)次數(shù)。

1.3.6 ISSR有效引物的篩選利用優(yōu)化的反應(yīng)體系及擴增程序，用提取出的花吊絲竹基因組DNA，分別與100條引物進行PCR擴增，篩選條帶清晰、豐富的引物。

1.3.7 ISSR－PCR擴增體系的檢測取9 μL的PCR產(chǎn)物與1.5 μL 6×Loading Buffer混勻，上樣到加有核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠中，電泳1 h，電壓設(shè)為5 V/cm。待電泳結(jié)束，用紫外凝膠成像分析儀觀察和拍照。

表1 擴增體系單因素篩選

2 結(jié)果與分析

2.1 Mg2+濃度對ISSR－PCR擴增的影響

由圖2可見，Mg2+濃度為1.0、1.5、2.0 mmol/L時，均無擴增條帶出現(xiàn)。當Mg2+濃度為2.5 mmol/L時，開始出現(xiàn)擴增條帶，但擴增出的條帶較少且模糊。Mg2+濃度為3.0～4.0 mmol/L時，擴增條帶數(shù)目基本一致，但Mg2+濃度在2.5 mmol/L時，高分子量區(qū)域的條帶更為清晰。因此，反應(yīng)液中Mg2+最佳濃度定為3.0 mmol/L。

圖2 不同濃度Mg2+對ISSR－PCR擴增的影響

2.2 dNTPs濃度對ISSR－PCR擴增的影響

由圖3可見，0.05 mmol/L的dNTPs擴增的條帶數(shù)量較少，且不夠清晰。0.10 mmol/L dNTPs擴增條帶數(shù)增多，但條帶較暗，且高分子量的擴增條帶較模糊。0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L dNTPs擴增結(jié)果相似，擴增條帶清晰，條帶明亮。與0.15 mmol/L相比，0.20～0.30 mmol/L dNTPs擴增的條帶在高分子量區(qū)域更加清晰。0.35 mmol/L dNTPs擴增的條帶在中等分子量區(qū)域較清晰、明亮，但低分子量的擴增條帶出現(xiàn)彌散、背景增強現(xiàn)象。同時也考慮到盡量降低試驗成本，在擴增效果好的濃度范圍內(nèi)，選擇用量較少的dNTPs濃度(0.20 mmol/L)。

圖3 不同濃度dNTPs對ISSR－PCR擴增的影響

2.3 Taq DNA聚合酶用量對ISSR－PCR擴增的影響

由圖4可見，當Taq DNA聚合酶用量為1.25 U時，高分子量條帶較清晰，且擴增出的條帶多態(tài)性好。1.25、1.50、1.75 U的Taq DNA聚合酶的擴增結(jié)果類似，條帶清晰、明亮。當Taq DNA聚合酶用量大于1.75 U時，高分子量條帶的擴增效率下降，條帶模糊。同時考慮到試驗成本，最后確定Taq DNA聚合酶最佳用量為1.25 U。

2.4 引物濃度對ISSR－PCR擴增的影響

由圖5可見，0.3 μmol/L的引物擴增的條帶數(shù)不夠清晰，且擴增出非特異性條帶。0.4、0.5、0.6 μmol/L的引物擴增結(jié)果類似，擴增條帶清晰、明亮，且0.6 μmol/L的引物擴增的條帶最為清晰。當引物濃度大于0.6 μmol/L時，中等分子量條帶依然清晰，但高分子量條帶的擴增效率下降，直至無擴增條帶，且在低分子量區(qū)域出現(xiàn)背景彌散現(xiàn)象。最后確定0.6 μmol/L的引物濃度為ISSR－PCR反應(yīng)體系的最佳濃度。

圖4 不同用量Taq DNA聚合酶對ISSR－PCR擴增的影響

圖5 不同濃度引物對ISSR－PCR擴增的影響

2.5 模板DNA用量對ISSR－PCR擴增的影響

一般情況下，模板DNA含量過低會導(dǎo)致無擴增產(chǎn)物，過高則會引起非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)或擴增條帶模糊［11］。少數(shù)情況下，模板DNA用量對ISSRPCR擴增影響不大［12］。由圖6可見，本試驗設(shè)計的7個梯度水平的DNA用量均能擴增出清晰、明亮的條帶且無明顯差異。考慮到DNA用量越少越好，因此本試驗選擇模板DNA用量為10 ng。

圖6 不同用量模板DNA對ISSR－PCR擴增的影響

2.6 擴增程序參數(shù)的篩選

利用建立的最優(yōu)擴增體系，對UBC845引物的退火溫度進行梯度篩選。由圖7可見，當退火溫度為50.0～52.7℃時，擴增結(jié)果相似，條帶清晰明亮且數(shù)量較多。當退火溫度大于52.7℃時，擴增條帶清晰度明顯降低，條帶數(shù)逐漸減少。當擴增結(jié)果相近時，為提高反應(yīng)的特異性，優(yōu)先選擇相對較高的退火溫度［13］。因此，選擇52.7℃作為反應(yīng)的最佳退火溫度，相比其理論退火溫度Tm值，下浮5～10℃，與沈潔等［14］的研究結(jié)果相一致。

循環(huán)次數(shù)對PCR反應(yīng)有重要的影響，循環(huán)次數(shù)太少會導(dǎo)致擴增產(chǎn)物少。循環(huán)次數(shù)太多又會產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物［15］。由圖8可見，當循環(huán)次數(shù)為40次時，擴增條帶最為清晰。所以選擇40次循環(huán)作為花吊絲竹ISSR－PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)次數(shù)。

圖7 退火溫度對ISSR－PCR擴增的影響

2.7 ISSR有效引物的篩選

由圖9可見，利用所建立的體系，對100條引物進行擴增，最終篩選出16條多態(tài)性較好的引物。絕大部分都能擴增出清晰、明亮的條帶，少部分引物不能擴增出條帶。說明本試驗所建立的花吊絲竹的最佳反應(yīng)體系穩(wěn)定，并具有重復(fù)性。

圖8 循環(huán)次數(shù)對ISSR－PCR擴增的影響

圖9 ISSR有效引物的篩選

3 結(jié)論與討論

分子標記技術(shù)是一種能快速將特定的DNA片段進行大量復(fù)制的技術(shù)。能在遺傳物質(zhì)本身DNA水平上檢測分析到遺傳變異［16］。ISSR分子標記技術(shù)試驗操作簡單、快速、高效，利用該技術(shù)能檢測出擴增產(chǎn)物較豐富的多態(tài)性位點［17］。ISSR分子標記技術(shù)在遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評價、指紋圖譜構(gòu)建等方面應(yīng)用廣泛。

本研究利用優(yōu)化的最佳反應(yīng)體系，從100條引物中篩選出16條清晰、明亮且擴增條帶數(shù)較多的引物。試驗結(jié)果說明，該反應(yīng)體系具有較高的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、標記位點清晰和擴增產(chǎn)物多樣性等優(yōu)點。

擴增體系中的Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA用量等因素對花吊絲竹ISSR－PCR反應(yīng)有關(guān)鍵性影響，每一種因素的變化都有可能導(dǎo)致結(jié)果不同，因此確定一個理想的最優(yōu)反應(yīng)體系對ISSR－PCR反應(yīng)是很重要的。本試驗發(fā)現(xiàn)，dNTPs濃度直接影響產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性［18］，dNTPs濃度過低會導(dǎo)致底物與引物的酶促反應(yīng)速度的下降，擴增條帶產(chǎn)率低、效果差，dNTPs濃度過高會使得Mg2+濃度降低，從而抑制Taq DNA聚合酶的活性，導(dǎo)致擴增條帶模糊。因此，當dNTPs、Mg2+濃度控制在一定比例內(nèi)，才能達到最好的試驗效果［19］。Taq DNA聚合酶用量過多會引起擴增條帶模糊，過低則會使得擴增產(chǎn)物減少［20］。引物的濃度過高時容易引起引物二聚體的形成，從而導(dǎo)致擴增條帶模糊或減少，還會產(chǎn)生新的非特異性位點;過低則會使PCR反應(yīng)提前結(jié)束，使擴增條帶減少甚至沒有條帶出現(xiàn)［15］，還會導(dǎo)致非特異性條帶的產(chǎn)生。Mg2+濃度會極大地影響Taq DNA聚合酶活性，Mg2+濃度過低，會使Taq DNA聚合酶的活性下降，從而使得擴增產(chǎn)物減少甚至沒有擴增產(chǎn)物［21］。一般情況下，DNA含量過高，會增加非特異性擴增或造成彌散型產(chǎn)物;而含量過低，與引物的結(jié)合概率就低，表現(xiàn)為無擴增產(chǎn)物或擴增結(jié)果不穩(wěn)定［22］，而本試驗發(fā)現(xiàn)，不同DNA含量的擴增結(jié)果無明顯差異。

擴增程序中的退火溫度過高，會使得PCR引物與模板結(jié)合差，出現(xiàn)電泳條帶減弱和條帶數(shù)減少現(xiàn)象。同一種引物在不同植物的ISSR－PCR擴增中的最佳理論退火溫度也不相同［10］，如引物845在本試驗花吊絲竹ISSR－PCR擴增反應(yīng)中的最佳退火溫度為52.7℃，而在苦瓜的ISSR－PCR擴增程序中的最佳退火溫度為52.0℃［23］。引物的退火溫度是有限度的，只能在引物理論退火溫度上下浮動5～10℃，提高退火溫度可以增加擴增產(chǎn)物的特異性，但當退火溫度升高到一定值時，擴增條帶便減弱、減少。

本試驗建立的關(guān)于花吊絲竹的優(yōu)化體系為: 20 μL的反應(yīng)液中含3.0 mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTPs、1.25 U Taq DNA聚合酶、0.6 μmol/L引物、10 ng模板DNA、2 μL 10×Buffer、8.55 μL ddH2O。退火溫度為52.7℃，循環(huán)次數(shù)為40次。研究結(jié)果為花吊絲竹不同地理種源的遺傳多樣性研究和親緣關(guān)系評價奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

［1］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，1996.

［2］Xiang T，Ying Y，Teng J，et al.Sympodial bamboo species differ in carbon bio-sequestration and stocks within phytoliths of leaf litters and living leaves［J］.Environmental Science and Pollution Research，2016，23(19):1-9.

［3］王娟.13種觀賞竹種引種馴化研究［J］.世界竹藤通訊，2016，14(5):4-7.

［4］何天友.短葶山麥冬的遺傳多樣性分析及ISSR指紋圖譜構(gòu)建［D］.福州:福建農(nóng)林大學(xué)，2011.

［5］McGregor C E，Lambert C A，Greyling M M，et al.A comparative assessment of DNA fingerprinting techniques (RAPD，ISSR，AFLP and SSR)in tetraploid potato(Solanum tuberosum L.)germplasm［J］.Euphytica，2000，113(2):135-144.

［6］Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprintingby simple sequence repeat(SSR)anchored polymerase chainreaction amplification［J］.Genomes，1994，20(2): 176-183.

［7］錢書，葛頌，洪德元.采用RAPD和ISSR標記探討中國疣粒野生稻的遺傳多樣性［J］.植物學(xué)報，2000，42 (7):741-750.

［8］趙謙，莊東紅，杜虹，等.ISSR在蝴蝶蘭親緣關(guān)系分析中的初步應(yīng)用［J］.汕頭大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007，22(4):66-70.

［9］李炎梅.竹亞科各屬命名種遺傳多樣性的ISSR分析及原理應(yīng)用研究［D］.福州:福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

［10］Zhan Z Y，Xu G B.Establishment and optimization of ISSR-PCR system for Liriodendron［J］.Journal of Central South University of Forestry and Technology，2010，30 (6):80-84.

［11］徐奭，張耀川，李樹成，等.銀杏ISSR－PCR擴增反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化［J］.生物技術(shù)通訊，2012，23(1): 80-85.

［12］吳鑫，雷天剛，何永睿，等.柑桔SRAP和ISSR分子標記技術(shù)體系的建立與優(yōu)化［J］.分子植物育種，2008，6(1):170-176.

［13］張楊，張朝賢，王金信，等.牛筋草ISSR－PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化［J］.植物保護，2012，38(3):90-94.

［14］沈潔，丁小余，丁鴿，等.鐵皮石斛居群差異的研究ⅡISSR指紋標記方法的建立與優(yōu)化［J］.中國中藥雜志，2006，31(4):291-294.

［15］廖麗，郭巧生.夏枯草ISSR分子標記技術(shù)的建立與體系優(yōu)化［J］.中草藥，2009(7):1131-1135.

［16］Bornet B，Branchard M.Nonanchored inter simple sequence repeat(ISSR)marker:Reproducible and specific tools for genome fingerprinting［J］.Plant Mol Biol，2001，19:209-215.

［17］Arnheim N，Erlich H.Polymerase chain reaction strategy［J］.Annual Review of Biochenistry，1992，61:131-156.

［18］錢志瑤，周道堂，黃秀平，等.黔產(chǎn)寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化［J］.生物技術(shù)通報，2015，26(7): 69-75.

［19］何海燕，沙偉，張艷馥.大豆ISSR－PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］.大豆科學(xué)，2010，29(3):510-513.

［20］劉興菊，湯新彩，梁海永，等.棗樹ISSR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2007，22(5):62-65.

［21］馮夏蓮，何承忠，張志毅，等.毛白楊I(lǐng)SSR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，28(3): 61-65.

［22］Hu Y P，Xie X L，Wang L，et al.Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction conditions for Rheum tanguticum［J］.Guihaia，2010，30(1):112-116.

［23］陳龍正，徐海，宋波，等.利用ISSR分子標記鑒定苦瓜雜交種純度［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，44(12): 1949-1953.

Establishment and Optimization of ISSR-PCR System for Dendrocalamus minor var.amoenus

QU Yinquan1，XU Wen1，SHEN Lu1，HE Tianyou2，SHI Chengkun3，RONG Jundong1，CHEN Liguang1，ZHENG Yushan1*
(1.College of Forestry，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China; 2.College of Art＆Landscape Architecture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China; 3.Fujian Chishan State-owned Forest Farm in Dongshan County，Zhangzhou 363400，China)

The purpose of this study was to establish optimized ISSR system for Dendrocalamus minor var.amoenus.The single factor design was applied for optimizing five factors in ISSR amplification system，such as Mg2+，dNTPs，Taq DNA polymerase，primer and template DNA concentration.The results showed that the optimal 20 μL ISSR-PCR reaction system for Dendrocalamus minor var.amoenus contained 3.0 mmol/L Mg2+，0.20 mmol/L dNTPs，1.25 U Taq DNA polymerase，0.6 μmol/L primer，10 ng DNA template，2 μL 10×Buffer，8.55 μL ddH2O.The amplification procedure was as follows: 94℃5 min;94℃45 s，52.7℃30 s，72℃90 s，40 cycles;72℃10 min，4℃for storage.Under this optimal ISSR amplification system，16 primers were screened with high polymorphism from 100 primers.The test showed that the system was stable，reliable and applicative.

Dendrocalamus minor var.amoenus;ISSR;reaction system;optimization

S795

A

1004－3268(2017)07－0086－06

2016－12－20

福建省科技重大專項(2010N5002，2013NZ0001)

瞿印權(quán)(1992－)，男，江蘇南通人，在讀碩士研究生，研究方向:森林培育。E－mail:386142881@qq.com

*通訊作者:鄭郁善(1960－)，男，福建福州人，教授，博士，主要從事竹林培育研究。E－mail:zys1960@163.com