陳敬祥，程杰，林同

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東廣州510640)

松墨天牛ADP核糖基化因子1基因的序列及表達(dá)特性分析

陳敬祥，程杰，林同*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東廣州510640)

為了探討Ras基因超家族中ADP核糖基化因子1基因(ARF1)在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中以及在溫度脅迫下的表達(dá)特性，以松墨天牛為研究對(duì)象，從已構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中篩選到松墨天牛ARF1基因，命名為MaARF1(GenBank:KY368168)，對(duì)其進(jìn)行序列分析以及不同蟲(chóng)態(tài)和不同溫度脅迫下的表達(dá)特性分析。結(jié)果顯示，MaARF1基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)為549 bp，編碼182個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋與β片層組成，其次是無(wú)規(guī)則卷曲和β轉(zhuǎn)角。通過(guò)DNAMAN軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MaARF1與赤擬谷盜ARF1蛋白氨基酸序列完全一致，二者同源性為100%，且存在1個(gè)十四?；稽c(diǎn)(G2)和5個(gè)保守域(G1box—G5box)。通過(guò)RT－qPCR分析表明，MaARF1的表達(dá)量與松墨天牛的完全變態(tài)發(fā)育相關(guān)，各蟲(chóng)態(tài)不間斷表達(dá)，幼蟲(chóng)期在2齡幼蟲(chóng)(L2)、5齡幼蟲(chóng)(L5)中表達(dá)量較高，蛹化期間(L5—P0)表達(dá)量表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，并在第2天蛹(P2)中達(dá)到最大值，羽化期間(P10—A0)表達(dá)量表現(xiàn)為下降趨勢(shì);MaARF1在不同溫度脅迫下均有表達(dá)，低溫與高溫都會(huì)導(dǎo)致表達(dá)量下調(diào)，溫度越高或越低，表達(dá)量下調(diào)越顯著。因此，MaARF1可能主要影響松墨天牛蛹化和羽化這2個(gè)變態(tài)發(fā)育關(guān)鍵點(diǎn)，從而影響整個(gè)變態(tài)發(fā)育歷程，同時(shí)其也可能參與了松墨天牛體內(nèi)依賴(lài)溫度的Ca2+信號(hào)途徑。

松墨天牛;ADP核糖基化因子1;溫度脅迫;變態(tài)發(fā)育;表達(dá)特性;RT－qPCR

ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factors，ARFs)為小分子三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)結(jié)合蛋白，屬于Ras蛋白超家族成員［1-2］。ARFs在生物體中廣泛表達(dá)，目前，細(xì)菌、酵母、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物等生物中的ARFs均已被鑒定［3］。在哺乳動(dòng)物中，有6種不同分子量的ARFs亞型(ARF1、ARF2、ARF3、ARF4、ARF5和ARF6)得到鑒定［4］。果蠅中有3種ARFs亞型(ARFⅠ、ARFⅡ和ARFⅢ)被鑒定［5］。不管是哺乳動(dòng)物還是果蠅，研究表明，ARFs在其生長(zhǎng)發(fā)育期以及各個(gè)組織中均有表達(dá)［6］。ARFs與ARF類(lèi)似蛋白除了在真核生物和原核生物中影響胞吐與內(nèi)吞作用途徑中的細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸外［7］，還在一些寄生性的原生動(dòng)物中起著重要作用，如ARF類(lèi)似物與利什曼蟲(chóng)(Leishmania)鞭毛完整性有關(guān)［8］。作為ARF基因家族成員之一的ARF1主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸，特別地，ARF1在逆向軸漿運(yùn)輸途徑中對(duì)囊泡形成至關(guān)重要［9］。其介導(dǎo)埃及伊蚊(Aedes aegypti)體內(nèi)與外殼蛋白Ⅰ(coat proteinⅠ，COPⅠ)囊泡運(yùn)輸相關(guān)的功能，如調(diào)控受體前往細(xì)胞膜的靶向作用、調(diào)控可溶性蛋白的分泌作用等［10］。對(duì)埃及伊蚊注射ARF1的dsRNA后，分析卵巢組織提取物發(fā)現(xiàn)，卵黃蛋白原積累變少［11］。ARF1蛋白還參與生物體內(nèi)線粒體的裂解和融合這一動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，此功能獨(dú)立于囊泡運(yùn)輸作用。在秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)、哺乳動(dòng)物、酵母細(xì)胞中，ARF1的缺失會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)線粒體形態(tài)及活性的異常［12］。而且，ARF1蛋白被證實(shí)是一種活化信號(hào)分子，能提高相應(yīng)酶的活性，如磷脂酶D、磷脂酰肌醇激酶［13］，ARF1也與依賴(lài)于溫度的Ca2+信號(hào)途徑相關(guān)［14］，表明ARF1蛋白不僅參與運(yùn)輸，而且充當(dāng)一種與溫度相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)換器。

松墨天牛(Monochamus alternatus)是林業(yè)上重要的蛀干害蟲(chóng)，在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，能危害以馬尾松為主的多種松科植物，幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)及其體內(nèi)攜帶的松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus)都會(huì)對(duì)松科植物造成危害，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致整株植物死亡［15-16］。為了探討ARF1在松墨天牛整個(gè)完全變態(tài)發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)特點(diǎn)以及溫度是否會(huì)影響其表達(dá)，從松墨天牛cDNA文庫(kù)［17］中篩選出ARF1基因序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，然后研究其在不同時(shí)空及溫度脅迫下的表達(dá)特性，為深入開(kāi)展昆蟲(chóng)ARF1基因研究以及解析溫度脅迫下該基因在昆蟲(chóng)體內(nèi)充當(dāng)?shù)墓δ芙巧峁┓肿有畔⒑蛥⒖肌?/p>

1 材料和方法

1.1 松墨天牛ARF1基因篩選及其編碼氨基酸序列分析

從已構(gòu)建好的松墨天牛cDNA文庫(kù)［17］中篩選出ARF1基因完整編碼序列，在NCBI網(wǎng)站上運(yùn)用Nucleotide Blast程序進(jìn)行鑒定。

用NCBI在線工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)搜索ARF1基因開(kāi)放閱讀框(ORF)，ProtScale程序分析其編碼蛋白的疏水性，SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)預(yù)測(cè)編碼蛋白的信號(hào)肽，NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/)預(yù)測(cè)編碼蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)，NetOGlyc 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)分析編碼蛋白的N－糖基化修飾位點(diǎn)，TMHMM 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)分析編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，SOPMA軟件(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測(cè)編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，SWISS－MODEL軟件(http://beta.swiss-model.expasy.org/)預(yù)測(cè)編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行同源建模。

1.2 ARF1蛋白氨基酸序列同源性比對(duì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中在線檢索不同物種ARF1蛋白氨基酸序列，下載后用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列同源性比對(duì)。

1.3 試驗(yàn)材料及其處理

松墨天牛幼蟲(chóng)采自廣州市從化區(qū)風(fēng)云嶺森林公園，在避光的人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)至蛹、成蟲(chóng)，飼養(yǎng)條件:溫度為(25±1.0)℃，相對(duì)濕度為75%±5%，對(duì)幼蟲(chóng)給予人工飼料［18］進(jìn)行飼養(yǎng)，為成蟲(chóng)提供新鮮的1、2年生馬尾松枝條。

蟲(chóng)態(tài)樣品處理:選取松墨天牛各蟲(chóng)齡蟲(chóng)體3頭進(jìn)行清洗、消毒、麻醉，用磷酸鹽緩沖液沖洗后，將樣品分別置于無(wú)菌去酶的EP管中，立即液氮冷凍，放入－80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。溫度脅迫后蟲(chóng)態(tài)樣品處理:各選取5齡幼蟲(chóng)3頭分別置于45、35、25、15、5、－5、－15℃下進(jìn)行處理，1 h后直接將其置于－80℃低溫保存。

1.4 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

用總RNA提取試劑盒(E.Z.N.ATMTotal RNA KitⅡ，OMEGA公司)提取上述松墨天牛樣本的總RNA，具體操作按該試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用1%瓊脂糖凝膠電泳與微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)分別檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，檢測(cè)合格后放入－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa公司)說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行單鏈cDNA的合成，將cDNA稀釋10倍后用作實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)的反應(yīng)模板，置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 qPCR分析

通過(guò)qPCR(SYBR Green法)檢測(cè)ARF1基因的表達(dá)量。ARF1基因擴(kuò)增的上游引物為5'－CTCATCTTCGCCAACAAACA－3'，下游引物為5'－GTGGCCTGGATGTACCAGTT－3';內(nèi)參基因β－actin擴(kuò)增的上游引物為5'－CTCTGCTATGTAGCCCTTGACTT－3'，下游引物為5'－GGAGTTGTAGGTGGTTTCGTG－3'。采用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM，TaKaRa公司)操作，反應(yīng)體系(20 μL):SYBR Premix 10 μL、ddH2O 7.2 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 2 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性5 min;95℃解鏈10 s，60℃退火、延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。在LightCycler 480熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR反應(yīng)，每個(gè)cDNA樣品做3個(gè)復(fù)孔，設(shè)置ddH2O為陰性對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后分別采集目標(biāo)基因(ARF1)和內(nèi)參基因(β－actin)的Ct平均值，使用2－ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。用SPSS 18.0軟件的單因素方差分析法(ANOVA)對(duì)qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 松墨天牛ARF1基因序列及其編碼氨基酸序列分析

從前期構(gòu)建的松墨天牛cDNA文庫(kù)中篩選出一個(gè)具有完整編碼序列(CDS)的基因，在NCBI網(wǎng)站上運(yùn)用Nucleotide Blast程序進(jìn)行不同物種間核苷酸序列比對(duì)后，將其鑒定為松墨天牛ARF1基因，命名為MaARF1(GenBank:KY368168)，其CDS長(zhǎng)度為549 bp，共編碼182個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為20.65 ku，pI為6.15，脂肪系數(shù)為95.93，不穩(wěn)定系數(shù)為21.52，預(yù)測(cè)其為穩(wěn)定蛋白。磷酸化修飾位點(diǎn)和N－糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)有4個(gè)，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)有3個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)有3個(gè)，N－糖基化修飾位點(diǎn)有1個(gè)(圖1)。用ProtScale程序進(jìn)行MaARF1蛋白的疏水性分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)氨基酸大部分為親水性，說(shuō)明此蛋白質(zhì)為親水蛋白;通過(guò)SignalP 4.1 Server軟件在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)無(wú)信號(hào)肽;運(yùn)用TMHMM 2.0 Server軟件在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，表明其為非跨膜蛋白。

圖1 MaARF1基因序列及其編碼的氨基酸序列

2.2 松墨天牛ARF1蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用SOPMA在線軟件對(duì)MaARF1蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、β片層、無(wú)規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角組成，分別占39.01%、28.02%、20.88%、12.09%，由此可以推測(cè)，MaARF1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件主要由α螺旋和β片層構(gòu)成。采用蛋白質(zhì)同源建模法，將MaARF1蛋白氨基酸序列提交SWISSMODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果同樣顯示，此蛋白質(zhì)主要由α螺旋與β片層組成。同時(shí)該蛋白質(zhì)包括3個(gè)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，即Switch 1、interswitch、Switch 2，且N端與C端各有1個(gè)α螺旋(圖2)。

2.3 松墨天牛ARF1蛋白的同源序列比對(duì)

分析表明，MaARF1與赤擬谷盜ARF1蛋白氨基酸序列完全一致，二者同源性最高，為100%;與同為鞘翅目的紅斑尼葬甲同源性也非常高，為99%;與鱗翅目、雙翅目、膜翅目、半翅目的其他9種昆蟲(chóng)同源性均在96%～98%;此外，與人的ARF1蛋白同源性也達(dá)到了96%。通過(guò)MaARF1與其他物種(包括11種昆蟲(chóng)和人)的序列比對(duì)(圖3)發(fā)現(xiàn)，MaARF1蛋白存在5個(gè)保守域:G1box(G24-LDAAGKT31)、G2box(T48)、G3box(D67VGG70)、G4box(N126KQD129)、G5box(C159AT161)。氨基酸序列第2位甘氨酸(G2)為十四酰基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)在各ARF中高度保守。

圖2 MaARF1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖3 MaARF1蛋白與其他物種ARF1蛋白氨基酸序列同源性比對(duì)

2.4 MaARF1基因的表達(dá)分析

從圖4可以看出，MaARF1在松墨天牛各蟲(chóng)態(tài)中不間斷廣泛表達(dá)。幼蟲(chóng)期，表達(dá)量在1齡幼蟲(chóng)(L1)中最低，為對(duì)照(5齡幼蟲(chóng))的0.36倍，在2齡幼蟲(chóng)(L2)中達(dá)到最大值，為對(duì)照的1.18倍;化蛹期間(L5—P0)表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，由5齡幼蟲(chóng)(L5)的1.00倍上升到過(guò)渡態(tài)蛹(P0)的1.75倍，并在第2天蛹(P2)中達(dá)到最大值，為對(duì)照的4.29倍;羽化期間(P10—A0)表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，由第10天蛹(P10)的0.85倍迅速降低為過(guò)渡態(tài)成蟲(chóng)(A0)的 0.20倍，之后在第1天(A1)、第2天(A2)成蟲(chóng)中有所上升，分別為對(duì)照的0.30、0.32倍。

從圖5可以看出，MaARF1在不同溫度脅迫下均有表達(dá)。其在適宜生長(zhǎng)溫度(25℃)下表達(dá)量最大，在低于25℃的15、5、－5、－15℃脅迫下，表達(dá)量逐漸下降，分別為對(duì)照(25℃)的0.34、0.20、0.08、0.02倍，各脅迫溫度下表達(dá)量差異均達(dá)顯著水平。在高于25℃的35、45℃脅迫下，MaARF1表達(dá)量也呈下降趨勢(shì)，分別為對(duì)照(25℃)的0.06、0.05倍，兩者之間差異不顯著。

圖4 MaARF1基因在松墨天牛各蟲(chóng)態(tài)中的表達(dá)量

圖5 不同溫度脅迫下MaARF1基因的表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

與其他同屬于Ras蛋白超家族的成員不同，ARFs的N端存在1個(gè)兩性的α螺旋，這對(duì)于ARFs的生物學(xué)功能至關(guān)重要［19］。ARFs在生物進(jìn)化過(guò)程中處于高度保守狀態(tài)，如N末端的第2位甘氨酸被十四?；揎棧撔揎棽粌H與ARFs的細(xì)胞膜融合相關(guān)，而且還能起到調(diào)控核苷酸交換的作用［20］。ARF的高級(jí)結(jié)構(gòu)也是高度保守的，含有Switch 1、interswitch、Switch 2三個(gè)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，其中interswitch結(jié)構(gòu)由β2、β3片層連接組成［21］。它們構(gòu)象的變化與GTP和GDP結(jié)合相關(guān)，同時(shí)ARF的N端呈兩性，為構(gòu)象變化創(chuàng)造了條件。當(dāng)N端的兩性α螺旋發(fā)生延伸，interswitch結(jié)構(gòu)中會(huì)有2個(gè)氨基酸殘基也隨之遷移，從而能實(shí)現(xiàn)ARFs的非活性構(gòu)象(GDPARF復(fù)合體)轉(zhuǎn)換成活性構(gòu)象(GTP－ARF復(fù)合體)［22］。通過(guò)氨基酸同源比對(duì)及保守區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，除了上述N端兩性的α螺旋、十四?；揎椢稽c(diǎn)(G2)和3個(gè)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(Switch 1、interswitch、Switch 2)外，MaARF1還存在5個(gè)與GTP解離和結(jié)合的保守域［23］(G1box—G5box)，其中GTP結(jié)合相關(guān)位點(diǎn)中，G2box(T48)、G3box(D67VGG70)保守域被認(rèn)為是Mg2+結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)控GTP與Mg2+的結(jié)合; G4box(N126KQD129)、G5box(C159AT161)保守域與鳥(niǎo)嘌呤環(huán)的結(jié)合有關(guān)。GTP解離相關(guān)位點(diǎn)為G1box (G24LDAAGKT31)，在正常的Ras蛋白超家族成員中，該保守域的第3位甘氨酸對(duì)GTP解離起著決定性的作用，如果該位點(diǎn)的甘氨酸被其他氨基酸置換，會(huì)導(dǎo)致GTP的解離作用受到強(qiáng)烈抑制。但在ARF家族所有成員中，該位點(diǎn)上的氨基酸是天冬氨酸，GTP的解離作用受抑制，這也證實(shí)了ARFs蛋白沒(méi)有GTP酶活性［24］。MaARF1蛋白與12種不同物種ARF1蛋白的同源性高達(dá)96%～100%，另外，結(jié)合其具有保守的N端兩性α螺旋、十四?；揎椢稽c(diǎn)(G2)、3個(gè)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(Switch 1、interswitch、Switch 2)、5個(gè)與GTP解離和結(jié)合的保守域(G1box—G5box)，可以推測(cè)MaARF1屬于Ras蛋白超家族下的ARF家族成員。

ARF1作為ARF家族成員之一，其主要功能是調(diào)控生物體囊泡運(yùn)輸［9］，囊泡運(yùn)輸與ARF所處結(jié)合狀態(tài)有關(guān)，ARF存在2種結(jié)合狀態(tài):GDP－ARF復(fù)合體和GTP－ARF復(fù)合體［25］。GTP－ARF復(fù)合體會(huì)使ARF處于激活態(tài)，招募COPⅠ聚集在細(xì)胞膜表面，形成COPⅠ出芽小泡來(lái)運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)受體或者可溶性蛋白，隨后GTP水解成GDP，形成GDP－ARF復(fù)合體，使ARF處于鈍化狀態(tài)，最終導(dǎo)致COPⅠ小泡的分解，完成一次運(yùn)輸［10，26］。Isoe等［11］在研究埃及伊蚊體內(nèi)與吸血性相關(guān)的COPⅠ囊泡運(yùn)輸作用是否受ARF1和ARF4的調(diào)控中發(fā)現(xiàn)，給予埃及伊蚊糖分飼養(yǎng)，通過(guò)RNAi技術(shù)單獨(dú)注射ARF1或ARF4的dsRNA(1 000 ng)，并未導(dǎo)致蟲(chóng)體顯著死亡;但同時(shí)注射ARF1(500 ng)和ARF4(500 ng)時(shí)，蟲(chóng)體死亡速度加快，并且死亡率顯著升高;給予埃及伊蚊血液飼養(yǎng)，通過(guò)RNAi技術(shù)抑制COPⅠ基因的表達(dá)后蟲(chóng)體也會(huì)出現(xiàn)相似的死亡。這些結(jié)果表明，ARF1和ARF4兩者均與吸血性埃及伊蚊中腸組織中COPⅠ囊泡運(yùn)輸有關(guān)。COPⅠ囊泡運(yùn)輸直接取決于GTP的合成與水解速度，而與之相關(guān)的酶在合適溫度下才能最大程度地發(fā)揮其活性，所以囊泡運(yùn)輸?shù)目炻Q于溫度。通過(guò)對(duì)不同溫度脅迫下MaARF1表達(dá)分析可知，MaARF1在低于或者高于正常生長(zhǎng)溫度(25℃)時(shí)，隨溫度下降或升高，其表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。推測(cè)溫度的下降或升高直接影響GTP水解酶與合成酶的活性，從而影響囊泡運(yùn)輸，導(dǎo)致MaARF1的表達(dá)量降低。Leber等［27］研究表明，ARF1在Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)方面有潛在的激活作用。ARF1還與依賴(lài)溫度的Ca2+信號(hào)途徑相關(guān)，且隨著溫度升高，ARF1的表達(dá)量下降［14］。破壞酵母的ARF1可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)寒冷比較敏感的arf1突變體［28］。因此，推測(cè)MaARF1可能還參與松墨天牛體內(nèi)依賴(lài)溫度的Ca2+信號(hào)途徑。

ARF1蛋白廣泛存在于包括昆蟲(chóng)在內(nèi)的真核生物中［3］。Ackema等［12］研究ARF1蛋白與線粒體形態(tài)和功能的關(guān)系表明，其與生物體內(nèi)線粒體的裂解和融合這一動(dòng)態(tài)平衡相關(guān)，并且獨(dú)立于囊泡運(yùn)輸功能，ARF1的缺失會(huì)導(dǎo)致線粒體形態(tài)及活性的異常。MaARF1的表達(dá)模式研究結(jié)果顯示，該基因在松墨天牛幼蟲(chóng)期、蛹期和成蟲(chóng)中不間斷表達(dá)。幼蟲(chóng)期，MaARF1在5齡幼蟲(chóng)中的表達(dá)量較之前升高，分析其原因，5齡幼蟲(chóng)為松墨天牛末齡幼蟲(chóng)，而后蛻皮進(jìn)入蛹期，這一期間需要通過(guò)線粒體的裂解與融合動(dòng)態(tài)過(guò)程來(lái)提供大量能量，暗示MaARF1可能參與松墨天牛5齡幼蟲(chóng)體內(nèi)線粒體的裂解與融合。5齡幼蟲(chóng)蛻皮變成蛹，原來(lái)昆蟲(chóng)組織和器官被破壞，逐漸形成新的成蟲(chóng)的組織、器官［29］。因此，像線粒體之類(lèi)的組織和細(xì)胞器都會(huì)被破壞，各種參與蛹中組織、細(xì)胞器構(gòu)成的蛋白質(zhì)以及各種調(diào)節(jié)自身功能的激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、酶等都需要囊泡的運(yùn)輸功能，MaARF1可能調(diào)控了蛹期各種組織、器官形成所需的囊泡運(yùn)輸。MaARF1在第2天蛹中的表達(dá)量達(dá)到峰值，可能是此時(shí)進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，會(huì)有大量的突觸囊泡形成用于神經(jīng)遞質(zhì)傳遞［30］。在初羽化的成蟲(chóng)中其表達(dá)量迅速下降，而后稍有上升，推測(cè)MaARF1主要調(diào)控松墨天牛蛹期的囊泡運(yùn)輸。MaARF1在初蛹化的第1天蛹中表達(dá)量上升，在初羽化的成蟲(chóng)中表達(dá)量迅速下降，而后緩慢上升，這表明MaARF1可能主要影響松墨天牛蛹化和羽化這2個(gè)變態(tài)發(fā)育關(guān)鍵點(diǎn)，從而影響整個(gè)完全變態(tài)發(fā)育歷程。

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Sequence and Expression Analysis of ADP-ribosylation Factor 1 Gene from Monochamus alternatus

CHEN Jingxiang，CHENG Jie，LIN Tong*
(College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China)

To explore the expression characteristics of ADP-ribosylation factor 1 gene(ARF1)from Ras supergene family in the process of insect development and under temperature stress，ARF1 gene was filtrated from cDNA library of Monochamus alternatus，as the research object，and was named MaARF1 (GenBank:KY368168)，whose sequence and expressional characteristic in each insect state or under different temperature stress were analyzed in this study.The results showed that the coding sequence of MaARF1 was 549 bp in length，encoding 182 amino acids.The predicted secondary structure of MaARF1 was mainly composed of alpha helix and beta sheet，followed by random curl and beta turn.Amino acids sequence multiple alignment analysis of MaARF1 showed the highest homology with Tribolium castaneum (100%)and there were one myristoylation(G2)and five conservative domains(G1box—G5box).By RT-qPCR technology，gene expression analysis showed that MaARF1 expression level was associated with holometabolous development of M.alternatus and it was expressed in each insect state，continuously.The expression level was relatively higher in second and fifth instar larvae，showed a rising trend in larvalpupal stage，a downward trend during eclosion，and reached the maximum amount in the following day ofpupa.MaARF1 under different temperature stress was expressed，low temperature and high temperature would lead to lower expression level，when the temperature was higher or lower，falling of expression level was more significant.Therefore，MaARF1 may mainly affect two key metamorphosis point，nymphosis and eclosion，so as to affect the entire development process in M.alternatus，and it may also be involved in the Ca2+signaling pathways depending on the temperature.

Monochamus alternatus;ADP-ribosylation factor 1;temperature stress;metamorphosis;expression characteristics;RT-qPCR

S763.38

A

1004－3268(2017)07－0057－07

2017－01－01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470653);廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015A030313416)

陳敬祥(1993－)，男，湖北荊州人，在讀碩士研究生，研究方向:昆蟲(chóng)分子生物學(xué)。E－mail:2441430459@qq.com

*通訊作者:林同(1969－)，男，黑龍江通河人，教授，博士，主要從事昆蟲(chóng)分子生物學(xué)研究。E－mail:lintong@scau.edu.cn