祖億，趙茂臻，王鵬，王明霞，楊宗韞，謝鳳英，徐速

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

工藝優(yōu)化及化學(xué)組成分析

祖億，趙茂臻，王鵬，王明霞，楊宗韞，*謝鳳英，徐速

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

為了研究燕麥中多酚化合物的提取工藝及其化學(xué)組成，以超聲波處理為輔助手段，以多酚提取量為試驗指標，通過單因素試驗和正交試驗對提取溫度、提取時間、料液比和乙醇體積分數(shù)進行優(yōu)化，并利用高效液相-電噴霧質(zhì)譜法對所獲得的燕麥多酚化學(xué)組成進行分析。試驗結(jié)果表明，超聲輔助處理（超聲功率180 W，超聲時間20 min）燕麥多酚提取最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶11，提取時間4.5 h，提取溫度40℃；在此條件下，燕麥多酚提取量為183.12 mg/100 g。通過高效液相-電噴霧質(zhì)譜法檢測分析，確定燕麥中多酚化合物以結(jié)合態(tài)形式存在，主要為N-3',4'-二羥基肉桂酰-5-羥基鄰氨基苯甲酸、燕麥蒽酰胺及其衍生物、二烯酸與二十六烷-1-醇、26-羥基二十六烷酸和28-羥基二十八烷酸組成的酚酸酯化物。

燕麥；多酚；提?。桓咝б合?電噴霧質(zhì)譜法

The extraction technology and chemical composition of polyphenols from oats are studied.Ultrasonic treatments are supplementary means，polyphenol compounds are regarded as the index.The influences of extraction temperature，extraction time，ratio of rawmaterial and liquid，ethanol concentration on extraction efficiency are investigated by single factor experiment，and the extraction parameters of polyphenol are optimized by orthogonal experiment.The results showthat the optimum extraction conditions for ultrasonic assisted treatment（treatment power 180 W，treatment time 20 min）are：ethanol volumeter is 70%，the ratio of raw material and liquid is 1∶11，extraction time 4.5 h，extraction temperature 40℃，under this condition，the yield of polyphenol compounds from oats are 183.12 mg/100 g.The polyphenol compounds are separated and identified by high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry，determined the presence form of polyphenol compounds in oats is combined form，mainly for phenolic acids ester compounds composed by N-3',4'-two hydroxy cinnamoyl-5-hydroxy anthranilic acid，avenanthramides acid and its derivatives，two and twenty-six-1-alkyl alcohol，phenolic acid esterification of twenty-eight alkyl acid 26-twenty-six hydroxy alkanoic acids and 28-twenty-eight hydroxy alkanoic acids. Key words：oats；polyphenol；extraction；high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕麥，黑龍江牡丹江市深森山珍食品有限公司提供。

福林酚試劑，Sigma公司提供；甲醇和乙腈為色譜純，德國Merck公司提供；沒食子酸，天津市光復(fù)精細化工研究所提供；碳酸鈉、無水乙醇、乙酸，均為國產(chǎn)分析純。

FA2004型電子天平，上海衡平儀器儀表廠產(chǎn)品；DF-101S型集熱式磁力加熱攪拌器，金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；SC-3614型離心機，鄭州明天儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；UV-18型紫外可見分光光度計，天津市普瑞斯儀器有限公司產(chǎn)品；R-1005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；Agilent1200型高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜儀，美國Agilent公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 燕麥多酚的提取

準確稱取10.0 g燕麥超微粉于燒杯中，按試驗設(shè)計加入100 mL乙醇溶液，密封條件下于超聲清洗儀（超聲功率180 W）中處理20 min后在指定的溫度和時間下進行浸提、離心，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至25 mL，即為燕麥多酚提取液。

1.2.2 多酚含量的測定

以沒食子酸為標準品，采用Folin-ciocalteu法[9]進行燕麥多酚含量測定，其標準曲線為A=0.011 9X+ 0.005 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。

1.2.3 燕麥多酚提取試驗設(shè)計

（1）單因素試驗。以多酚提取量為指標，考查提取溫度、提取時間、料液比和乙醇體積分數(shù)對燕麥多酚提取效果的影響。

（2）正交試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，按L9（34）因素水平表排列順序進行燕麥多酚提取正交試驗。

燕麥多酚提取因素水平見表1。

表1 燕麥多酚提取因素水平

1.2.4 液-質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）測定方法

燕麥多酚組成采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS進行分析。所用試劑過0.45 μm濾膜，島津C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，檢測波長280 nm；采用以下溶劑體系進行洗脫：流動相A為乙腈，B相為2%乙酸水溶液；所用的梯度洗脫程序為0～30 min 100%A，30～35 min 40%A，35～42 min 1%A；整個梯度中流速1 mL/min。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定：毛細管電壓3.0 kV，干燥氣（N2）溫度350℃，流速9.0 L/min，正離子模式，光譜測定范圍100～2 000 m/z。

1.2.5 統(tǒng)計分析

每組試驗都進行3次平行試驗，并將試驗數(shù)據(jù)進行誤差分析；采用統(tǒng)計學(xué)軟件Spass 18對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥多酚提取工藝優(yōu)化

2.1.1 提取溫度對燕麥多酚提取量的影響

在提取時間5 h，料液比1∶10，乙醇體積分數(shù)70%時，研究提取溫度25，35，45，55，65℃對燕麥多酚提取量的影響。

提取溫度對燕麥多酚提取量的影響見圖1。

圖1 提取溫度對燕麥多酚提取量的影響

通常來說，當(dāng)提取溫度升高時植物組織會因吸水膨脹而增加可溶性物質(zhì)溶解和擴散速度，促使有效成分溶出速度加快[10]。但是在圖1中，當(dāng)提取溫度大于40℃時，提取溫度對燕麥多酚提取量的影響卻不顯著（p＞0.05）；隨著提取溫度的升高，燕麥多酚提取量呈現(xiàn)先增加后逐漸趨于平穩(wěn)的趨勢。其原因可能與燕麥中多酚物質(zhì)存在形式有關(guān)，當(dāng)提取溫度升高時，提取燕麥中自由酚會由于分子熱運動溶出速度加快，但溫度的改變對結(jié)合酚溶出率不會有太大影響。因此，選取35℃為燕麥多酚提取的提取溫度。

2.1.2 提取時間對燕麥多酚提取量的影響

在提取溫度35℃，料液比1∶10，乙醇體積分數(shù)70%時，研究提取時間3，4，5，6，7 h對燕麥多酚提取量的影響。

提取時間對燕麥多酚提取量的影響見圖2。

多酚物質(zhì)的抗氧化活性是提取條件選擇必須考慮的因素之一。若提取條件導(dǎo)致多酚結(jié)構(gòu)中羥基基團構(gòu)型發(fā)生改變，其抗氧化活性也會隨之降低[11-12]。因此，在兼顧增加多酚提取量的條件下，試驗選擇低溫長時的提取方式。從圖2可以看出，提取時間對燕麥多酚提取量具有極顯著性影響（p＜0.01）。提取時間的延長，燕麥多酚提取量由3 h時30.86 mg/100 g增加至最高值84.75 mg/100 g；其后，隨著提取時間的延長，燕麥多酚提取量有所下降。因此，選取5 h為燕麥多酚提取的提取時間。

2.1.3 料液比對燕麥多酚提取量的影響

在提取溫度35℃，提取時間5 h，乙醇體積分數(shù)70%時，研究料液比1∶5，1∶8，1∶10，1∶12，1∶15對燕麥多酚提取量的影響。

料液比對燕麥多酚提取量的影響見圖3。

圖2 提取時間對燕麥多酚提取量的影響

圖3 料液比對燕麥多酚提取量的影響

由圖3可知，隨著料液比的增加，燕麥多酚提取量由74.9 mg/100 g（料液比1∶5）增加至94.20 mg/100 g（料液比1∶12），此后料液比對燕麥多酚提取量影響不顯著（p＞0.05），燕麥多酚提取量趨于平穩(wěn)。因此，燕麥多酚提取的料液比選取1∶12為宜。

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對燕麥多酚提取量的影響

在提取溫度35℃，提取時間5 h，料液比1∶10時，研究乙醇體積分數(shù)10%，30%，50%，70%，90%對燕麥多酚提取量的影響。

乙醇體積分數(shù)對燕麥多酚提取量的影響見圖4。

提取溶劑的極性會隨著乙醇體積分數(shù)升高而有所降低，進而促使燕麥中極性相似物質(zhì)溶出。在大多數(shù)學(xué)者的研究中，有機溶劑和水的復(fù)合體系最適合多酚化合物提取的有機溶劑含量范圍50%～70%，圖4中燕麥多酚溶出曲線也證明了這一點。由圖4可以看出，乙醇體積分數(shù)對燕麥多酚提取量具有極顯著性影響（p＜0.01）。隨著乙醇體積分數(shù)的升高，燕麥多酚在達到最高值117.73 mg/100 g后其提取量有所下降。因此，選取70%為燕麥多酚提取的乙醇體積分數(shù)。

2.1.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、乙醇體積分數(shù)（D）為試驗因素，每個因素3個水平，以燕麥多酚提取量為指標，對燕麥多酚化合物提取進行條件優(yōu)化。

燕麥多酚提取正交試驗結(jié)果與分析見表2。

圖4 乙醇體積分數(shù)對燕麥多酚提取量的影響

表2 燕麥多酚提取正交試驗結(jié)果與分析

由表2中極差分析可知，各試驗因素對燕麥多酚提取量的影響先后順序為乙醇體積分數(shù)＞料液比＞提取時間＞提取溫度，最佳工藝條件組合為D2C1B1A3，即乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶11，提取時間4.5 h，提取溫度40℃。在此工藝條件下進行驗證試驗，其燕麥多酚提取量為183.12 mg/100 g，表明超聲波輔助燕麥多酚提取工藝可行。

2.2 燕麥多酚化合物組成分析

在正交試驗最優(yōu)條件下，對燕麥進行多酚提取后進行HPLC-EIS-MS分析。通過歸一化法對色譜峰進行分析，可得到主要燕麥多酚組分相對含量的變化。

燕麥提取物的液相色譜分離見圖5，燕麥粗粉和超聲輔助處理粉主要多酚組分相對含量的變化見表3。

從表3中可以看出，超聲輔助處理可以提高燕麥多酚的提取量，其提取量增幅為17.62%。將這一結(jié)果與Folin-ciocalteu法測定的燕麥多酚含量相比，其試驗結(jié)果也是相符的。通過與相應(yīng)文獻[13-16]進行比較，確認了4種燕麥多酚化合物存在。

4種燕麥多酚化合物的質(zhì)譜見圖6。

由圖6可知，組分1（保留時間為2.11min）色譜峰一級質(zhì)譜中316.15 m/z碎片離子峰為N-3',4'-二羥基肉桂酰-5-羥基鄰氨基苯甲酸特征峰，338.85 m/z和316.15 m/z 2個離子峰之間相差23，338.86 m/z應(yīng)為316.82 m/z加鈉形式，即338.86 m/z分子離子峰為N-3',4'-二羥基肉桂酰-5-羥基鄰氨基苯甲酸鈉鹽；組分2（保留時間為2.53 min）色譜峰的一級質(zhì)譜得到258.21 m/z分子離子峰應(yīng)是分子式為C15H15NO3的燕麥蒽酰胺化合物；組分3（保留時間為2.74 min）色譜峰的一級質(zhì)譜得到235.27 m/z和118.12 m/z 2個離子峰，其中碎片離子峰118.19 m/z為丁二酸，其分子式為HOOCCH2CH2COOH，當(dāng)其與5-羥基鄰氨基苯甲酸通過酰胺鍵連接環(huán)化脫去2個H2O后正好形成235.24 m/z這一分子峰。因此，235.24 m/z分子峰應(yīng)為燕麥蒽酰胺的衍生物。

超聲輔助處理粉中出現(xiàn)組分4，5，6，8由于未有相應(yīng)文獻報道，通過一級質(zhì)譜圖分子峰僅能判斷其應(yīng)為結(jié)合酚，但結(jié)構(gòu)組成需進一步研究。組分7（保留時間為17.73 min）色譜峰的一級質(zhì)譜得到792.94，679.86，114.01 m/z 3個離子峰。792.94 m/z與679.86 m/z離子峰之間相差113.08，而在碎片離子峰中確有114.01 m/z這一碎片離子峰存在，說明792.90 m/z這一分子峰是由二者組合而成。114.01 m/z這一碎片離子峰應(yīng)是分子式為C6H9O2的二烯酸；參考相應(yīng)相關(guān)資料，792.90 m/z分子離子峰應(yīng)為二烯酸與二十六烷-1-醇、26-羥基二十六烷酸和28-羥基二十八烷酸組成酚酸酯化物。由此可見，超聲輔助處理削弱了燕麥多酚與細胞壁結(jié)合作用力，促進了燕麥多酚溶出，進而增強了燕麥多酚的提取量。

圖5 燕麥提取物的液相色譜分離

表3 燕麥粗粉和超聲輔助處理粉主要多酚組分相對含量的變化

圖64 種燕麥多酚化合物的質(zhì)譜

3 結(jié)論

（1）超聲輔助低溫提取燕麥多酚的工藝條件為乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶11，提取時間4.5 h，提取溫度40℃。在此工藝條件下，燕麥多酚提取量為183.12 mg/100 g。

（2）對燕麥粗粉和超聲輔助處理粉多酚提取物進行HPLC-EIS-MS分析發(fā)現(xiàn)，超聲輔助處理可提高燕麥多酚的提取量，其增量值為17.62%；并對燕麥多酚結(jié)構(gòu)進行鑒定，確定N-3',4'-二羥基肉桂酰-5-羥基鄰氨基苯甲酸、燕麥蒽酰胺及其衍生物、二烯酸與二十六烷-1-醇、26-羥基二十六烷酸和28-羥基二十八烷酸單酯等多酚物質(zhì)的存在。

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TQ914.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.06.009

2017-05-12

黑龍江省科技攻關(guān)項目（GC13B409）。

祖億（1996—），女，在讀本科，研究方向為糧食工程。

*通訊作者：謝鳳英（1975—），女，博士，講師，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白質(zhì)工程。采用HPLC-EIS-MS對燕麥多酚物質(zhì)組成進行分析，以期為燕麥抗氧化成分的深入研究和安全、可靠的燕麥功能性食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

Technique Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Oat Polyphenols and Chemical Composition Analysis

ZU Yi，ZHAO Maozhen，WANG Peng，WANG Mingxia，YANG Zongyun，*XIE Fengying，XU Su

（College of Food，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030，China）

燕麥作為禾本科糧食作物之一，其不僅含有碳水化合物、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，還含有木聚糖、β-葡聚糖、生育酚、多酚等生物活性物質(zhì)[1-3]。燕麥中多酚物質(zhì)主要以燕麥生物堿、黃酮類化合物和酚酸形式存在[4]，其中燕麥生物堿為燕麥所特有的一類多酚化合物，主要存在于麩皮和糊粉層中，是由羥基肉桂酸及其衍生物通過酰胺鍵（-HNCO-）與鄰氨基苯甲酸及其衍生物連接而形成燕麥蒽酰胺類化合物。燕麥中黃酮類化合物較少，但阿魏酸、香草酸等酚酸類物質(zhì)含量較高。由于酚酸類物質(zhì)多以可溶性酯或與蛋白質(zhì)、糖等大分子結(jié)合所形成的復(fù)合物形式存在，因此常規(guī)的熱水和有機溶劑提取，燕麥多酚提取量均較低[5-7]。雖采用酸或堿試劑處理能增加多酚物質(zhì)溶出，但提取條件若控制不當(dāng)，會由于多酚結(jié)構(gòu)改變而使燕麥多酚抗氧化能力有所下降[8]。因此，試驗以黑龍江省產(chǎn)的燕麥為研究對象，首次嘗試利用超聲波產(chǎn)生的空穴作用，促使與細胞壁相連的酚酸類物質(zhì)溶出，以提高燕麥多酚提取量。同時，