王 丹， 何 浪， 劉樹立， 尹學蓉， 周再勇， 孫 群

（1.成都醫(yī)學院生物醫(yī)學系，四川 成都 610500；2.成都希望食品有限公司，四川 成都 611430；3.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064）

豬胎盤凍干粉對小鼠免疫功能的促進作用

王 丹1， 何 浪1， 劉樹立2， 尹學蓉2， 周再勇2， 孫 群3

（1.成都醫(yī)學院生物醫(yī)學系，四川 成都 610500；2.成都希望食品有限公司，四川 成都 611430；3.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064）

為探究豬胎盤凍干粉對小鼠免疫功能的影響，將110只6～8周齡的昆明小鼠隨機分為空白對照、陽性對照、高劑量實驗組、低劑量實驗組，采用經(jīng)口灌胃給藥法，連續(xù)給藥35 d后，測定各組小鼠的胸腺、脾臟等免疫臟器指數(shù)、腹腔巨噬細胞的吞噬百分率，和ConA刺激后外周血T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示：豬胎盤凍干粉高劑量組顯著提升小鼠脾臟指數(shù)（P＜0.05），但對胸腺指數(shù)影響不明顯（P＞0.05）；凍干粉所有劑量組的腹腔巨噬細胞吞噬活性及外周血T淋巴母細胞轉(zhuǎn)化率均顯著提高（P＜0.05），其中雄性組效果更明顯，表明豬胎盤凍干粉具有增強小鼠機體免疫功能的作用。

豬胎盤凍干粉；促進；小鼠；免疫功能

0 引 言

現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究表明，人胎盤中含有豐富的鐵、鋅、錳等微量元素[1-2]和18種常見氨基酸、磷脂、多糖，以及多種抗體、干擾素、催乳素、促性腺激素等生物活性物質(zhì)，是一種較為理想的免疫調(diào)節(jié)劑和保健品[3-5]。然而，人胎盤獲取的有限性及倫理學等問題嚴重阻礙了其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和應用。隨著國內(nèi)外對胎盤制品需求量的日益增大，與人胎盤組織結(jié)構(gòu)相似的動物胎盤已成為熱點[6-7]，目前研究較多的是羊胎盤、鹿胎盤等[8-9]。現(xiàn)有文獻表明羊胎盤中含有谷氨酸等15種常見氨基酸，其中8種為必需氨基酸；以及超氧化物歧化酶等多種酶類，透明質(zhì)酸刺激因子和表皮細胞生長因子等生物活性物質(zhì)[10-11]。鄭潤寬等[12]檢測了羊胎盤轉(zhuǎn)移因子注射液對家兔T淋巴細胞數(shù)量與活性的影響，及其對小鼠淋巴細胞的活化作用。其研究結(jié)果顯示，羊胎盤轉(zhuǎn)移因子注射液具有顯著增加淋巴細胞數(shù)量與活性的作用，可明顯地提高淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率。由此可見，羊胎盤轉(zhuǎn)移因子注射液具有改善和提高受試動物特異性細胞免疫的功能。

相比之下，來源廣、數(shù)量大、成本更加低廉的豬胎盤相關(guān)研究還處于起步階段。例如，Tang等[13]利用響應面優(yōu)化法建立了豬胎盤水溶性蛋白質(zhì)的最佳提取工藝。李曉梅等[14]明確了豬胎盤水提物具有抗氧化及改善小鼠記憶力的作用。而胡成波等[15]將豬衣烘焙研磨，加入適量的水和白酒后灌胃給瘦弱型母豬，不僅增加了母豬的抗病能力，而且對母豬不孕癥還有明顯的治療作用。

傳統(tǒng)的烘培加工技術(shù)，雖然簡單易行，但是高溫處理環(huán)節(jié)會對胎盤中的活性物質(zhì)造成嚴重的破壞。而冷凍干燥是近年發(fā)展起來的一種快速凍結(jié)、真空冰狀脫水的特殊食物加工方法，可最大限度地保持原新鮮食品的色香味及營養(yǎng)成分、物料外觀等。并且，凍干粉無須防腐劑就可在常溫下保存5年以上，成品質(zhì)量輕，便于攜帶、運輸和加工。前期研究中，本實驗室建立了豬胎盤凍干粉的制備工藝。國內(nèi)尚未見到豬胎盤凍干粉促免疫的相關(guān)報道。鑒于此，本文以昆明小鼠為實驗對象，探究豬胎盤凍干粉的促免疫作用，為其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和應用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

豬胎盤凍干粉原料由成都希望食品有限公司提供，水分小于3.54%±0.11%；刀豆蛋白ConA、脂多糖LPS、四甲基偶氮唑鹽（MTT）等購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、新生胎牛血清、PBS等購自Hyclone公司；淋巴細胞分離液、DMSO等購自四川辰馬生物有限公司；其他生化試劑購自成都科龍化工試劑廠。

1.2 實驗動物

昆明種小鼠110 只，6～8 周齡，（20±2）g，雌雄各半，購自四川達碩生物科技有限公司，公司科技部實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（川）2008-24。

1.3 儀器

3131型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Termo Electron Corporation；SB-JS-2型潔凈工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；Xmark型酶標儀，Bio-RAD公司；CKX41型倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；SC-3610型低速離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司；JJ-2組織搗碎勻漿機，常州國華電器有限公司；XW-80A微型漩渦混合儀，上海滬西儀器分析廠；電子天平，上海精科稱量儀器廠；96孔血清凝血板，計數(shù)器，微量加樣器，灌胃針，手術(shù)剪等。

2 方 法

2.1 動物分組及給藥

將小鼠隨機分為空白對照組、陽性對照組（提取液）、高劑量實驗組和低劑量實驗組4組，如表1所示。采用經(jīng)口灌胃給藥法，分別給予生理鹽水、豬胎盤提取液（蛋白濃度1.90 mg/mL）、高劑量豬胎盤凍干粉懸液和低劑量凍干粉懸液，每天1次，共35d。實驗期間保證各組小鼠均自由進食、飲水，自然晝夜照明，室內(nèi)通風良好，氨濃度＜20mg/L。相對濕度為40%～70%，室溫保持在18～22℃。

表1 實驗分組

2.2 小鼠的日常行為

注意觀察并記錄小鼠在實驗期間的進食、飲水，行為等變化。

2.3 小鼠體重監(jiān)測

實驗初始，對每只小鼠進行標記并稱取、記錄小鼠的初始體重；實驗過程中，每隔6d再次稱取、記錄每只小鼠的體重。

2.4 臟器指數(shù)測定

末次灌胃后，最后一次測量并記錄每只小鼠的體重。再頸椎脫臼處死小白鼠，用滅菌手術(shù)剪及鑷子取出小鼠的胸腺、脾臟等免疫器官，用電子天平稱量并記錄。以胸腺、脾臟、肝臟質(zhì)量（mg）與體重（g）之比作胸腺、脾臟及肝臟指數(shù)（指數(shù)單位mg/g）[16]。

2.5 腹腔巨噬細胞吞噬實驗

雞紅細胞懸液的制備：取雞翼下的靜脈血，按體積比1∶1的量與Alsever液混合，于4℃保存待用。臨用前，用生理鹽水洗滌兩次后，稀釋至20%。

連續(xù)灌胃35d后，每只小鼠腹腔注射1mL雞紅細胞懸液，輕揉小鼠腹部30min，用頸椎脫臼法處死小鼠。再取2mL滅菌生理鹽水注入小鼠腹腔，混合均勻后吸取其腹腔洗液1 mL，滴于載玻片上，制備細胞涂片。瑞氏染液染色后，在油鏡下計數(shù)，每片計100個巨噬細胞，計算吞噬率。公式如下：

2.6 淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗

連續(xù)灌胃35d后，將0.3mg ConA注射于每只小鼠的腹腔，再繼續(xù)飼養(yǎng)72 h后，取尾尖血于裝有3%檸檬酸鈉的試管中，混勻。再取1滴于載玻片上，均勻涂開，制備細胞涂片，瑞氏染液染色后，在油鏡下檢查細胞涂片的頭、體、尾3部分。并記錄轉(zhuǎn)化、未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)，計算淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。公式如下：

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理

3 結(jié) 果

3.1 記錄行為狀態(tài)

整個實驗期間，實驗小鼠的采食、飲水情況無異常，精神良好，行為反應敏捷，毛發(fā)有光澤，呼吸正常。

3.2 豬胎盤對小鼠體重的影響

由表2可知，以無菌生理鹽水、豬胎盤提取液、豬胎盤凍干粉懸液高劑量（0.3mL）、低劑量（0.1mL）灌胃給藥35d后，各組昆明小鼠原始體重，以及在給藥期間和給藥35d后的體重均無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，豬胎盤對生長期小鼠體重的增長無明顯影響，灌胃沒有對其造成過營養(yǎng)。

表2 豬胎盤灌胃給藥對小鼠體重的影響（±s）

表2 豬胎盤灌胃給藥對小鼠體重的影響（±s）

實驗分組 0d 6d 12d 18d 24d 30d 35d對照 29.06±2.69 30.62±4.14 31.36±4.56 31.86±5.03 33.13±5.13 33.34±5.10 34.34±5.40提取液 29.17±3.04 31.32±4.49 32.57±5.05 33.32±5.73 33.74±5.77 34.38±5.89 35.18±6.16凍干粉低劑量 29.47±3.82 31.39±5.03 32.54±5.42 33.38±5.70 34.21±6.09 34.52±6.39 35.39±6.41凍干粉高劑量 29.30±3.15 31.36±4.35 32.60±5.10 33.53±5.27 34.38±5.61 34.55±5.75 35.32±6.04

3.3 豬胎盤對小鼠臟器指數(shù)影響

4組小鼠在給藥35 d后對其臟器指數(shù)進行測定，臟器解剖結(jié)果見圖1。由圖可見，實驗組的脾臟和胸腺體積無肉眼可分辨的明顯變化。

無論是雄性還是雌性，豬胎盤凍干粉高劑量組對昆明鼠脾臟指數(shù)均顯著提升（P＜0.05），但對胸腺指數(shù)影響不明顯（P＞0.05）。豬胎盤提取液及凍干粉低劑量組對小鼠免疫器官指數(shù)均無顯著提升（P＞0.05）（見圖2）。此結(jié)果提示，豬胎盤凍干粉對小鼠的免疫器官指數(shù)有一定的影響。至于凍干粉高劑量組對胸腺指數(shù)提高不明顯的原因，可能是由于灌胃給藥方式對機體的影響相對緩慢，而凍干粉低劑量組及提取液組對脾臟和胸腺指數(shù)均無顯著提高，則有可能是由于處理時間短、劑量低等原因，具體機制還需進一步研究。

各組肝臟指數(shù)與生理鹽水對照組之間均無顯著差異（見圖3），說明小鼠肝臟無損傷，豬胎盤凍干粉懸液及提取液灌胃給藥安全無毒。

圖1 小鼠臟器解剖

圖2 豬胎盤灌胃給藥對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

圖3 豬胎盤灌胃給藥對小鼠肝臟指數(shù)的影響

3.4 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能評價

將小鼠腹腔巨噬細胞涂片，染色，進行顯微拍照。在顯微鏡下，可清楚分辨出雞紅細胞（CRBC）、巨噬細胞（Mφ），以及吞噬多個雞紅細胞的巨噬細胞，見圖4。

每片計100個巨噬細胞，計算吞噬率，結(jié)果如圖5所示。無論是雄性還是雌性小鼠，凍干粉及提取液灌胃35d，均顯著提高其腹腔巨噬細胞的吞噬活性，其中雄性凍干粉高劑量、低劑量及提取液組均與對照組比較差異極顯著（P＜0.01）。雌性凍干粉高劑量組與對照組比較差異極顯著（P＜0.01）。由此提示，灌胃給藥作用后，盡管小鼠從免疫臟器指數(shù)上僅脾臟有提高，余未見統(tǒng)計學意義，即胸腺免疫細胞數(shù)量增加不明顯，但是其免疫學功能，即巨噬細胞的吞噬能力顯著增強。

圖4 小鼠腹腔細胞懸液涂片（10×100）

圖5 豬胎盤灌胃給藥對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率的影響

3.5 小鼠T淋巴細胞轉(zhuǎn)化水平檢測

ConA刺激60h后，小鼠尾靜脈取血，取1小滴抗凝血滴在載玻片上，涂開血液，制備細胞涂片，瑞氏染液染色后，在油鏡下進行顯微拍照，見圖6。

每張血細胞涂片檢查涂片頭、體、尾3部分，記錄轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化淋巴細胞數(shù)。結(jié)果如圖7所示，由ConA誘導的小鼠外周血T淋巴母細胞轉(zhuǎn)化率均顯著提高，其中雄性凍干高劑量、低劑量及提取液組均與對照組比較差異極顯著（P＜0.01），與巨噬細胞吞噬功能類似，其免疫學功能顯著增強。

4 結(jié)束語

本文將豬胎盤凍干粉懸液經(jīng)口灌胃給昆明小鼠，連續(xù)給藥35d后，測定小鼠免疫臟器指數(shù)、腹腔巨噬細胞的吞噬率，以及ConA刺激后的外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示，豬胎盤凍干粉雖然對小鼠胸腺指數(shù)提高不明顯，但可顯著提升小鼠脾臟指數(shù)，以及腹腔巨噬細胞吞噬活性和外周血T淋巴母細胞轉(zhuǎn)化率。這說明，豬胎盤凍干粉具有增強小鼠機體免疫功能的作用。分析原因，豬胎盤中含有豐富的必需氨基酸、微量元素、核酸、表皮細胞生長因子、透明質(zhì)酸刺激因子，以及具有免疫活性的生長激素釋放因子等[17-18]，這不僅為胚胎發(fā)育輸送養(yǎng)分，而且為豬胎盤的免疫調(diào)節(jié)提供了物質(zhì)基礎。下一步擬從分子水平探究豬胎盤凍干粉增強機體免疫活性的作用機制。

圖6 小鼠T淋巴細胞轉(zhuǎn)化（10×100）

圖7 豬胎盤灌胃給藥對小鼠T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的影響

此外，豬胎盤凍干粉對小鼠肝臟無損傷、對小鼠體重無影響，說明豬胎盤凍干粉對機體安全無毒、無過營養(yǎng)負擔，可為開發(fā)豬胎盤凍干粉提供數(shù)據(jù)支持。

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（編輯：莫婕）

Promoting immune function in mice by freeze-dried pig placenta

WANG Dan1， HE Lang1， LIU Shuli2， YIN Xuerong2， ZHOU Zaiyong2， SUN Qun3
（1.School of Biomedical Sciences，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.Chengdu Xiwang Food Co.，Ltd.，Chengdu 611430，China；3.College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

To investigate the effect of freeze-dried pig placenta on immune function of mice.110 mice of 6-8 weeks old were randomly divided into blank control group， positive control group，high dose group， low dose group and fed with freeze-dried pig placenta powder for 35 days， and then the immune organ index of thymus， spleen of all groups of mice， the phagocytic percentage ofperitonealmacrophages， the conversion rate ofperipheralblood lymphocytesafterConA stimulation were measured.The results show that the high dosage group significantly improves the spleen index （P＜0.05） of mice， but not thymus index （P＞0.05）.Phagocytic activity of peritoneal macrophage and conversion rate of T lymphocytes of peripheral blood of all dosage groups are obviously increased （P＜0.05）， among which male group is more obvious.Freeze-dried pig placenta can effectively promote the immune function of mice.

freeze-dried pig placenta； promote； mice； immune function

A

1674-5124（2017）06-0050-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.06.011

2017-02-06；

2017-03-10

王 丹（1977-），女，遼寧遼陽市人，副教授，博士，主要從事生物制藥相關(guān)研究。

孫 群（1967-），女，四川內(nèi)江市人，教授，博士，主要從事食品安全研究。