楊昭毅，劉 斌

（安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230001）

頂空氣相色譜法測定利奧西呱原料藥中9種殘留溶劑的含量

楊昭毅，劉 斌

（安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230001）

建立同時測定利奧西呱原料藥中殘留溶劑甲醇、異丙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、六甲基二硅醚、三乙胺、甲苯與N，N-二甲基甲酰胺殘留量的方法。采用頂空進樣氣相色譜法，以二甲基亞砜為溶劑，外標法計算殘留溶劑量。9種殘留溶劑色譜峰的理論板數(shù)均＞10 000，相鄰峰的分離度均＞1.5，在考察的濃度范圍內(nèi)各溶劑線性關系良好（r=0.9982～0.9997）；RSD＜10%；平均加標回收率為90.86%～105.01%。各殘留溶劑的檢測限和定量限分別為0.000025%～0.0026%，0.000051%～0.0088%，均低于《中國藥典》規(guī)定。利奧西呱原料中檢出甲醇、正己烷、乙酸乙酯與DMF殘留，但均未超過限度，其余溶劑未檢出。該方法操作簡單、方法靈敏、結(jié)果準確，可用于利奧西呱原料藥中殘留溶劑檢測。

利奧西呱；頂空進樣氣相色譜法；殘留溶劑；外標法

0 引 言

利奧西呱（Riociguat）是一種口服的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶受體激動劑。2013年9月獲美國FDA批準，是第一個獲得批準的治療肺動脈高壓（PAH）和慢性血栓栓塞性PAH（CTEPH）的孤兒藥[1]。2014年初，日本及歐洲也相繼批準利奧西呱用于治療CTEPH和PAH。我國食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）于2014年3月也受理了利奧西呱口服片劑進口的申請。臨床試驗表明，利奧西呱在治療PAH和CTEPH上療效確切，具有良好的安全性及耐受性；且該藥為口服制劑，服用方便，具有良好的市場前景[2-3]。

在該藥的合成過程[4]中，需要使用人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調(diào)會（ICH）限制使用的第2類溶劑（甲醇、二氯甲烷、正己烷、N，N-二甲基甲酰胺與甲苯）和限制使用的第3類溶劑（異丙醇、乙酸乙酯）[5]。這些溶劑會對人體健康和環(huán)境造成危害，控制其殘留量對保證藥品質(zhì)量和用藥安全具有重要的意義。目前國內(nèi)尚未見有關利奧西呱原料藥殘留溶劑的檢測方法報道。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本文建立了頂空氣相色譜法測定利奧西呱原料藥中9種有機溶劑殘留量的方法。

1 儀器與材料

7890氣相色譜儀（FID檢測器）、7697A頂空進樣器、毛細管色譜柱DB-624（30m×0.530mm×1.80μm），美國Agilent公司；AL-104電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

甲醇、異丙醇、二氯甲烷、六甲基二硅醚、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）均為色譜純。甲苯、三乙胺、乙酸乙酯、正己烷均為分析純。

鹽酸利奧西呱原料，批號分別為141110，141112，141114（某制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 DB-624（30 m×0.530 mm×1.80 μm）毛細管柱。檢測器：氫火焰離子檢測器，進樣口溫度230℃。柱溫采取程序升溫，起始溫度為40℃，維持3min，按15℃/min的速率升溫至200℃，保持1min。頂空進樣，檢測器溫度250℃；頂空平衡溫度為75℃，平衡時間為20min，進樣體積為5mL。

2.2 溶液配制

空白溶劑：取DMSO 5 mL，置頂空瓶中，密封，即得。

對照品溶液：精密稱定甲醇1 500 mg、異丙醇2500mg、二氯甲烷 300mg、正己烷145mg、乙酸乙酯2 500 mg、六甲基二硅醚40mg、甲苯450mg、三乙胺160mg、DMF 440mg，分別用 DMSO 稀釋至 50mL，即為儲備液。精密量取上述儲備液1mL置同一100mL容量瓶中加DMSO至刻度，搖勻得對照品溶液。取5mL置頂空瓶中，密封備用。

供試品溶液：取鹽酸利奧西呱原料約1 g，精密稱定，置10mL容量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置頂空瓶中，密封即得。

2.3 專屬性試驗

分別精密量取2.2項對照品溶液5.0mL，在2.1條件下進樣測定，對各溶劑在色譜圖中的位置進行定位。另精密量取供試品溶液，同法測定?？瞻兹軇φ掌啡芤杭肮┰嚻飞V圖見圖1。

圖1 氣相色譜圖

結(jié)果表明，甲醇、異丙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、六甲基二硅醚、三乙胺、甲苯與DMF的保留時間分別為 2.777，4.298，4.637，5.206，6.021，6.667，6.867，8.531，9.573min?？瞻兹軇┎桓蓴_各殘留溶劑的檢測，對照品溶液中各溶劑峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10 000，供試品中在甲醇、正己烷、乙酸乙酯與DMF處檢出殘留峰，本法專屬性良好。

2.4 線性關系

分別精密量取2.2項下各對照品儲備液0.2，0.4，0.8，1.0，1.2mL置100 mL容量瓶中，加DMSO至刻度，搖勻，制成各對照品的標準曲線儲備液。

取上述標準曲線儲備液中甲醇10 μL、二氯甲烷20μL、DMF 100μL置10mL容量瓶A中；再分別取其他各標曲儲備液0.1 mL置不同10 mL容量瓶中，加DMSO至刻度，搖勻后依次精密量取異丙醇400 μL、正己烷 100 μL、乙酸乙酯 300 μL、六甲基二硅醚800 μL、三乙胺 140μL、甲苯 300 μL 置于容量瓶A中，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，制成混合標準曲線溶液。

精密量取上述標準曲線溶液各5mL，置頂空瓶中，密封；按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，甲醇、異丙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、六甲基二硅醚、三乙胺、甲苯與DMF的回歸方程及線性范圍見表1。結(jié)果表明：各溶劑在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積均呈良好線性關系（r=0.9982～0.9997）。

表1 線性關系考察試驗結(jié)果

2.5 精密度試驗

精密量取2.2項下對照品溶液各5mL（共6份），分別置頂空瓶中，密封。按2.1項下色譜條件測定峰面積，計算得甲醇、異丙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、六甲基二硅醚、三乙胺、甲苯與DMF峰面積的RSD 分別為 0.53%，0.36%，1.12%，4.82%，0.44%，3.22%，1.36%，0.31%，0.35%（n=6）。結(jié)果表明各溶劑峰面積的RSD均小于10.0%，本法精密度良好，滿足溶劑殘留測定要求。

2.6 回收率

精密稱取鹽酸利奧西呱原料1g，置10mL容量瓶中，分別精密加混合對照品溶液0.08，0.1，0.12mL，輕輕振搖使其溶解，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，分別作為低濃度（80%）、中濃度（100%）和高濃度（120%）加標溶液。每種濃度溶液平行制備3份，考察本方法的回收率，結(jié)果見表2。

表2 9種溶劑的回收率試驗結(jié)果

結(jié)果表明9種溶劑在高、中、低各加標量下回收率均在80%～120%之間，滿足殘留溶劑測定要求。

2.7 檢測限、定量限

精密量取2.2項下對照品儲備液，用DMSO逐級稀釋，精密量取各稀釋溶液5 mL，分別置頂空瓶中，密封。 以信噪比 S∶N=3∶1，10∶1 的濃度作為各溶劑的檢測限與定量限，按2.1項下色譜條件測定峰面積，結(jié)果見表3。

表3 9種殘留溶劑的檢測限、定量限

結(jié)果表明在上述色譜條件下，各殘留溶劑的檢測限和定量限均低于《中國藥典》[5]（Ch.P）規(guī)定限度，本法的靈敏度較高。

2.8 樣品溶劑殘留量測定

取鹽酸利奧西呱原料3批，按上述方法進行殘留溶劑檢查，結(jié)果見表4。檢測結(jié)果表明3批樣品中均檢出甲醇、正己烷、乙酸乙酯與DMF殘留，各殘留均未超過限度，其余溶劑未檢出。

表4 利奧西呱樣品殘留溶劑檢查（n=3） %

3 討 論

3.1 進樣方式的選擇

目前各國藥典測定有機溶劑殘留的方法主要為直接進樣法和頂空進樣法。通常情況下，沸點低的溶劑建議采用頂空進樣法，沸點高的溶劑采用溶液直接進樣法[6-7]，同時考慮到有機溶劑殘留檢測通常要同時檢測多種溶劑，為了提高檢測的可行性和簡便性，有學者建議盡量在同樣的檢測條件下檢測盡量多種的殘留溶劑[8]。本品有機溶劑殘留量檢查中對低沸點的二氯甲烷、異丙醇、乙酸乙酯的測定首選為頂空進樣法，據(jù)文獻[9-10]報道高沸點的DMF測定選擇頂空進樣法亦可以滿足測定要求，故筆者選擇頂空進樣法測定利奧西呱原料中9種有機溶劑的殘留量。

3.2 頂空平衡溫度及平衡時間的選擇

在頂空平衡時間為20min時，筆者分別考察了平衡溫度為65，75，85，95℃時的色譜峰峰面積。結(jié)果顯示，隨著平衡溫度的升高，色譜峰峰面積增大，但85℃以上后，各成分峰面積均無顯著增加；當平衡溫度升高至95℃時，色譜圖中出現(xiàn)多個未知雜質(zhì)峰干擾測定結(jié)果，可能為DMSO受熱的分解產(chǎn)物[11]。在平衡溫度為75℃時，色譜圖中無未知雜質(zhì)峰，各成分均能滿足測定要求，因此選擇75℃作為平衡溫度。

頂空平衡有一定的時間要求，以保證樣品溶液的氣液兩相達到平衡，但也不宜過長，否則會引起頂空瓶氣密性變差，導致定量準確性降低[12]。在頂空平衡溫度75℃時，筆者分別考察了平衡時間為20，30，40min時的色譜峰峰面積。結(jié)果顯示，不同平衡時間的峰面積基本一致，說明20min已經(jīng)能達到氣液平衡，因此選擇20min為頂空平衡時間。

3.3 測定結(jié)果分析

根據(jù)對人體健康可能造成的危害，目前將殘留溶劑共分為4類69種。第2類殘留溶劑共28種，毒性比第1類溶劑小，屬于限制使用。第3類殘留溶劑共26種，是藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）或其他質(zhì)量要求限制使用的溶劑。此次測得的4種溶劑殘留中，甲醇、正己烷和DMF屬于第2類，乙酸乙酯屬于第3類，因此有必要對這4種溶劑殘留進行控制，以確保該藥物的質(zhì)量和安全性，同時減少有機溶劑對環(huán)境的影響。

4 結(jié)束語

本實驗首次采用頂空氣相色譜法對利奧西呱原料藥中的9種殘留溶劑進行檢測。方法學驗證結(jié)果表明該方法色譜條件分離度良好，靈敏度高，在考察的濃度范圍內(nèi)線性關系良好，回收率符合規(guī)定，檢測方法簡便、準確，可以作為生產(chǎn)企業(yè)和有關檢測機構(gòu)對利奧西呱原料藥中的殘留溶劑進行質(zhì)量控制方法，同時也可為從事相關殘留溶劑檢測的分析工作者提供參考。

[1]潘雄，程應樟，程曉曙.治療肺動脈高壓新藥-利奧西呱[J].中國藥學雜志，2016，51（2）：159-162.

[2]肖桂芝，劉永貴，湯立達.治療栓塞性肺動脈高壓和成人肺動脈高壓新藥利奧西呱[J].中國新藥雜志，2015，24（1）：1-4.

[3] 孟曉冬，單福祥，王燕慧.肺動脈高壓治療進展[J].心血管病學進展，2016，37（3）：319-322.

[4] 王宏博，鄧乾亞，袁博.利奧西呱的合成[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2016，47（6）：675-678.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[M].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：105-107.

[6]European Pharmacopoeia[M].8.0 edition.2013：141-145.

[7] 譚必琴，劉雁鳴.提高氣相色譜法測定藥物殘留溶劑靈敏度的方法[J].中南藥學，2016，14（8）：846-850.

[8]國家食品藥品監(jiān)督管理總局.化學藥物殘留溶劑研究的技術指導原則[EB/OL].[2016-03-29].http：//www.cda.gov.cn/WS01/CL1616/83419.html.

[9]秦立，胡昌勤，劉文英.頂空氣相色譜法測定藥品中殘留溶劑的影響因素考察[J].藥物分析雜志，2005，25（7）：823-826.

[10]崇小萌，胡昌勤.利用中等極性氣相色譜系統(tǒng)分析藥物殘留溶劑[J].藥物分析雜志，2014，34（11）：2048-2053.

[11]張玲，楊華良，王家明.GC測定安立生坦原料藥中6種有機溶劑殘留[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2014，31（10）：1238-1241.

[12]楊晨，任鳳英，楊紅，等.頂空氣相色譜法測定鹽酸頭孢替安酯原料藥中殘留溶劑含量[J].醫(yī)藥導報，2016，35（2）：177-180.

（編輯：莫婕）

Determination of 9 residual solvents in Riociguat by headspace gas chromatography

YANG Zhaoyi，LIU Bin
（Department of Pharmacy，Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei 230001，China）

To establish a method for simultaneous determination of the nine residual solvents （methanol，isopropanol， dichloromethane， normal hexane， ethyl acetate， hexamethyl disiloxane， triethylamine，methylbenzene and N，N-dimethylformamide） in Riociguat.Headspace gaschromatographywas applied and dimethyl sulfoxide solvent was used.External standard method was adopted to calculate residual solvent content.The good linear relation of 9 kind of organic solvents were achieved（r=0.998 2 ～0.999 7） with theoretical plate number at chromatographic peak being ＞10 000 and resolution of adjacentpeak being ＞1.5 within investigated concentration range.The RSDs of precision was＜10%.The average recoveries ranged from 90.86%to 105.01%.Detection limit and quantitation limit(percentage in sample for test)were 0.000025%～0.0026%，0.000051%～0.0088%，which is lower than the regulations in Chinese Pharmacopoeia.The methanol， normal hexane， ethyl acetate and DMF were detected in Riociguat， and they are within limit.No othersolvents detected.The analyticalmethod issimple， accurate and sensitive， and is suitable forthe determination of residual solvents in Riociguat.

Riociguat； headspace gas chromatography； residual solvents； external standard method

A

1674-5124（2017）06-0042-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.06.009

2016-10-19；

2016-12-13

楊昭毅（1982-），男，安徽合肥市人，主管藥師，博士，研究方向為臨床藥學、藥物分析。

劉 斌（1975-），男，安徽合肥市人，副主任藥師，碩士，研究方向為藥物制劑、臨床藥學。