侯佳啟，林敏，周亞彬，馬崇禮，畢旺來*，李睿

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

檸檬酸和氯化鈉抑制地衣芽孢桿菌生物被膜的研究

侯佳啟，林敏，周亞彬，馬崇禮，畢旺來*，李睿

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

地衣芽孢桿菌是食品中常見腐敗菌。該研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌在常見培養(yǎng)基（如TSB、NB、LB、1/2LB）中均有較強(qiáng)的產(chǎn)生物被膜能力，地衣芽孢桿菌稀釋100倍、在胰酪胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基中30℃靜置培養(yǎng)更利于地衣芽胞桿菌在96孔板上產(chǎn)生物被膜。測(cè)得地衣芽孢桿菌對(duì)檸檬酸和氯化鈉的最低抑菌質(zhì)量濃度（MIC）分別為1.28 mg/mL和64 mg/mL。采用結(jié)晶紫染色法，研究不同質(zhì)量濃度檸檬酸和氯化鈉對(duì)地衣芽孢桿菌生物被膜的抑制效果。結(jié)果顯示，1/2MIC的氯化鈉即能顯著抑制地衣芽孢桿菌生物被膜形成（P＜0.01）；而1/2MIC和1MIC的檸檬酸對(duì)地衣芽孢桿菌生物被膜形成無明顯抑制效果（P＞0.05）。

地衣芽孢桿菌；生物被膜；檸檬酸；氯化鈉；抑制效果

細(xì)菌生物膜（也稱生物被膜）是一種定植于物體表面的微生物聚集體，由細(xì)菌和自身分泌的胞外基質(zhì)組成，廣泛存在于食品加工廠、污水排放系統(tǒng)等場(chǎng)所[1-2]。細(xì)菌生物膜能夠提供特殊的微環(huán)境和黏質(zhì)物屏障作用，保護(hù)細(xì)菌免受外環(huán)境侵害，降低各類防腐劑和消毒措施的殺菌抑菌作用[3]。細(xì)菌生物膜不僅是細(xì)菌耐藥的主要原因之一，也能造成細(xì)菌在食品加工環(huán)境持續(xù)生長繁殖，從而導(dǎo)致食品腐敗，縮短食品保質(zhì)期，影響食品安全[4-5]。因此細(xì)菌生物膜的防控已成為各國生物和食品學(xué)家研究的熱門領(lǐng)域之一[6-9]。

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）屬于革蘭氏陽性芽孢桿菌，能產(chǎn)生豐富的蛋白和淀粉分解酶，從而使肉、罐頭、豆類、淀粉食品等腐敗變質(zhì)。地衣芽孢桿菌耐熱性強(qiáng)，抵抗不良環(huán)境能力強(qiáng)，因此是食品常見腐敗菌[10]。

檸檬酸和氯化鈉是食品常見添加劑，這兩種添加劑同時(shí)還具有一定的抑菌性能[11-12]。陳南南等[13]探究了檸檬酸對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、藤黃微球菌三種腐敗菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）；李雅麗等[14]的研究表明，地衣芽孢桿菌對(duì)氯化鈉不耐受；陳曉等[15]研究了地衣芽孢桿菌對(duì)不同防腐劑的敏感性，結(jié)果表明地衣芽孢桿菌對(duì)山梨酸鉀、乳酸鈉不敏感，對(duì)Nisin、ξ-聚賴氨酸和尼泊金乙酯較為敏感。

地衣芽孢桿菌生物膜的形成機(jī)理目前尚未有詳細(xì)研究。本實(shí)驗(yàn)主要研究地衣芽孢桿菌生物膜的形成條件以及檸檬酸和氯化鈉對(duì)地衣芽孢桿菌生物膜的影響，旨在為食品防腐提供參考，為企業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）：由本實(shí)驗(yàn)室分離，上海生工生物公司經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序鑒定。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸、大豆蛋白胨、葡萄糖、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；刀豆蛋白A（FITC-Con A）：美國Vector Laboratories公司；蛋白胨：英國OXOID公司；結(jié)晶紫：武漢市華順生物技術(shù)有限公司。

胰蛋白胨大豆肉湯（trypticsoybroth，TSB）培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基、溶菌肉湯（lysogenybroth，LB）培養(yǎng)基、1/2LB、MH肉湯（mueller-hinton broth，MHB）培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-22型恒溫?fù)u床：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；V-1100D型可見分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；SL302型電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；UPY-III-103純水制備成套設(shè)備：四川優(yōu)普超純科技有限公司；PYX-150S-B生化培養(yǎng)箱：科力儀器有限公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺(tái)；SUNRISE酶標(biāo)儀：英國TECAN公司；COSTAR 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國Corning公司；ECLIPSE 80i顯微鏡：尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 地衣芽孢桿菌的產(chǎn)膜條件實(shí)驗(yàn)

將地衣芽孢桿菌分別接種到TSB、NB、LB、1/2LB四種培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600nm約為1.0，用相應(yīng)培養(yǎng)基50倍和100倍稀釋菌液備用。各取150 μL不同濃度菌液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別于30℃、37℃靜置培養(yǎng)72 h，每一實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組各設(shè)置至少3個(gè)平行孔，陰性對(duì)照組為只加無菌培養(yǎng)基，平行試驗(yàn)3次。用結(jié)晶紫染色法測(cè)定膜產(chǎn)量。

1.3.2 NaCl和檸檬酸的最小抑菌濃度的測(cè)定

將地衣芽孢桿菌接種到MHB培養(yǎng)基中，37℃、150r/min恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為1.0，50倍稀釋菌液備用。配制5.12 mg/mL檸檬酸母液、256 mg/mL氯化鈉母液，按參考文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行系列倍比稀釋。取50 μL菌液與50 μL不同濃度的氯化鈉或檸檬酸加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃靜置培養(yǎng)24h，并設(shè)置陽性對(duì)照組（50μL菌液與50μLMHB混合）和陰性對(duì)照組（只加100 μL MHB），每一實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各設(shè)置至少三個(gè)平行孔。平行試驗(yàn)3次。

1.3.3 地衣芽孢桿菌生物膜熒光觀察

將地衣芽孢桿菌接種到TSB培養(yǎng)基中，37℃、150r/min培養(yǎng)14 h左右，培養(yǎng)至OD600nm約為1.0。用新鮮TSB稀釋100倍，即調(diào)整菌液濃度為105CFU/mL，備用。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中放置無菌蓋玻片，取2 mL菌液轉(zhuǎn)接于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，30℃分別靜置培養(yǎng)24h、48h、72h。培養(yǎng)結(jié)束后，撈出蓋玻片，取pH值為7.2的磷酸鹽緩沖溶液（phospbatebuffersaline，PBS）洗滌蓋玻片上的浮游菌，取200 μL 20 μg/mL FITC-ConA均勻滴加到蓋玻片上，37℃條件下遮光處理30 min，用PBS洗滌2次，洗去殘液后，熒光顯微鏡下觀察生物膜形態(tài)與結(jié)構(gòu)。

1.3.4 氯化鈉、檸檬酸對(duì)地衣芽孢桿菌生物膜形成的影響

將地衣芽孢桿菌接種到TSB培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)14h，培養(yǎng)至OD600nm約為1.0。用新鮮TSB稀釋50倍，即調(diào)整菌液濃度為106CFU/mL，備用。取75μL菌液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，再分別加入75μL的256mg/mL（4MIC）、128mg/mL（2MIC）、64 mg/mL（MIC）氯化鈉，30℃靜置培養(yǎng)72 h，并做陽性對(duì)照組（75 μL菌液與75 μL TSB混合）與陰性對(duì)照組（只加150 μL TSB）。培養(yǎng)完成后，棄菌液，進(jìn)行結(jié)晶紫染色測(cè)定生物膜。氯化鈉母液用TSB溶解配置。檸檬酸處理方式同上。

1.3.5 結(jié)晶紫染色測(cè)定生物膜

[17]方法并略有修改。取200μLPBS（pH7.2）洗滌生物膜2次。37℃干燥40min后，每孔中加入200μL0.1%結(jié)晶紫，37℃染色15 min，用PBS洗滌2次，干燥。每孔加入200 μL體積分?jǐn)?shù)95%的無水乙醇，靜置直至生物膜完全脫色，將染液轉(zhuǎn)移至新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在波長600 nm處測(cè)量吸光度值，每一實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組設(shè)置至少3個(gè)平行對(duì)照孔，取平均值。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。計(jì)算公式如下：

樣品最終OD值=樣品平均OD值-陰性對(duì)照OD平均值

2 結(jié)果與分析

研究表明，溫度、菌液濃度、營養(yǎng)條件是影響微生物生物膜的形成的重要因素[2]，因此本研究分別測(cè)定了溫度、菌液濃度、培養(yǎng)基種類對(duì)地衣芽孢桿菌生物膜形成的影響。

2.1 地衣芽孢桿菌產(chǎn)膜條件

在50倍稀釋菌液條件下，考察不同溫度條件下地衣芽孢桿菌在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)膜能力，結(jié)果見圖1。

圖1 不同溫度條件下地衣芽孢桿菌在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)生物被膜能力比較Fig.1 Comparison of the biofilm formation ability ofB.licheniformis in different mediums and temperature

由圖1可知，在30℃條件下，TSB、NB、LB、1/2LB四種培養(yǎng)基中地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的生物膜量均高于37℃條件下的生物膜量。

在30℃條件下，考察不同菌液濃度時(shí)地衣芽孢桿菌在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)膜能力，結(jié)果見圖2。

圖2 不同菌液濃度下地衣芽孢桿菌在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)生物被膜能力比較Fig.2 Comparison of the biofilm formation ability ofB.licheniformis in different mediums and concentrations of bacterial solution

由圖2可知，地衣芽孢桿菌100倍稀釋菌液（100*表示）在TSB、NB、1/2LB培養(yǎng)基中產(chǎn)生的生物膜量均高于50倍稀釋菌液（50*表示），LB培養(yǎng)基恰好相反。

在30℃、100倍稀釋菌液條件下，考察不同培養(yǎng)基對(duì)地衣芽孢桿菌產(chǎn)膜能力的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同培養(yǎng)基對(duì)地衣芽孢桿菌產(chǎn)生物被膜能力的影響Fig.3 Effect of different mediums on the biofilm formation ability of B.licheniformis

由圖3可知，地衣芽孢桿菌在TSB、NB、LB、1/2LB四種培養(yǎng)基中均有較強(qiáng)的產(chǎn)膜能力，地衣芽孢桿菌在LB培養(yǎng)基中產(chǎn)膜最弱。

因此，本實(shí)驗(yàn)最終確定的地衣芽孢桿菌產(chǎn)膜條件為：地衣芽孢桿菌起始菌液濃度105CFU/mL左右（即將培養(yǎng)至OD600nm值約為1.0的地衣芽孢桿菌稀釋100倍），TSB培養(yǎng)基中30℃靜置培養(yǎng)。

2.2 氯化鈉和檸檬酸的MIC測(cè)定

按2012 CLSCI抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定MIC，通過二倍稀釋法得出，氯化鈉對(duì)地衣芽孢桿菌的最低抑菌濃度為64 mg/mL，檸檬酸對(duì)地衣芽孢桿菌的最低抑菌濃度為1.28 mg/mL。

2.3 地衣芽孢桿菌生物膜熒光觀察

地衣芽孢桿菌在TSB中培養(yǎng)24 h，經(jīng)FITC-Con A染色后用熒光顯微鏡觀察，可見蓋玻片表面有綠色絮樣、不定形團(tuán)塊，即為地衣芽孢桿菌早期生物膜。48 h、72 h后的生物膜量明顯增多，形成更為密集、體積更大的團(tuán)塊狀、絮樣結(jié)構(gòu)，玻璃表面的透光度明顯降低，生物膜的結(jié)構(gòu)更為致密。

2.4 氯化鈉、檸檬酸對(duì)地衣芽孢桿菌生物膜的抑制作用

將地衣芽孢桿菌稀釋菌液與不同含量的氯化鈉或檸檬酸混合，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使檸檬酸、氯化鈉終濃度約為1/2MIC、MIC、2MIC。30℃靜置培養(yǎng)72 h，地衣芽孢桿菌可在細(xì)胞培養(yǎng)板孔的側(cè)壁和氣液交界面上均形成肉眼可見的膜。用吸頭輕輕去掉氣液交界面上漂浮的膜和菌液，將粘附在孔側(cè)壁上的生物膜洗滌烘干，用結(jié)晶紫法測(cè)定生物膜量。

圖4不同氯化鈉質(zhì)量濃度對(duì)地衣芽孢桿菌生物被膜抑制效果Fig.4 Inhibitory effects of different concentrations of sodium chloride onB.licheniformisbiofilm

圖4 可見，各樣品組的OD600nm值與對(duì)照組比較，均出現(xiàn)了極顯著差異（P＜0.01），表明1/2MIC的氯化鈉（32mg/mL）即能顯著抑制地衣芽孢桿菌生物膜形成。

2.4.2 檸檬酸抑制地衣芽孢桿菌生物膜形成的影響結(jié)果

圖5 不同檸檬酸質(zhì)量濃度對(duì)地衣芽孢桿菌生物被膜抑制效果Fig.5 Inhibitory effects of different concentrations of citric acid on B.licheniformisbiofilm

由圖5可見，各樣品組的OD600nm值與對(duì)照組比較，僅2.56mg/mL（2MIC）檸檬酸組出現(xiàn)了極顯著差異（P＜0.01），表明加入較高濃度的檸檬酸能顯著抑制地衣芽孢桿菌生物膜的生成，而1/2MIC和MIC的檸檬酸對(duì)地衣芽孢桿菌生物膜形成無明顯抑制效果（P＞0.05）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了地衣芽孢桿菌生物膜最適生長條件，以及檸檬酸和氯化鈉對(duì)地衣芽孢桿菌生物膜的抑制效果。研究結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌產(chǎn)膜能力很強(qiáng)，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基如TSB、LB，營養(yǎng)簡單的培養(yǎng)基如NB、1/2LB上均能產(chǎn)生肉眼可見的生物膜。低溫（30℃）比高溫（37℃）更有利于地衣芽孢桿菌產(chǎn)生物膜。結(jié)果顯示低于最低抑菌濃度的氯化鈉即能有效抑制地衣芽孢桿菌生物膜的形成，低于最低抑菌濃度的氯化鈉有可能通過減少細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性能、減少細(xì)菌附著到固定載體上，從而抑制地衣芽孢桿菌形成生物膜[2]；1/2MIC和MIC的檸檬酸對(duì)地衣芽孢桿菌生物膜形成無明顯抑制效果，說明高濃度的檸檬酸主要通過抑制細(xì)菌生長、減少細(xì)菌數(shù)目，從而減少生物膜產(chǎn)生。

參考文獻(xiàn)：

[1]FLEMMING H C,WINGENDER J,SZEWZYK U,et al.Biofilms:an emergent form of bacterial life[J].Nat Rev Microbiol,2016,14(9):563-575.

[2]SREY S,JAHID I K,HA S D.Biofilm formation in food industries:A food safety concern[J].Food Control,2013,31(6):572-585.

[3]崔海英，張雪婧，趙呈婷，等.細(xì)菌生物膜的研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（8）：11-14．

[4]陳鐵柱，李曉聲，曾文魁，等.細(xì)菌生物膜耐藥機(jī)制的研究與進(jìn)展[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（12）：2205-2208．

[5]EHRLICH G D,AHMED A,EARL J,et al.The distributed genome hypothesis as a rubric for understanding evolution in situ during chronic bacterial biofilm infectious processes[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2010,59(3):269-279.

[6]ACKER H V,DIJCK P V,COENYE T.Molecular mechanisms of an

timicrobial tolerance and resistance in bacterial and fungal biofilms[J]. Trends Microbiol,2014,22(6):326-333.

[7]BURT S A,OJO-FAKUNLE V T A,WOERTMAN J,et al.The natural antimicrobial carvacrol inhibits quorum sensing inChromobacterium violaceumand reduces bacterial biofilm formation at sub-lethal concentrations[J].PloS One,2014,9(4):e93414.

[8]OLSEN I.Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2015,34(5):877-886.

[9]李斌，董明盛.黑木耳提取物對(duì)細(xì)菌群體感應(yīng)及生物膜形成的抑制作用[J].食品科學(xué)，2010，31（9）：140-143.

[10]許玉慧，許喜林，辛淑敏.即食濕面條中腐敗微生物的分離和鑒定的初步研究[J].中國釀造，2014，33（7）：68-71.

[11]DELRíO E,MURIENTE R,PRIETO M,et al.Effectiveness of trisodium phosphate,acidified sodium chlorite,citric acid,and peroxyacids against pathogenic bacteria on poultry during refrigerated storage[J].J Food Prot,2007,70(9):2063-2071.

[12]GILL A O,HOLLEY R A.Interactive inhibition of meat spoilage and pathogenic bacteria by lysozyme,nisin and EDTA in the presence of nitrite and sodium chloride at 24℃[J].Int J Food Microbiol,2003,80 (3):251-259.

[13]陳南南，徐歆，商豐才，等.不同防腐劑對(duì)3種模式腐敗菌抑菌效果的比較[J].食品科學(xué)，2011，32（1）：14-18.

[14]李雅麗，秦艷，周緒霞，等.6株芽孢桿菌的生物學(xué)特性比較研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（4）：62-66.

[15]陳曉，柳艷霞，魏法山，等.防腐劑對(duì)地衣芽孢桿菌的抑制效果[J].食品科學(xué)，2012，33（3）：89-91.

[16]CLSI-Clinical and Laboratory Standards Institute,Performance standards for antimicrobial susceptibility testing,twenty-second informational supplement.M100-MS22.Approved Standard,ninth ed[S]. Wayne,PA,USA,2012.

[17]DJORDJEVIC D,WIEDMANN M,MCLANDSBOROUGH L A.Microtiter plate assay for assessment ofListeria monocytogenesbiofilm formation[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(6):2950-2958.

Inhibitory effects of citric acid and sodium chloride onBacillus licheniformisbiofilm

HOU Jiaqi,LIN Min,ZHOU Yabin,MA Chongli,BI Wanglai*,LI Rui
(College of Biological and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

Bacillus licheniformisis a common spoilage bacterium in food.This studly showed thatB.licheniformisall had strong biofilm formation ability in the common medium(including TSB,NB,LB and 1/2LB).The bacterial solution ofB.licheniformiswas diluted 100 times and was cultured in the tryptic soytone broth(TSB)medium at 30℃,which was more beneficial to the formation ofB.licheniformisbiofilm on the 96-well plate.The minimum inhibitoryconcentration(MIC)ofB.licheniformison citric acid and sodium chloride were 1.28 mg/ml and 64 mg/ml,respectively.By crystal violet staining,the inhibitory effect of different concentration of citric acid and sodium chloride onB.licheniformisbiofilm was researched.The results showed that 1/2MIC sodium chloride could significantly inhibit the formation ofB.licheniformisbiofilm(P＜0.01),while 1/2MIC and 1MIC citric acid had no significant inhibitory effect on the formation ofB.licheniformisbiofilm(P＞0.05).

Bacillus licheniformis;biofilm;citric acid;sodium chloride;inhibitory effect

R155.5

0254-5071（2017）07-0110-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.024

2017-02-21

企業(yè)委托項(xiàng)目（2016）；武漢輕工大學(xué)大學(xué)生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（2016）

侯佳啟（1995-），男，本科生，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>

*通訊作者：畢旺來（1972-），男，實(shí)驗(yàn)員，本科，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>