劉燕梅，王艷麗，汪文鵬，李永博，吳樹(shù)坤，劉梅，黃治國(guó)*

（1.宜賓市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川宜賓644000；2.四川理工學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000；3.安徽古井集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)質(zhì)量中心，安徽亳州236800）

濃香型白酒窖泥中芽孢桿菌的分離鑒定及代謝產(chǎn)物分析

劉燕梅1，2，王艷麗2，3，汪文鵬2，李永博2，吳樹(shù)坤2，劉梅2，黃治國(guó)2*

（1.宜賓市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川宜賓644000；2.四川理工學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000；3.安徽古井集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)質(zhì)量中心，安徽亳州236800）

從濃香型白酒窖泥中篩選出3細(xì)菌，經(jīng)磷脂脂肪酸（PLFA）鑒定，分別為球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaerieus）、短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）、塵埃類芽孢桿菌（Paenibacillus larvaesubsup.pulvifaciens）。采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GC-MS）技術(shù)分析3株菌發(fā)酵產(chǎn)物，結(jié)果表明，3株菌產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力較強(qiáng)且種類豐富，主要為高級(jí)醇、高級(jí)酮等芳香類化合物，它們作為白酒中的微量成分，對(duì)濃香型白酒風(fēng)味的形成起著放香、助香及調(diào)香的作用。因此，這3株菌的代謝產(chǎn)物對(duì)濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成有一定影響。

濃香型白酒；窖泥；芽孢桿菌；分離；磷脂脂肪酸鑒定；代謝產(chǎn)物分析

白酒是世界五大蒸餾酒之一，具有多種不同的香型，其中濃香型白酒在中國(guó)白酒行業(yè)有著重要的地位。窖池微生物在白酒釀造過(guò)程中對(duì)白酒產(chǎn)量、質(zhì)量有著重要的影響，其代謝產(chǎn)物是白酒呈香呈味物質(zhì)的基礎(chǔ)。趙爽等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在白酒的釀造過(guò)程中，微生物與白酒的風(fēng)味之間有著一定的聯(lián)系。張霞等[2]研究發(fā)現(xiàn)，濃香型白酒窖泥中可培養(yǎng)細(xì)菌主要是芽孢桿菌（Bacillus），以地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）為主，也存在少量球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus），及極少量的短芽孢桿菌屬（Bacillus brevis）。葉光斌等[3]利用基因文庫(kù)法研究發(fā)現(xiàn)窖泥中含有大量的芽孢桿菌屬，經(jīng)克隆文庫(kù)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，有16個(gè)克隆子與可培養(yǎng)的同源性較高，如芽孢桿菌屬、枝芽芽孢桿菌屬（Virgibacillus）以及Lysinibacillus。芽孢桿菌屬是白酒釀造中的主要原核微生物，因此探究其種屬及發(fā)酵特性對(duì)濃香型白酒生產(chǎn)及風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生有著重要的意義。

目前，針對(duì)微生物的鑒定方法有基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）測(cè)序、Biolog微生物鑒定、磷脂脂肪酸（phosphor lipid fatty acid，PLFA）分析技術(shù)等。PLFA分析技術(shù)是一種基于生物化學(xué)手段的一種微生物生態(tài)學(xué)研究技術(shù)，是一種快速且可靠的分析檢測(cè)方法[4]，它是活體微生物細(xì)胞膜的成分且含量相對(duì)穩(wěn)定，具有多樣性和生物學(xué)特異性，易于提取進(jìn)行定性、定量的研究[5]。脂類物質(zhì)是構(gòu)成生物細(xì)胞膜的成分，在細(xì)胞中含量穩(wěn)定，約占細(xì)胞干質(zhì)量的5%[6]。在細(xì)胞中含有脂肪酸的脂類物質(zhì)只有碳水化合物、脂性醇、磷脂和糖脂等，通常這種脂類物質(zhì)的組成和含量在同一種微生物中是穩(wěn)定和可遺傳的[7]。PLFA譜圖分析方法的原理是基于脂類幾乎是所有生物細(xì)胞膜的重要組成成分，不同微生物體內(nèi)磷脂脂肪酸組成和含量水平不同，其含量與結(jié)構(gòu)有著種屬特異性，能夠標(biāo)記某一類或某一種特定微生物的存在，是一類最常見(jiàn)的生物標(biāo)記物[8]。Sherlock MIS微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)是美國(guó)MIDI公司20世紀(jì)90年代研發(fā)出來(lái)的，該系統(tǒng)擁有一套完整的標(biāo)準(zhǔn)化程序，備有圖譜識(shí)別軟件以及迄今為止微生物鑒定系統(tǒng)中最大的數(shù)據(jù)庫(kù)資源，而且操作簡(jiǎn)單、分析周期短，因而該方法在微生物領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[9-12]。因此，本研究采用PLFA分析技術(shù)對(duì)濃香型白酒窖泥中分離篩選出的芽孢桿菌進(jìn)行鑒定，并運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatographymass spectrography，GC-MS）技術(shù)分析分離菌株發(fā)酵產(chǎn)物，以期獲得該微生物對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

窖泥樣品采自瀘州老窖股份有限公司白酒生產(chǎn)窖池，100年窖齡窖池。于窖壁上層（距窖口50 cm）、下層（距窖底50 cm）和窖底（窖池底部）分別取樣，迅速置于冰盒運(yùn)回，4℃保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，121℃滅菌15 min。

液體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 L，121℃滅菌15min。

固體培養(yǎng)基：本地產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高粱。高粱按60目粉碎后加水調(diào)配，以121℃、80 min蒸糧滅菌，冷卻至30℃。

NaCl、氫氧化鈉、濃鹽酸（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；甲醇（色譜純）：德國(guó)Darmstadt公司；正己烷（色譜純）：美國(guó)Fisher Scientific公司；甲基叔丁基醚（色譜純）：瑞典Telia公司。

皂化試劑：45 g氫氧化鈉溶于150 mL甲醇及150 mL蒸餾水；

甲基化試劑：325 mL 6 mol/L的鹽酸加入275 mL甲醇中，混合均勻；

萃取試劑：加200 mL甲基叔丁基醚到200 mL正己烷中，混合均勻；

堿洗滌試劑：10.8 g氫氧化鈉溶于900 mL蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司。ZHWY-103D恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；E200正置生物顯微鏡：尼康正置顯微鏡公司：MLS-3020全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋：北京艾飛博科技有限公司：XMTD水浴鍋：余姚長(zhǎng)豐儀器廠；Supelco 57250-U固相萃取儀：美國(guó)TALBOYS公司；Sherlock MIS微生物鑒定系統(tǒng)：美國(guó)MIDI公司；GC6890氣相色譜儀、GC7890-5975MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物的分離與純化

將窖池上、下、底不同位置的窖泥混合后，從中稱取10g窖泥樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，取稀釋液1 mL涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱。待菌落長(zhǎng)出后對(duì)不同菌落進(jìn)行分離純化，同時(shí)將篩出的不同菌株用斜面保存，并對(duì)其進(jìn)行生化鑒定。

1.3.2 分離菌株P(guān)LFA的提取[13]

將已分離純化待鑒定菌種按照四區(qū)劃線法分別接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)細(xì)菌24 h。挑取培養(yǎng)基上已培養(yǎng)好的第三區(qū)菌落（約40 mg）于10 mL有聚四氟乙烯塞的玻璃瓶中，再通過(guò)皂化、甲基化、萃取、堿洗滌對(duì)菌的磷脂脂肪酸進(jìn)行提取。具體步驟如下：

（1）皂化：稱取40 mg單菌培養(yǎng)物，置于8 mL螺口玻璃管中，加入1 mL皂化試劑，擰緊螺蓋，沸水浴5 min，取出振蕩5～10 s，擰緊螺蓋，繼續(xù)沸水浴25 min；

（2）甲基化：待樣品管冷卻后，加入2 mL甲基化試劑，蓋嚴(yán)振蕩，隨后精確控制（80±1）℃水浴10 min，冷水浴冷卻至室溫；

（3）萃?。涸诶鋮s的樣品管中加入1.25 mL萃取試劑，快速振蕩10 min左右，棄去下層水相；

（4）堿洗滌：在剩余有機(jī)相中加入3 mL堿洗滌試劑，快速振蕩5min左右，振蕩完若靜置后不分層可向其中加幾滴飽和氯化鈉溶液，取2/3上層有機(jī)相置于氣相色譜樣品瓶中，保存于冰箱中待檢。

1.3.3 PLFA鑒定

將待檢樣品置于氣相色譜上進(jìn)行測(cè)定，采用氫火焰離子檢測(cè)器，氣相色譜的各參數(shù)由MIDI-Sherlock微生物鑒定系統(tǒng)調(diào)用。

色譜條件：HP-ULTRAz色譜柱（30.0 m×0.25 mm× 0.25μm）；進(jìn)樣量：1μL，進(jìn)樣口溫度250℃；不分流進(jìn)樣；程序升溫：初始溫度190℃，以10℃/min的速率升溫至285℃，再以60℃/min的速率升溫至310℃?；鹧骐x子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度260℃，氫氣30 mL/min，空氣400 mL/min，尾吹氣：氮?dú)?0 mL/min。

1.3.4 發(fā)酵產(chǎn)物成分分析

先用牛肉膏液態(tài)培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)，當(dāng)菌體長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)再接入發(fā)酵醅中。液體培養(yǎng)溫度條件與固態(tài)一致，液態(tài)為200 r/min搖床振蕩2 d，固態(tài)發(fā)酵10 d（置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵）。發(fā)酵結(jié)束后，取適量固態(tài)發(fā)酵醅樣品進(jìn)行頂空固相微萃取，GC-MS對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析，工作站平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)進(jìn)行成分檢索。

頂空固微相萃取操作過(guò)程：精確量取3 g固態(tài)發(fā)酵樣品于頂空瓶中，將頂空瓶放入全自動(dòng)固相微萃取儀中，55℃平衡10 min后，萃取30 min。

GC-MS的風(fēng)味分析條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（60.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250℃；分流比20∶1；程序升溫：初始溫度40℃，保持1min，以5℃/min的速率升溫至130℃，保持1 min，再以8℃/min的速率升溫至230℃，保持4 min；質(zhì)譜接口溫度：240℃；離子源溫度：200℃；四極桿溫度為150℃；溶劑延遲3 min；離子化方式：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量：70 eV；掃描方式：全掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

本試驗(yàn)從濃香型白酒窖泥中成功分離得到3株細(xì)菌，分別編號(hào)為A1、A2、A3。對(duì)分離純化后的3株菌進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，株菌A1、A2呈白色，A3呈乳白色，且都具有細(xì)菌菌落的形態(tài)特征：濕潤(rùn)、較光滑、較透明、較粘稠、易挑取、質(zhì)地均勻。經(jīng)革蘭氏染色及鏡檢可知，3株菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌。

圖1 分離菌株的菌落形態(tài)（A）及菌體特征（B）Fig.1 Colony morphology(A)and microbial characteristics(B)of isolated strains

2.2 PLFA測(cè)定結(jié)果

通過(guò)皂化、甲基化、萃取、堿洗滌之后，提取3株細(xì)菌的磷脂脂肪酸，運(yùn)用MIDI-Sherlock微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行了菌種鑒定，結(jié)果如表1所示。根據(jù)MIDI微生物鑒定系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)，第一選擇相似性指數(shù)＞0.500，且第一選擇相似性指數(shù)與第二選擇相似性指數(shù)相差＞0.100，則認(rèn)為鑒定成功，其準(zhǔn)確性更高，其結(jié)果為第一選擇；若第一選擇相似性指數(shù)在0.300～0.500，且第一選擇與第二選擇之間的相似性指數(shù)差值＞0.100，則認(rèn)為第一選擇與第二選擇分開(kāi)，鑒定可能成功，其準(zhǔn)確性較低，該菌株為典型菌株；當(dāng)相似性值＜0.300時(shí)，則鑒定不成功[13]。因此，在對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，一般都選用第一相似性指數(shù)＞0.500，且與第二相似性指數(shù)之差＞0.100的結(jié)果為最終結(jié)果。MIDI-Sherlock微生物鑒定系統(tǒng)內(nèi)有大量菌株的磷脂脂肪酸數(shù)據(jù)庫(kù)，且每次用氣相進(jìn)行檢測(cè)時(shí)會(huì)用磷脂脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較分析，因此其結(jié)果是可信的。

表1 MIDI微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of MIDI microbial identification system

由表1可知，3株菌的相似性指數(shù)均＞0.500，所以其結(jié)果是可取的。菌株A1被鑒定為球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaerieus），菌株A2被鑒定為短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis），菌株A3被鑒定為塵埃類芽孢桿菌（Paenibacillus larvae pulvifaciens）。這3株菌雖然在相關(guān)文獻(xiàn)中有介紹，但在發(fā)酵方面研究較少，因此探究其代謝產(chǎn)物對(duì)釀酒微生物的研究有著重要意義。

2.3 代謝產(chǎn)物分析

表2 分離菌株代謝產(chǎn)物分析結(jié)果Table 2 Analysis results of metabolic products of isolated strains

濃香型白酒釀造是典型的固態(tài)發(fā)酵，為了探究分離菌株在白酒釀造過(guò)程中的呈味作用，本研究對(duì)菌株A1、A2和A3進(jìn)行固態(tài)純高粱發(fā)酵，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析其代謝產(chǎn)物，采用色譜工作站對(duì)這3株菌的GC-MS圖譜進(jìn)行自動(dòng)積分，采用歸一化法定性分析代謝產(chǎn)物，其成分分析結(jié)果見(jiàn)表2。

白酒中乙醇和水是其主干成分，比例達(dá)到98%～99%，其他成分由種類多樣的物質(zhì)組成[14]。中國(guó)白酒的微量成分主要為醇類、酯類、酸類、羥基化合物、縮醛、含氮化合物、含硫化合物、呋喃類化合物、酯類化合物、醚類等，酒中的微量成分是決定白酒香氣、口感和風(fēng)格的關(guān)鍵。按照微量成分在白酒中所起作用又分為主體香成分、助香成分、定香成分、矯香成分、放香成分、前香和后香成分、特征成分、骨架成分等。按照微量成分在白酒中的絕對(duì)含量可以分為骨架成分和復(fù)雜成分[16]。

由表2可知，這3株菌的代謝產(chǎn)物中總共有15種白酒風(fēng)味成分，其中醇類7種，酮類物質(zhì)5種，其余的為吡嗪類、酸類、酚類物質(zhì)。這3株菌的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)物都為3-羥基-2-丁酮（乙偶姻），其最高含量達(dá)64.261%，另外還產(chǎn)少量高級(jí)醇、高級(jí)酮等風(fēng)味物質(zhì)。其中球形賴氨酸芽孢桿菌還優(yōu)勢(shì)產(chǎn)2-3-丁二醇，其含量為17.080%，以及微量的乙醇；塵埃類芽孢桿菌產(chǎn)物還有微量2-戊酸，含量為0.164%；類短短芽孢桿菌的產(chǎn)物中還有微量的4-甲基吡嗪，含量為0.051%。在他們的代謝產(chǎn)物中包含有白酒中的主要醇類物質(zhì)異戊醇、異丁醇，他們是白酒醇甜和助香劑的主要物質(zhì)來(lái)源，對(duì)白酒風(fēng)味的形成及促使酒體豐滿、濃厚有重要作用。3-羥基-2-丁酮（乙偶姻）、2-3-丁二醇是4-甲基吡嗪的重要前體物質(zhì)[15]；而吡嗪類化合物具有青椒的香氣和焙烤香；3-羥基-2-丁酮、2-3-丁二醇等羰基化合物對(duì)白酒的香氣起著助香的作用[14]。在這3株菌的代謝產(chǎn)物中含有大量的3-羥基-2-丁酮、2-3-丁二醇，因此可以看出這3株菌的代謝產(chǎn)物對(duì)白酒的香氣起著助香的作用。在白酒的微量成分中，酸類物質(zhì)賦予白酒的豐滿和酸刺激感，是影響后味的主要因素；酯類物質(zhì)使白酒具有水果香氣；愈創(chuàng)木酚等酚類物質(zhì)在白酒中含量不多，但在白酒中起著助香的作用，使酒味綿長(zhǎng)[14]。在這三株菌的代謝產(chǎn)物中，含有微量的2-戊酸、愈創(chuàng)木酚，故可以得出這些菌株對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成有一定的影響。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)傳統(tǒng)的分離方法，從濃香型白酒窖泥中分離得到3株菌，經(jīng)磷脂脂肪酸鑒定后，菌株A1、A2和A3分別被鑒定為球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaerieus）、塵埃類芽孢桿菌（Paenibacillus larvae pulvifaciens）、短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）。分析其代謝產(chǎn)物，主要為醇類、酮類等物質(zhì)，它們作為白酒中的微量成分，對(duì)濃香型白酒風(fēng)味的形成起著放香、助香及調(diào)香的作用。因此，這3株菌對(duì)濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成有一定影響。

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Screening,identification and metabolites analyses ofBacillusin pit mud of Luzhou-flavorBaijiu

LIU Yanmei1,2,WANG Yanli2,3,WANG Wenpeng2,LI Yongbo2,WU Shukun2,LIU Mei2,HUANG Zhiguo2*
(1.Yibin Product Quality Supervision and Inspection Institute,Yibin 644000,China;2.Liquor Making Bio-Technology& Application Key Laboratory of Sichuan Province,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China; 3.The Technical Quality Center of Anhui Gujing Distillery Company Limited,Bozhou 236820,China)

Three strains of bacteria were screened from the pit mud of Luzhou-flavorBaijiu.Through phospholipid fatty acid(PLFA)identification,the strains were identified asLysinibacillus sphaerieus,Brevibacillus brevisandPaenibacillus larvaesubsup.pulvifaciens,respectively.The fermentation products of three strains were analyzed by solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry(SPME-GC-MS).The results showedthatthreestrainshadstrongabilitytoproduceflavorsubstanceswhichhadvariouskinds,mainlyforaromaticcompounds(includingalcoholsand ketones).As the trace components inBaijiu,the aromatic compounds played an putting incense,helping incense and blending incense role in the formation ofBaijiuflavor.Therefore,the metabolic products of three strains had certain effect on the formation of flavor substances in Luzhou-flavorBaijiu. Key words：Luzhou-flavorBaijiu;pit mud;Bacillus;screening;PLFA identification;metabolite analysis

TS261.1

0254-5071（2017）07-0076-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.017

2017-03-14

固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（2015GTY004）；地方高校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201210622014）；瀘州老窖科研獎(jiǎng)學(xué)金項(xiàng)目（131jzk03）

劉燕梅（1988-），女，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)獒劸粕锛夹g(shù)。

*通訊作者：黃治國(guó)（1978-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。