竇雪峰，王 濤，呂 超，韓 倩，曹曉丹，沈元曦，張祖航，洪 煬，傅志強(qiáng)，林矯矯

（1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因SjBAK的初步研究

竇雪峰1,2，王 濤2，呂 超1,2，韓 倩2，曹曉丹2，沈元曦1,2，張祖航2，洪 煬2，傅志強(qiáng)2，林矯矯1,2

（1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增日本吸血蟲凋亡相關(guān)基因BAK（Bcl-2 homologous antagonist/killer），并構(gòu)建重組質(zhì)粒。應(yīng)用Realtime PCR技術(shù)分析在日本血吸蟲非易感宿主大鼠和易感宿主小鼠來源、不同發(fā)育階段蟲體中BAK基因的表達(dá)狀況。結(jié)果顯示，克隆獲得日本血吸蟲（Schistosoma japonicum，Sj）BAK編碼基因SjBAK，其ORF含2142bp，編碼713個(gè)氨基酸，理論分子量為79.3 kDa，理論等電點(diǎn)為4.9。結(jié)構(gòu)域分析表明該基因編碼蛋白具有至少3個(gè)BH結(jié)構(gòu)域，屬于Bcl家族成員。Real-time PCR結(jié)果顯示該基因在大、小鼠來源4個(gè)不同發(fā)育階段蟲體均有表達(dá)，其中大鼠來源蟲體SjBAK的表達(dá)水平都高于小鼠來源蟲體，在感染后32 d和42 d表達(dá)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。由此可推測(cè)日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因SjBAK在血吸蟲生長發(fā)育中可能發(fā)揮重要的作用。

日本血吸蟲；BAK；細(xì)胞凋亡

血吸蟲病嚴(yán)重危害人類的身體健康，給疫區(qū)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來巨大的損失。截止2014年，全國仍有血吸蟲病病人115 614人，發(fā)現(xiàn)釘螺面積324.42 hm2，其中新發(fā)現(xiàn)釘螺面積531.13 hm2[1]，我國血吸蟲病防治仍是一項(xiàng)復(fù)雜、艱巨的任務(wù)。

目前我國血吸蟲病防控采用的主要策略是控制傳染源，吡喹酮是目前唯一大規(guī)模使用的血吸蟲病治療藥物，但長期大規(guī)模單一用藥可能導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生，研究人員已在小鼠動(dòng)物模型中誘導(dǎo)出耐藥性蟲株[2]。近年來，血吸蟲基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等研究的廣泛開展[3-5]，為血吸蟲的防治工作奠定了更好的基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種表現(xiàn)形式，在多細(xì)胞生物體內(nèi)重塑組織活性和細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用，對(duì)于維持多細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[6]，以及正常的生理過程，如機(jī)體的發(fā)育、免疫穩(wěn)定、抵御病毒入侵和防止細(xì)胞癌變等方面都有著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期鑒定了14個(gè)日本血吸蟲（Schistosoma japonicum，Sj）凋亡相關(guān)基因，包括SjAIF、SjAPAF1、SjATM、SjBcl-2、Sjtnfr、Sjbak、SjIAP、Sjbax、Sjcaspase3、Sjcaspase7、Sjcaspase9、SjCIAP、SjCYT-C、SjP53。收集易感宿主小鼠和非易感宿主大鼠的日本血吸蟲蟲體，對(duì)上述14個(gè)基因的表達(dá)狀況進(jìn)行了比較分析，初步結(jié)果表明，一些凋亡相關(guān)基因在大、小鼠來源日本血吸蟲蟲體的差異表達(dá)可能是影響血吸蟲生長發(fā)育的重要原因之一[7]。本研究對(duì)在大鼠來源蟲體呈高表達(dá)的凋亡相關(guān)基因SjBAK（Bcl-2 homologous antagonist/killer）進(jìn)行了克隆，對(duì)大、小鼠來源不同發(fā)育階段蟲體中該基因的表達(dá)狀況進(jìn)行了比較分析，構(gòu)建了SjBAK基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，為深入探討SjBAK基因在血吸蟲生長發(fā)育中的作用提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和酶 Trizol、SuperscriptTMIII反轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司；Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T載體、pET-28a質(zhì)粒、限制性內(nèi)切酶、PrimeScriptTMRT-PCR Kit、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ、EASY Dilutio均購自TaKaRa生物工程（大連）有限公司；DNA純化回收試劑盒、小型質(zhì)粒回收試劑盒購自Axygen公司；大型質(zhì)粒純化回收試劑盒購自QIAGEN公司。

1.1.2 生物材料 DH5a和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物有限公司；日本血吸蟲蟲體和陽性釘螺由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所血吸蟲病實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 用日本血吸蟲尾蚴感染BALB/c小鼠和Wistar大鼠，分別于感染后d 14、23 、32、42解剖動(dòng)物，通過灌注法收集蟲體并保存于液氮待用。分別取感染后不同時(shí)期的蟲體約150 mg，按照Trizol試劑盒說明書提取蟲體總RNA，利用SuperscriptTMIII反轉(zhuǎn)錄酶將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 SjBAK基因的克隆 根據(jù)日本血吸蟲SjBAK基因（GenBank登錄號(hào)：FN318787.1）序列設(shè)計(jì)特異引物F1（與ORF的1-26位核苷酸一致）和R1（與ORF的2119-2142位核苷酸反向互補(bǔ)），引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，序列見表1。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 3 min；94℃變性 30 s，56℃退火20 s，72℃延伸 2.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸1 min，4℃終止反應(yīng)并保存。

1.2.3 重組質(zhì)粒pMD19-T-SjBAK的構(gòu)建 按照DNA純化試劑盒的操作步驟純化擴(kuò)增到的目的片段，將其連接至pMD19-T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑單個(gè)菌落接種到LB培養(yǎng)液培養(yǎng)，按照試劑盒操作提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行雙酶切鑒定，將陽性質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用ORF FINDER（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.htmL）在線分析尋找開放閱讀框（open reading frame，ORF）；將序列進(jìn)行BLASTX（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/）比對(duì)尋找同源基因；利用Primer Premier 5軟件進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析和理論編碼蛋白質(zhì)序列分析；利用NCBI和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線分析尋找結(jié)構(gòu)域；利用MEGA6軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用ProtParam tloo（http:// web.expasy.org/protparam/）在線分析氨基酸殘基組成、數(shù)目，蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)。

1.2.5 熒光定量PCR分析SjBAK在不同期別蟲體中的表達(dá)情況 分別提取日本血吸蟲尾蚴感染后14、23、32、42 d蟲體的總RNA，按照TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄日本血吸蟲各時(shí)期蟲體的cDNA。以日本血吸蟲SjNADH基因?yàn)閮?nèi)參，各時(shí)期日本血吸蟲cDNA為模板，并利用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ酶進(jìn)行熒光定量PCR分析，設(shè)3次獨(dú)立重復(fù)。SjBAK熒光定量PCR引物（F2和R2）序列和日本血吸蟲SjNADH內(nèi)參引物（F3和R3）序列見表1。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1 PCR和RT-PCR引物Table 1 Primers used for PCR and RT-PCR

1.2.6 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-SjBAK的構(gòu)建 取100 μL經(jīng)測(cè)序鑒定正確的pMD19-T-SjBAK/ DH5α菌液，接到5 mL加有氨芐抗生素的LB中，37℃、250 r/min過夜培養(yǎng)。收集菌液并抽提質(zhì)粒。用BamHⅠ和Hind III酶對(duì)重組質(zhì)粒pMD19-T-SjBAK與空載體pET-28a(+)進(jìn)行雙酶切，回收純化酶切產(chǎn)物，16℃連接過夜。取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入宿主菌BL21并涂板，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~16 h后，挑取單個(gè)克隆，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定（方法步驟同前）。將電泳結(jié)果鑒定為陽性的質(zhì)粒送公司測(cè)序。用Clustalx軟件分析測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 日本血吸蟲促凋亡基因SjBAK的克隆及生物信息學(xué)分析

2.1.1 日本血吸蟲SjBAK基因的克隆 以日本血吸蟲42 d蟲體cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，在2000 bp和3000 bp之間得到1條DNA片段，接近預(yù)期大小2142 bp（圖1）。

圖1 SjBAK基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplif cation of SjBAK of S. japonicum by PCRM: DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) (DL 5000); 1~4: SjBAKM: DNA Marker (DL 5000); 1-4: SjBAK

2.1.2 日本血吸蟲促凋亡基因SjBAK基因的生物信息學(xué)分析 利用ORFFINDER分析表明其開放閱讀框?yàn)?142 bp，編碼713個(gè)氨基酸，推測(cè)該蛋白分子量為79.3 kDa，理論等電點(diǎn)為4.9。利用SignalP（www. cbs.dtu/ services/ Singnalp）在線軟件預(yù)測(cè)，SjBAKA蛋白1-22個(gè)氨基酸是信號(hào)肽（圖2）。利用TMHMM ServerV2.0在線軟件預(yù)測(cè)SjBAKA基因長度為2142 bp，無跨膜區(qū)（圖3）。結(jié)構(gòu)域分析該基因編碼蛋白具有至少3個(gè)BH結(jié)構(gòu)域，BH結(jié)構(gòu)域與Bcl-2屬于同源結(jié)構(gòu)域，因此屬于Bcl家族成員，如圖4所示。

2.2 Real-time PCR檢測(cè)SjSjBAK在不同時(shí)期日本血吸蟲蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平 Real-time PCR結(jié)果分析表明，SjBAK基因在大、小鼠來源4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的日本血吸蟲蟲體中均有表達(dá)，在14 d蟲體中表達(dá)量最高，42 d蟲體中表達(dá)量最低。在4個(gè)測(cè)試的不同發(fā)育階段蟲體中，大鼠來源蟲體SjBAK的表達(dá)水平都高于小鼠來源蟲體，其中32 d和42 d蟲體表達(dá)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。大鼠來源的14 d、23 d和32 d蟲體中基因表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但都顯著高于大鼠42 d蟲體的表達(dá)水平。小鼠來源SjBAK相對(duì)表達(dá)量隨著蟲體的生長發(fā)育逐漸降低，其中14 d和42 d表達(dá)水平差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），14 d和23 d蟲體的SjBAK表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而從32 d開始，表達(dá)量開始明顯下降（圖5）。

圖2 SjBAK蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of signal peptide of SjBAK protein

圖3 SjBAK蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of transmembrane region of SjBAK protein

圖4 SjBAK結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)Fig 4 Prediction of the functional domain of SjBAK protein

圖5 SjBAK在蟲體不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析Fig. 5 Analysis of SjBAK expressions in different development stages of S. japonicum by Real-time RT-PCR

3 討論

日本血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生的人畜共患寄生蟲病，目前尚無有效的疫苗[8]。本實(shí)驗(yàn)室前期在探討東方田鼠抗日本血吸蟲感染機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡可能是東方田鼠清除日本血吸蟲的機(jī)制之一[9]。

日本血吸蟲可感染40余種哺乳動(dòng)物，但不同動(dòng)物對(duì)血吸蟲感染的易感性呈現(xiàn)較大的差別，如小鼠屬血吸蟲的易感宿主，血吸蟲感染小鼠后蟲體發(fā)育率在50%~60%之間，蟲體大，發(fā)育完全，雌蟲產(chǎn)卵量大。而相對(duì)小鼠，大鼠屬血吸蟲非易感宿主，血吸蟲感染大鼠后蟲體發(fā)育率只有10%左右，蟲體小，發(fā)育不如小鼠來源蟲體完全，雌蟲產(chǎn)卵量少。前期研究表明在血吸蟲的生長發(fā)育中一些凋亡相關(guān)分子起著重要的作用[9-11]。彭金彪等[11]研究發(fā)現(xiàn)在血吸蟲適宜性宿主小鼠、非適宜宿主大鼠和抗性宿主東方田鼠來源的10 d童蟲中，一些凋亡相關(guān)基因呈現(xiàn)明顯的差異表達(dá)，可能是影響日本血吸蟲生長發(fā)育的重要因素之一。本文對(duì)收集自非易感宿主大鼠和易感宿主小鼠日本血吸蟲蟲體促凋亡相關(guān)基因SjBAk的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明大鼠來源4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期蟲體SjBAk基因的表達(dá)水平都明顯高于小鼠來源蟲體，提示SjBAk的表達(dá)差異可能是影響日本血吸蟲在大鼠和小鼠體內(nèi)生長發(fā)育差異的因素之一。日本血吸蟲感染后22~24 d卵殼形成并開始排卵，胚胎期蟲卵于感染后28~29 d出現(xiàn)，感染后34 d達(dá)到高峰。成熟期蟲卵于感染后36 d出現(xiàn)，感染45~50 d達(dá)到高峰。小鼠來源的血吸蟲雌蟲產(chǎn)卵量要明顯高于大鼠來源雌蟲。本研究結(jié)果也顯示，大、小鼠來源血吸蟲蟲體SjBAk的表達(dá)差異在發(fā)育后期的32 d和42 d比早期的14 d和23 d明顯，提示SjBAk可能在血吸蟲卵胚發(fā)育、卵成熟等方面對(duì)蟲體產(chǎn)生更顯著的影響。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Bcl-2蛋白家族成員是細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要調(diào)控因子。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的差異，Bcl-2蛋白家族成員被分為多結(jié)構(gòu)域蛋白（BH1、BH2、BH3、BH4）和僅有BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白，其中多結(jié)構(gòu)域蛋白又依據(jù)不同功能分為促凋亡蛋白和凋亡抑制蛋白兩類，而僅含有BH3蛋白的具有促凋亡功能。多結(jié)構(gòu)域凋亡抑制蛋白主要有Bcl-2、BclxL、Bcl-w、Mcl-1和Bfl-1，多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白主要是Bax和Bak。促凋亡蛋白是細(xì)胞凋亡程序中不可或缺的組分。凋亡抑制蛋白（Bcl-2）通過疏水性裂縫結(jié)合到促凋亡蛋白質(zhì)雙親性α螺旋結(jié)構(gòu)域BH3能夠使促凋亡蛋白喪失生理功能[12]。很多僅有BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白能夠應(yīng)答細(xì)胞受到的刺激，通過激活Bak 和Bax直接誘導(dǎo)凋亡，或通過阻斷促凋亡蛋白和凋亡抑制蛋白之間相互結(jié)合間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞受到死亡信號(hào)刺激時(shí)，僅有BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白會(huì)被激活，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。凋亡信號(hào)通路一旦激活，Bax/Bak寡聚物就會(huì)在線粒體外膜表面形成多孔結(jié)構(gòu)（膜通道孔）使線粒體的通透性增加，線粒體釋放凋亡因子如細(xì)胞色素C，并與胞質(zhì)中的APAF-1結(jié)合形成凋亡復(fù)合物（apoptosome），凋亡復(fù)合體能夠誘導(dǎo)蛋白酶（caspase）分解細(xì)胞。SjBAK是一多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白，可能參與血吸蟲凋亡的過程，在血吸蟲生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

Lee等[13]分析發(fā)現(xiàn)血吸蟲存在Bcl-2家族相關(guān)基因，這些基因涉及多結(jié)構(gòu)域成員和單結(jié)構(gòu)域（BH3）成員，其中多結(jié)構(gòu)域成員SjA具有類BAK/ BAX功能，推測(cè)日本血吸蟲也存在Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)通路。結(jié)果分析表明BH3類似物可與Bcl-2蛋白相互作用，從而抑制BCL-2蛋白的抑凋亡作用。

至今，有關(guān)血吸蟲BAK的生物學(xué)功能尚不完全清楚，本文克隆了日本血吸蟲SjBAK基因，構(gòu)建了SjBAk的重組表達(dá)質(zhì)粒，驗(yàn)證了SjBAK在大、小鼠來源的不同發(fā)育階段的日本血吸蟲蟲體中均有表達(dá)，且該基因在不同發(fā)育階段蟲體和不同宿主來源蟲體呈差異表達(dá)，可能與血吸蟲的生長發(fā)育相關(guān)。這些將為深入探討該基因在血吸蟲生長發(fā)育中的作用，評(píng)估SjBAk作為血吸蟲治療藥物靶標(biāo)或疫苗候選分子的潛力提供基礎(chǔ)。

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A PRELIMINARY STUDY ON APOPTOSIS ASSOCIATE GENES SJBAK OF SCHISTOSOMA JAPONICUM

DOU Xue-feng1,2, WANG Tao2, LV Chao1,2, HAN Qian2, CAO Xiao-dan2, SHEN Yuan-xi1,2, ZHANG Zu-hang2, HONG Yang2, FU Zhi-qiang2, LIN Jiao-jiao1,2

(1. College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234 China 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai, 200241 China)

The objectives of the present study were to clone the apoptosis related gene of Schistosoma japonicum SjBAK(Bcl-2 homologous antagonist/killer), analyze its expression in schistosome worms and possible role in the development of schistosome. The full-length sequence of SjBAK was cloned in PCR and the recombinant plasmid containing SjBAK was constructed. The expression of SjBAK in S. japonicum at different development stages from non-susceptible host rats and susceptible host mice were analyzed using Real-time PCR. The ORF of the SjBAK gene contained 2142 bp encoding 713 amino acids with the theoretical molecular weight of 79.3 kDa and theoretical isoelectric point at 4.9. Analysis also revealed that the molecule possessed at least three BH domains and belonged to the member of Bcl family. Real-time PCR analysis showed that the gene expressed in all worms at four development stages and the expression level in worms from rats was higher than those from mice. Signif cant difference in SjBAK expression was observed in worms from two different hosts at 32 d and 42 d post-infection(P<0.05). In conclusion, the apoptosis-related gene SjBAK of S japonicum may play an important role in the development of Schistosome.

Schistosoma japonicum; BAK ; apoptosis

S852.735

A

1674-6422（2017）03-0068-05

2016-11-14

國家自然科學(xué)基金（81271871）

竇雪峰，女，碩士研究生，動(dòng)物學(xué)專業(yè)

林矯矯，E-mail：jjlin@shvri.ac.cn