段旭彤，榮廣玉，田巧珍，申偉霞，李雪松，陳鴻軍，劉芹防，楊健美，滕巧泱，趙 凱，李澤君

（1.黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

H3N2亞型犬流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立

段旭彤1,2，榮廣玉1,2，田巧珍2，申偉霞2，李雪松2，陳鴻軍2，劉芹防2，楊健美2，滕巧泱2，趙 凱1，李澤君2

（1.黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

H3N2亞型犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）可以在犬中迅速的傳播，甚至引起犬的死亡，也可感染其他哺乳動物。目前該病毒致病的分子機制尚不清楚。為此，本研究采用RT-PCR技術(shù)擴增犬流感病毒A/Canine/Zhejiang /01/2010（H3N2）（簡稱ZJ2010）的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS 8個基因片段，并分別克隆至雙向表達載體pBD上。采用8質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后加入TPCK胰酶作用2 h，將上清和細胞一同接種9~11日齡SPF雞胚，并檢測血凝效價。結(jié)果顯示，本研究成功拯救獲得了病毒株rZJ2010。rZJ2010株的8個基因片段的序列均與親本ZJ2010株的序列相同。rZJ2010株與ZJ2010株在鼠的肺和鼻中復(fù)制水平接近。這些結(jié)果證實，本研究已成功建立H3N2亞型犬流感病毒反向株遺傳操作系統(tǒng)，為該病毒的致病機理、傳播機制以及跨宿主傳播機制研究等奠定了技術(shù)平臺。

犬流感病毒；H3N2亞型；反向遺傳操作系統(tǒng)

犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV），屬于正粘病毒科，A型流感病毒屬。犬流感病毒直徑大小為80~120 nm，形態(tài)呈現(xiàn)多樣性，具有脂質(zhì)雙層囊膜，膜表面具有致密的纖突結(jié)構(gòu)。CIV屬于單股負鏈RNA病毒，其核酸不具有感染能力，可分為8個相對分子質(zhì)量不同的節(jié)段[1,2]。近幾年，越來越多的流感病毒可以引起犬的感染，可以分為H3N8亞型、H3N2亞型、H5N1亞型、H1N1亞型以及H5N2亞型[3,4]。

目前在犬中流行的兩種主要流感病毒為2004年在美國分離到的H3N8亞型CIV以及2007年在韓國分離的禽源H3N2亞型CIV[5]。目前，我國主要流行的是H3N2 亞型CIV，該病毒可以在犬中迅速的傳播，能引起咳嗽、流涕、發(fā)熱、呼吸困難等呼吸系統(tǒng)疾病臨床癥狀，且偶爾會出現(xiàn)繼發(fā)性并發(fā)癥，如重癥肺炎[6-8]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該H3N2亞型CIV可通過空氣傳播方式感染犬，且引起其他的哺乳動物，如鼠和豚鼠的感染[9]。鑒于犬與人的親密伴侶關(guān)系，H3N2亞型犬流感可能極大地威脅著人類健康。目前，H3N2亞型CIV致病的分子機制尚不清楚。為此，本研究建立了1株H3N2亞型犬流感病毒[A/ Canine/Zhejiang/01/2010（H3N2）（簡稱ZJ2010）]的反向遺傳操作系統(tǒng)，為研究犬流感病毒的致病機理及其傳播機制等奠定了技術(shù)平臺。

1 材料和方法

1.1 病毒、細胞、SPF雞胚以及實驗動物 H3N2亞型犬流感病毒ZJ0110由本實驗室分離和保存；293T細胞使用含10%FBS的opti-MEM培養(yǎng)液并放在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；雙向表達載體pBD由本實驗室提供；SPF雞胚購自北京梅里亞維通試驗動物技術(shù)有限公司，并由本實驗室自行孵化；BALB/c實驗小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒和轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）試劑盒購自TaKaRa公司；Pfx高保真DNA聚合酶購自Invitrogen公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自AXYGEN公司；Klenow大片段酶、BspQI 酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購自NEB公司；感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自北京全式金公司；OPTI-MEM培養(yǎng)液購自Thermo公司；轉(zhuǎn)染試劑Mirus購于MIRUS公司；引物由蘇州金維智生物公司合成。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)CIV 8個基因序列，設(shè)計A型流感病毒通用性擴增引物及流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物12 bp（表1），由蘇州金維智生物公司合成。

表1 H3N2亞型犬流感病毒擴增引物Table 1 The primers of H3N2 CIV in this paper

1.4 病毒RNA的提取及RT-PCR擴增 根據(jù)RNeasy Mini Kit（QIAGEN公司）說明書，從SPF雞尿囊液中提取病毒總RNA，利用流感病毒通用的12 bp引物反轉(zhuǎn)錄得到病毒cDNA，并以cDNA為模板，用Pfx高保真DNA聚合酶擴增病毒的 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS 八個基因片段。

1.5 質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及純化 8個基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%凝膠電泳后，切下目標條帶，并按照Gel Extraction Kit（Axygen，USA）說明書進行產(chǎn)物回收純化。其中PB2、PB1、PA和HA基因用T4 DNA連接酶處理。體系如下：PCR純化產(chǎn)物20 μL、10×T4 Polymerase buffer 5μL、dCTP 5μL、dTTP 5μL、100×BSA 0.5 μL、T4 聚合酶 1μL，滅菌ddH2O補至50 μL；反應(yīng)條件：12℃作用30 min、75℃作用20 min。pBD 載體經(jīng) BspQ Ⅰ酶切回收后，在含有2 μL dATP 和2 μL dGTP存在的條件下，用Klenow大片段分別于25℃作用25 min、75℃作用20 min?；蚱闻c pBD 載體在 T4 DNA連接酶的作用下16℃連接過夜。NP、NA、M和NS基因的PCR純化產(chǎn)物經(jīng) BspQ Ⅰ酶切后，與同樣酶切的PBD載體鏈接。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，具體步驟如下：冰浴20 min，42℃熱激45 s，純化回收以上并置于冰上冰浴2 min；隨后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物放入無氨芐青霉素LB的培養(yǎng)液中，搖菌45~60 min；取100 μL 菌液涂布于含有氨芐青霉素（50 μg/mL）LB 平板上。37℃培養(yǎng)12 h，挑取白色孤立菌落，接種于2 mL含有氨芐青霉素（50μg/mL）液體LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)8 h。通過菌液PCR確定陽性克隆，并將菌液送美吉測序公司進行序列鑒定。序列正確的菌液，使用Hispeed Midi Plasmid kit（QIAGEN）抽提質(zhì)粒。

1.6 拯救病毒 293T細胞傳代培養(yǎng)在直徑3.5 cm的平板上。待細胞長至70%~80%時，進行轉(zhuǎn)染，具體步驟如下：將250 μL不含有FBS的opti-MEM培養(yǎng)液分別加入兩個無菌的EP管中，構(gòu)建的8個質(zhì)粒分別按照每個質(zhì)粒均1.0 μ g加入EP管中，混勻。將24 μL Mirus轉(zhuǎn)染試劑加入到另一管250 μL的opti-MEM中，混合并作用5 min后，將兩個溶液混合，靜止30 min；將混合液輕輕加入到用PBS清洗2次的293T細胞上并補加溶液至2 mL；培養(yǎng)48 h后，加入2 μL的TPCK胰酶，作用2 h后將細胞上清及細胞混合液接種到9~11日齡的SPF雞胚，0.5 mL/枚，37℃繼續(xù)孵化48 h后，進行血凝（Hemagglutination，HA）試驗；收集血凝效價為陽性的尿囊液，分裝并放置于-80℃保存，拯救病毒命名為rZJ2010。

1.7 獲救病毒的全基因測序 使用RNeasy Mini Kit試劑盒，提取獲救病毒尿囊液RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用PCRmix（TaKaRa，中國）以及流感特異性擴增引物（表1）擴增出病毒的8個基因片段。具體體系以及PCR程序如下：2×PCRmix 12.5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 2μL，滅菌ddH2O補至25 μL；94℃預(yù)變性30 min后，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，循環(huán)30次，72℃ 延伸10 min。膠回收純化PCR產(chǎn)物，并送美土測序公司進行測序。使用DNAStar的Seqman軟件對獲救病毒rZJ2010株與親本病毒ZJ2010株的序列進行比對分析。

1.8 小鼠致病性試驗 為了研究親本病毒ZJ2010株與拯救病毒H3N2亞型CIV對哺乳動物致病力是否存在差異，開展了這兩株病毒的小鼠致病性試驗。將4周齡BALB/c小鼠隨機分成3組，即ZJ2010組、rZJ2010組以及空白對照組，每組各3只小鼠。使用干冰麻醉小鼠后，經(jīng)鼻腔接種50 μL含 106半數(shù)雞胚感染劑量（50% egg infective dose，EID50）的病毒。攻毒后4 d，每組剖殺3只，取鼻甲和肺用于病毒滴定，并進行無害化處理。

1.9 病毒滴定 將小鼠組織中加入1 mL含有1000 U雙抗PBS，并使用樣品組織研磨機70HZ研磨90 s。研磨后，以4℃、10 800×g的條件下離心15 min。取上清，并用無菌PBS進行10倍系列稀釋，將不同稀釋度的組織研磨液分別經(jīng)尿囊腔接種3枚9~11日齡SPF雞胚，每個雞胚接種100 μL，37℃孵化48 h后測定血凝效價，利用 Reed-Muench 法計算EID50。

2 結(jié)果

2.1 親本毒各基因片段擴增 RT-PCR擴增了H3N2亞型CIV ZJ0110株的8個基因片段。經(jīng)1%的瓊脂糖電泳鑒定，得到的產(chǎn)物大小與相應(yīng)的基因大小一致（見圖1）。PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因大小分別為2341、2341、2233、1765、1565、1473、1027、890 bp。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及病毒拯救 pBD載體通過BspQ Ⅰ酶切并電泳割膠回收后，濃度為68 ng/μL，隨后將其用Klenow處理，割膠回收后濃度為57 ng/ μL。擴增的目的基因片段用T4 DNA polymerase分別與pBD載體過夜連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。通過挑取菌落進行菌液PCR后，獲得陽性質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定正確后，擴大培養(yǎng)。得到序列正確的8個質(zhì)粒。測序結(jié)果表明這8個質(zhì)粒所插入的目的片段序列完全正確。將這8個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后，成功獲得了拯救病毒rZJ0110。其血凝效價為27，見圖2。

圖1 H3N2 CIV ZJ0110 株 8 個基因片段的 RT-PCR 擴增Fig.1 Amplif cation of eight gene segments from H3N2 CIV ZJ011 strain by RT-PCRM: DNA分子量標準(DL2000); 1: PB1基因; 2: PB2基因; 3: PA基因; 4: HA基因; 5: NP基因; 6: NA基因; 7: M基因; 8: NS基因M: DNA Marker(DL2000); 1: PB1 gene; 2: PB2 gene; 3: PA gene; 4: HA gene; 5: NP gene; 6: NA gene; 7: M gene; 8: NS gene

圖2 CIV親本毒株ZJ0110以及拯救病毒rZJ0110株血凝效價對比Fig.2 The comparision of hemagglutination titers between CIV ZJ0110 strain and the rescued virus rZJ0110 strain

2.3 拯救病毒rZJ0110株序列的鑒定 提取獲救病毒的雞胚尿囊液中的RNA，以流感病毒通用的12 bp引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并用H3N2亞型犬流感病毒擴增引物（表1）進行各基因的RT-PCR擴增，并進行序列測定。通過比對，獲救毒株與親本毒ZJ0110的各基因片段序列完全一致。

2.4 小鼠組織病毒分離滴定 親本病毒ZJ0110株和拯救的病毒rZJ0110株分別感染小鼠，感染d 4時，采集鼠的肺臟組織和鼻甲骨進行病毒滴定。結(jié)果顯示，在肺臟和鼻甲骨中均能分離到ZJ0110株和rZJ0110株病毒，通過方差分析得出病毒ZJ0110株和rZJ0110株EID50差異不具備統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖3）。

圖3 感染親本病毒ZJ0110株和拯救病毒rZJ0110株后小鼠肺臟和鼻甲骨中病毒滴度Fig.3 The virus titer in lungs and nasal turbinates of mice infected with ZJ0110 strain and rZJ0110 strain

3 討論

2007年，在韓國犬群中暴發(fā)了嚴重的呼吸道疾病，并從其中3只犬的鼻腔分泌物中分離到了H3N2亞型犬流感病毒，并已經(jīng)證明H3N2亞型流感病毒可以在犬之間傳播[10,11]。在我國也發(fā)現(xiàn)了H3N2亞型流感病毒在犬中傳播，通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，與韓國2007年分離的H3N2亞型犬流感病毒8個基因親緣關(guān)系接近，同時各基因與禽流感的核苷酸同源性高達94.7%~98.3%，說明禽源犬流感已經(jīng)進入中國。研究表明H3N2亞型犬流感病毒在中國、韓國和泰國等亞洲地區(qū)的犬群中廣泛流行[12]。2015年，美國芝加哥約5000只犬感染H3N2亞型犬流感病毒，進一步證明犬流感由亞洲流行區(qū)域已經(jīng)逐漸擴大到北美洲，并在犬類中感染與傳播[3]。2010年，韓國報道稱，在貓的身上分離到的病毒8個基因片段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS）與H3N2亞型犬流感病毒基因幾乎相同。這說明H3N2亞型犬流感病毒已經(jīng)可以跨宿主傳播[13-15]。2009~2012年，在中國大陸陸續(xù)分離到了犬流感病毒，通過感染實驗發(fā)現(xiàn)這些犬流感病毒可以使犬發(fā)病，但很少導(dǎo)致犬類死亡，同時分離自犬的流感病毒不僅能感染犬，還能感染小鼠和豬，但不能感染雞和鴨[16]。表明H3N2犬流感病毒已經(jīng)完全適應(yīng)了哺乳動物，成功地實現(xiàn)了跨宿主傳播，同時存在新的哺乳動物之間跨宿主傳播的風(fēng)險。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的H3N2亞型犬流感病毒與人流感病毒pandemic influenza H1N1可以進行重配，如2012年，在韓國分離到1株新型的H3N1犬流感病毒，通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析后發(fā)現(xiàn)該病毒HA基因與H3N2亞型犬流感病毒HA基因相似度可以達到99.6%，而其他的7個基因片段與2009年甲型H1N1流感病毒的相似程度可以達到99.1%~99.9%[17]。而2014年發(fā)現(xiàn)的1株病毒則由2009年甲型H1N1流感病毒M基因和H3N2其他7個基因組成的重配犬流感病毒[18]。上述發(fā)現(xiàn)表明H3N2亞型犬流感病毒與甲型H1N1流感病毒的重配，有可能導(dǎo)致人際間流感大流行。

犬類作為與人類生活息息相關(guān)的動物，由于密切接觸，很可能導(dǎo)致人類感染H3N2亞型流感病毒，因此，進一步對該病毒的流行狀況、致病機制進行深入的研究顯得尤為重要。同時如何更好的防控犬流感病毒流行，對公共安全具有重要的意義。本研究成功構(gòu)建了H3N2亞型犬流感病毒毒株的8質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)，從293T細胞中成功拯救了重組病毒。rZJ0110株經(jīng)鑒定各基因片段的序列與原始病毒相應(yīng)序列完全一致，且對鼠的致病性也是相似的。這些結(jié)果皆表明，本研究所建立的H3N2亞型犬流感反向遺傳操作系統(tǒng)為進一步研究病毒復(fù)制裝配機制、病毒變異機制、致病力、種間傳播分子機制奠定了基礎(chǔ)，同時也為犬流感新型疫苗的研制開辟了新的途徑。

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ESTABLISHMENT OF REVERSE GENETICS SYSTEM FOR H3N2 SUBTYPE CANINE INFLUENZA VIRUS

DUAN Xu-tong1,2, RONG Guang-yu1,2, TIAN Qiao-zhen2, SHEN Wei-xia2, LI Xue-song2, CHEN Hong-jun2, LIU Qin-fang2, YANG Jian-mei2, TENG Qiao-yang2, ZHAO Kai1, LI Ze-jun2

(1.Heilongjiang University, Harbin 150080, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

H3N2 Canine influenza virus (CIV) can spread quickly among dogs and even causes death. Moreover, CIV infects other mammals. At present, the molecular mechanism of CIV is not clear. In the present study, RT-PCR technique was used to amplify 8 genes (PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M and NS) of A/Canine/Zhejiang /01/2010(H3N2) (ZJ0110), and the resulting products were then cloned into the two-way expression vector pBD. These 8 recombinant plasmids were co-transfected into 293T cells that were treated with TPCK trypsin at 48 h post-transfection. The supernatant and transfected 293T cells were inoculated into 9-day-old specif c pathogen free (SPF) chicken embryonated eggs. The rescued viruses were identif ed in hemagglutination assay (HA). The virus strain (rZJ2010) was sequenced for the above 8 genes and found they were identical to those of its parent virus ZJ2010. The replication of rZJ2010 in the lungs and nasal turbinates of mice were similar to that of ZJ2010. These results indicated that the reverse genetics system of H3N2 subtype Canine inf uenza virus was established as a technological platform for further research on the molecular mechanism, pathogenicity and interspecies transmission of Canine inf uenza viruses.

Canine inf uenza virus; H3N2 subtype; reverse genetics system

S852.659.5

A

1674-6422（2017）03-0007-05

2016-11-09

國家自然科學(xué)基金項目（31302115，31472206）; 國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0500204）;上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目（滬農(nóng)科攻字（ 2015字）第1-11字號）

段旭彤，女，碩士研究生，微生物學(xué)專業(yè)；榮廣玉，男，碩士研究生，微生物學(xué)專業(yè)

李澤君，E-mail：lizejun@shvri.ac.cn；趙凱，E-mail：zybin395@126.com；滕巧泱，E-mail：tengqy@shvri.ac.cn