吳巧梅，李傳峰，丁明洋，朱 杰，譚永貴，李 琦，劉光清，陳宗艷

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

鵝呼腸孤病毒GRV-LA16株的分離鑒定

吳巧梅，李傳峰，丁明洋，朱 杰，譚永貴，李 琦，劉光清，陳宗艷

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

為探明安徽省某養(yǎng)鵝場60日齡鵝出現(xiàn)的軟腳，排白色糞便，嚴重者導致鵝死亡的原因，對病死鵝進行剖檢，發(fā)現(xiàn)其以肝臟腫大，脾臟腫大和壞死以及肺臟充血、出血為主要特征。對分離毒株進行RT-PCR擴增試驗、序列分析及動物回歸試驗，結(jié)果表明，該分離毒株為鵝呼腸孤病毒（Goose reovirus，GRV），命名為GRV-LA16株，其ELD50為10-5.7/0.2 mL。病理組織切片結(jié)果顯示，與對照組相比，肺泡壁脹破融合，毛細血管擴張出血，且肺泡腔有紅色絲網(wǎng)狀纖維素滲出物。σC基因測序結(jié)果分析表明，其與鴨呼腸孤病毒σC基因同源性為87%。GRV-LA16與鴨呼腸孤病毒親緣關系較近，為同一拓撲群，而與經(jīng)典的禽呼吸腸孤病毒（Avian orthoreoviruses，ARV）、GRV、番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）處于不同拓撲群。

鵝呼腸孤病毒；分離鑒定; σC基因

禽呼腸孤病毒（Avian orthoreoviruses，ARV）為呼腸孤病毒科（Reoviridae）正呼腸孤病毒屬（Orthoreovirus）的成員之一，可感染多種禽類[1]，包括雞、火雞、鴕鳥、水禽、野鴨等禽類，能引起雞的吸收障礙綜合征、腱鞘炎、病毒性關節(jié)炎、矮小綜合征、免疫抑制等疾病[2,3]，現(xiàn)已成為危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一。就水禽而言，有引起鴨發(fā)病的呼腸孤病毒（Duck reovirus，DRV）[4]，引起番鴨發(fā)病的呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）[5,6]，近年也有引起鵝發(fā)病的呼腸孤病毒（Goose reovirus，GRV）報道[7]。

禽類呼腸孤病毒基因組由分節(jié)段的10個基因片段組成。其中，S1基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白為σC蛋白。σC蛋白是由326個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)蛋白，分子量大小約為35 kDa，具有高度變異性的特征，因此σC基因序列特征可以為分析不同呼腸孤病毒毒株來源提供參考依據(jù)[1,8]。

目前，在我國安徽省某鵝場的鵝出現(xiàn)部分死亡，其臨床表現(xiàn)為發(fā)病鵝排白色稀糞、軟腳，剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟出血、呈土黃色、部分發(fā)病鵝肝臟上可見黃白色壞死灶，脾臟腫大、出血、呈暗紅色，腎臟腫大、出血。本研究通過對采集的病料進行病原分離與鑒定、序列分析及動物回歸實驗，證實病原體為鵝呼腸孤病毒。

1 材料與方法

1.1 材料 病料采集于安徽省某養(yǎng)鵝場；BHK-21細胞為本實驗室保存；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.2 試劑 Tissue DNA/RNA Kit 、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion)、DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司；DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清購自GBICO公司。

1.3 病毒分離 將病料剪碎，按1:3體積加含有雙抗的PBS溶液，勻漿器勻漿后反復凍融3次，4℃、10 000×g離心20 min，吸取上清液，0.22 μm濾膜過濾除菌。取上述濾液接種 BHK 細胞，出現(xiàn)病變時收集細胞液。過濾除菌的濾液同時經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡雞胚10枚，接種量為0.2 mL/枚。接種后，置生化培養(yǎng)箱37℃恒溫孵化，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚。每間隔12 h觀察1次，收獲死亡的胚體及尿囊液并記錄結(jié)果。

1.4 病毒半數(shù)雞胚致死量（embryo median lethal dose，ELD50）的測定 將分離株病毒懸液作10倍系列稀釋，取103、104、105、106、107、108稀釋度接種雞胚，0.2 mL/個，每一稀釋度接種5個雞胚，觀察記錄雞胚的死亡數(shù)，計算各稀釋度的百分率。按Reed和Muench法計算病毒半數(shù)致死量（ELD50）[5]。

1.5 RT-PCR檢測 按照Tissue DNA/RNA Kit說明書從細胞裂解液中提取病毒總RNA，隨機引物反轉(zhuǎn)錄后做為模板擴增全基因。根據(jù)新型鴨呼腸孤病毒TH11株的σC基因的部分序列設計特異引物，P1：5'-ATGGATCGCAACGAGGTGATA-3'，P2：5'-CTAGCCCGTGGCGACGGTGAA-3'，其擴增長度為954 bp，引物由上海華津生物科技有限公司合成。PCR 反應體系：2×PCR TaqMix 25 μL、上游引物（50 μmol/mL）1μL、下游引物（50 μmol/ mL）1μL、cDNA 模板5μL、無菌雙蒸水18 μL，總體積為50 μL。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用AXYGEN Gel Extreaction Kit回收純化后，將擴增的片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，挑菌落PCR 鑒定，得到含目的片段的重組陽性菌株，用于測序分析。

1.6 序列測定及分析 將陽性克隆送上海華津生物科技有限公司測序，使用DNAStar軟件對測定的病毒核苷酸序列與GenBank中收錄的禽源呼腸孤病毒的序列進行同源性比對和分析。

1.7 動物回歸試驗 取1日齡健康鵝10只，隨機分為攻毒組和對照組兩組，其中攻毒組7只，對照組3只。攻毒組頸部皮下注射ELD50=10-5.7/0.2 mL的病毒液0.2 mL，對照組不做處理。觀察14 d，記錄攻毒組發(fā)病情況，剖檢觀察病死鵝的大體病變，分別取攻毒組和對照組鵝的肺臟、肝臟、脾臟用4%多聚甲醛固定，按常規(guī)方法進行病理切片制作，顯微鏡下觀察病理變化。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離 將病料濾液感染BHK-21細胞，連續(xù)觀察72 h。結(jié)果顯示，盲傳3代之后BHK-21細胞開始出現(xiàn)細胞病變（cytopathic effect，CPE）。分離病毒接種BHK-21細胞24 h后出現(xiàn)細胞堆聚、細胞核濃縮、胞間界限模糊；接種36 h后，細胞堆聚，部分細胞脫落，有合胞體形成（圖1）；接種72 h后，大部分細胞脫落。分離得到的毒株命名為GRVLA16株。病料濾液接種9日齡雞胚，雞胚在36 h開始死亡，48~60 h死亡數(shù)量最多，表現(xiàn)為雞胚發(fā)育不全，胚體蜷縮，體表充血、出血嚴重，全身彌漫針尖大小的出血點，并且胚體與正常雞胚相比偏?。▓D2）。

圖1 分離的病毒GRV-LA16株引起 BHK-21細胞病變Fig.1 Cytopathic effect on BHK-21 induced by GRVLA16 isolateA: 接毒36 h后的BHK-21細胞; B: 正常對照細胞A: BHK-21 cells at 36 h postinfection; B: Normal BHK-21 cells

圖2 GRV-LA16株接種雞胚后產(chǎn)生的病變Fig.2 Lesions of chick embryos experimentally infected with GRV-LA16 strainA: 正常胚; B: 死亡雞胚全身出血, 并且胚體偏小A: Normal chicken embryo; B: Systemic hemorrhage in the dead embryo, which was smaller than normal one

2.2 病毒半數(shù)雞胚致死量（ELD50） 取103、104、105、106、107、108不同稀釋度的病毒懸液接種雞胚，每個稀釋度雞胚死亡情況見表1。由此，測定的分離病毒GRV-LA16株ELD50為10-5.7/0.2 mL。

2.3 病毒分離株的RT-PCR 鑒定 利用針對σC 基因的特異性引物，以及本實驗室保存的鴨病毒性肝炎、禽副粘病毒、對分離病毒GRV-LA16株進行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，特異性擴增出σC基因，其大小約為1000 bp，與預期大小相符（圖3）。

表1 GRV-LA16分離株接種雞胚死亡率Table 1 Mortality rate of chick embryo experimentally infected with GRV-LA16 strain

圖3 分離株GRV-LA16的RT-PCR 鑒定Fig.3 Identif cation of GRV-LA16 strain isolated by RTPCRM: DNA分子量標準; 1: 鴨呼腸孤病毒; 2: 鴨病毒性肝炎; 3: 禽副粘病毒; 4: 禽流感病毒; 5: 陰性對照M: DNA Marker; 1: Duck reovirus; 2: Duck viral hepatitis; 3: Avian paramyxovirus; 4: Avian inf uenza; 5: Negative control

2.4 基因同源性比較和進化樹分析 將獲得的目的片段克隆至pMD-19T載體后進行測序，獲得的核苷酸序列經(jīng)BLAST發(fā)現(xiàn)，GRV-LA16株與其他呼腸孤病毒σC序列同源性很低，最高值僅為87%，選取NCBI中收錄的參考毒株進行遺傳進化樹分析發(fā)現(xiàn)，GRV-LA16株與鴨呼腸孤病毒處于同一拓撲群，而與雞源呼腸孤病毒、番鴨源呼腸孤病毒以及鵝源呼腸孤病毒處于不同拓撲群（圖4）。

2.5 動物回歸試驗 攻毒組的鵝在接毒后d 3發(fā)病，接毒后6 d內(nèi)死亡，其發(fā)病率和死亡率均為100%。發(fā)病鵝精神萎靡，軟腳，排白色稀糞，對照組鵝無臨床癥狀。剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟腫大，有小的壞死灶；脾臟腫大，呈暗紅色；腎臟表面出血。病理切片結(jié)果顯示攻毒組鵝部分肝小葉固有結(jié)構(gòu)消失，肝細胞壞死或崩解消失，伴有炎性細胞浸潤，大部分肝細胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不一的空泡；肺泡壁脹破融合，毛細血管擴張出血，不可見壁，且肺泡腔有紅色絲網(wǎng)狀纖維素滲出物（圖5）。

圖4 GRV-LA16株與其他參考毒株σC 核酸序列的遺傳進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree based on σC gene sequences of GRV-LA16 strain and other strains

3 討論

禽呼腸孤病毒感染水禽的報道最初僅見于番鴨，稱為番鴨呼腸孤病毒病，其致病因子稱為番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）[5,9]，研究表明 MDRV對我國的北京鴨以及其他地方品種鴨不具有感染性[10]。隨著養(yǎng)鴨業(yè)的不斷發(fā)展，呼腸孤病毒病感染多品種鴨也見報道，但是由于流行區(qū)域、發(fā)病種群和發(fā)病時間的不同，呼腸孤病毒感染鴨表現(xiàn)出不同程度的差異。程安春等[9]報道了1998年四川省、云南省等地的“鴨病毒性腫頭出血癥”疫情，是由鴨呼腸孤病毒所致。2009年，陳少鶯等[10]報道了福建省爆發(fā)的呼腸孤病毒為新型鴨呼腸孤病毒，與以往報道的呼腸孤病毒有較大差異。隨后，陳宗艷等[4,11]于2011年分離得到的TH11株也證實為新型鴨呼腸孤病毒，其發(fā)病率逐年升高、病毒致病性更強、宿主范圍更廣、流行的區(qū)域逐年擴大。Yun等[12]發(fā)現(xiàn)浙江省某地區(qū)出現(xiàn)的番鴨呼腸孤病毒致病性已經(jīng)發(fā)生一定程度變異。2004年，王永坤[13]報道雛鵝出現(xiàn)一種以出血性壞死性肝炎為主要特征的疫情，后證實為雛鵝呼腸孤病毒引起。2011年，高巍等[14]報道分離的GRV-JS10株與以往出血性壞死性肝炎不同，并未造成嚴重的大片肝細胞壞死崩解，雛鵝以腱鞘炎和腸道后段黏膜腫塊狀炎癥為病理特征。2013年，陳紅梅等[15]也分離鑒定了11株雛鵝呼腸孤病毒FJ-06株。禽呼腸孤病毒現(xiàn)已成為危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病原之一，這應該引起我們的高度關注。

圖5 感染GRV-LA16株鵝的肺臟、肝臟病理變化Fig.5 Pathological changes of lung, liver infected with GRV-LA16A1, B1: 正常鵝的肺臟和肝臟; A2, B2: 感染GRV-LA16株鵝的肺臟和肝臟A1, B1: Control groups; A2, B2: The lung, liver of geese infected with GRV-LA16

呼腸孤病毒為雙鏈RNA病毒，其致病性差異主要由S1基因節(jié)段變異引起[8,14]。S1基因節(jié)段編碼的σC蛋白位于病毒衣殼表面，屬于黏附蛋白，能夠誘導細胞凋亡，并且此蛋白具有高度變異特性，能夠增強病毒感染細胞能力，是引起病毒抗原發(fā)生變異的主要原因[16,17]。σC蛋白可以特異性結(jié)合到細胞，使機體產(chǎn)生具有高度特異性中和抗體，激發(fā)機體粘膜和全身性免疫反應發(fā)生，誘導細胞產(chǎn)生合胞體，而σC特異性缺失18個氨基酸即可導致病毒致病性發(fā)生變化[8]。由于σC蛋白擁有高度變異特性[8,18]，因此可以用σC蛋白來分離鑒定不同的呼腸孤病毒毒株，比較不同毒株之間的序列差異，分析其序列差異與毒株致病力、免疫原性的關系，研究不同毒株之間的交叉保護性。

本研究病料來自安徽省某養(yǎng)殖場，與之前報道引起雛鵝發(fā)病不同，此株病毒能引起成年鵝軟腳，導致成年鵝的死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)其引起鵝肝臟、脾臟部分壞死，腎臟腫大、出血。GRV-LA16株除具有DRV引起肝脾腫大、壞死的病變特征外，出現(xiàn)肺臟也充血、出血的特征性病變。σC基因序列的進化樹分析結(jié)果表明，GRV-LA16與DRV親緣關系較近，位于同一拓撲群；而與經(jīng)典的ARV及MDRV、GRV處于不同分支。BLAST結(jié)果也表明，此株病毒的σC基因與DRVσC基因同源性相對較高，最高值為87%。郭東春等[19]報道的GRV1毒株基于σC基因序列分析發(fā)現(xiàn)，其與MDRV同屬于一個亞群，核苷酸同源率93%，而與ARV S1133株同源率僅為21%；GRV-JS10株與ARV經(jīng)典株S1133同源性為99.6%[14]；而FJ-06株部分σC基因分析表明，其與ARV同源性低，與DRV處于同一拓撲亞群[15]。本分離毒株的流行來源、流行病學意義、病毒變異與易感宿主范圍擴展之間的關系以及本分離株與ARV、DRV、MDRV及GRV之間的進化關系需要進一步試驗研究。

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ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF A NEW GOOSE REOVIRUS

WU Qiao-mei, LI Chuan-feng, DING Ming-yang, ZHU Jie, TAN Yong-gui, LI Qi, LIU Guang-qing, CHEN Zong-yan

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The aim of this study was to isolate and characterize a new Goose reovirus in Anhui province. The diseased geese were weak in legs and diarrhea. Postmortem f ndings included swollen livers and gray necrotic spots in spleens, hyperaemia and hemorrhage in lungs. By sequencing the specif c PCR product of the virus was characterized as a goose reovirus designated as GRV-LA16 strain. ELD50was titrated to be 10-5.7/0.2 mL. Histopathological examination also found that alveolar walls showed burst fusion. Moreover, the capillaries were dilated and congested, and red f brinous exudate was in the alveolar spaces. Sequencing of σC gene showed that the GRV-LA16 and novel duck reovirus had a close genetic relationship with 87% homology. Phylogenetic analysis of σC gene revealed that GRV-LA16 was not close to Avian orthoreoviruses, GRV and Muscovy duck reovirus.

Goose reovirus; isolation and identif cation; σC gene

S852.659.4

A

1674-6422（2017）03-0001-06

2017-02-07

國家自然科學基金（31502068）；國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0500800）；上海市科委科技創(chuàng)新（13391901602）

吳巧梅，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

陳宗艷，E-mail: zychen@shvri.ac.cn