文德年 劉 瑩 史 偉 曾紹琦 曾海玲 唐 萍 黃小剛 姚開虎

·論著·

中國西部某二級醫(yī)院呼吸道感染住院患兒鼻咽部肺炎鏈球菌中常見非PCV13血清型菌株的橫斷面調查

文德年1,4劉 瑩2,4史 偉2曾紹琦1曾海玲3唐 萍3黃小剛1姚開虎2

目的 了解四川省中江縣呼吸道感染住院患兒鼻咽部肺炎鏈球菌的定植狀況及分離株的血清型分布和耐藥性。方法 2015年1至12月采集四川省中江縣人民醫(yī)院兒科病房住院1月齡至14歲呼吸道感染患兒的鼻咽拭子并分離肺炎鏈球菌。用莢膜腫脹試驗檢測血清型，評估13價肺炎鏈球菌結合疫苗(PCV13)覆蓋率?；谘逍碗S機選取約50%的菌株采用E-test法或紙片擴散法檢測青霉素等16種抗生素的敏感性。結果 共采集到1 082例鼻咽拭子，分離到肺炎鏈球菌199株，攜帶率18.4%。常見血清型為19F(14.6%)、19A(10.6%)、34(10.1%)、6A(9.0%)、23F(7.5%)、6B(7.5%)和23A型(7.0%)。PCV13覆蓋率為54.8%。分離株對靜脈青霉素敏感，但對口服青霉素敏感率僅為9.1%，對阿莫西林-克拉維酸敏感率為97%，對頭孢曲松、萬古霉素、左氧氟沙星和利奈唑胺敏感率100%，對紅霉素和阿奇霉素均耐藥。結論 四川省中江縣呼吸道感染患兒鼻咽部常有肺炎鏈球菌定植；分離株中非PCV13型別常見，以34和23A型為多，有必要加強監(jiān)測；分離株對口服青霉素和紅霉素等耐藥率高，但對靜脈青霉素、頭孢曲松和萬古霉素等普遍敏感。

肺炎鏈球菌； 攜帶率； 耐藥性； 血清型； 兒童

肺炎鏈球菌是5歲以下兒童因肺炎死亡的重要原因[1]。WHO推薦各國盡快將肺炎鏈球菌結合疫苗(PCV)納入兒童計劃免疫[2]。對鼻咽部攜帶株和侵襲性分離株的調查均顯示，我國北方地區(qū)肺炎鏈球菌分離株的7價PCV(PCV7，包含血清型為4、6B、9V、14、18C、19F和23F型)覆蓋率明顯低于南方，而2010年上市的PCV13(在PCV7基礎上增加1、3、5、6A、7F和19A型)覆蓋率在北方和南方相當，均超過80%[3,4]。但在既往報告中源于縣區(qū)級醫(yī)院的資料非常有限，對一線城市的研究結果是否具有全國范圍的代表性受到質疑。本研究前期結果顯示，四川省酉陽縣常見血清型和疫苗覆蓋率與既往大中型經濟發(fā)達城市數據相似[5]。本文以文獻[5]相同的方法在四川省中江縣人民醫(yī)院也開展了同樣的橫斷面調查，結果明顯不同于重慶市酉陽縣人民醫(yī)院的結果，現報告如下。

1 方法

1.1 研究對象 2015年1月至12月在四川省中江縣人民醫(yī)院兒科病房住院的臨床診斷為呼吸道感染的兒童，均符合文獻[5]的納入標準和排除標準。

1.2 標本采集和保存 研究開始前，首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院(我院)微生物研究室資深技術員對四川省中江縣人民醫(yī)院兒科醫(yī)護人員進行了統(tǒng)一技術培訓。每例患兒在入院時經監(jiān)護人同意后盡早采集鼻咽拭子。拭子操作、轉運和孵育方法同文獻[5]，孵育后-40℃凍存。分別于2015年6月和12月底轉運至我院微生物研究室進行細菌分離培養(yǎng)。

1.3 細菌分離、培養(yǎng)和鑒定 操作程序見文獻[5]。

1.4 血清分型 分型血清購自丹麥國家血清研究所，本研究中可確定已知的92種型別。操作步驟和判斷標準按文獻[6]進行。

1.5 抗生素敏感性檢測 肺炎鏈球菌血清型與抗生素敏感性相關[7,8]，因此，本研究在血清型鑒定完畢后，采用隨機數字法從中隨機選取一半菌株進行抗生素敏感性檢測。隨機選取方案和檢測抗生素的方法和種類見文獻[5]。質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619，藥敏結果判定依據2016年美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準進行[9]。如果菌株對≥3種抗生素耐藥，定義為多重耐藥肺炎鏈球菌(MDRSP)。

1.6 觀察指標截取和匯總 以患兒年齡和鼻咽拭子采集時間、細菌分離培養(yǎng)結果以及分離菌株血清型和抗生素敏感性結果進入后續(xù)分析，截取以下資料行描述性分析，①標本采集時季節(jié)和患兒年齡；②肺炎鏈球菌分離株的血清型分型；③抗生素藥敏試驗結果；按PCV13覆蓋和非覆蓋菌株不同血清型分層分析。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用WHONET 5.6軟件錄入肺炎鏈球菌血清型和抗生素敏感性檢測數據，并進行敏感性分析。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計數資料用%表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 攜帶率 研究期間共收集到鼻咽拭子標本1 082份，其中男642例，女440例，年齡為1個月至14歲。肺炎鏈球菌攜帶率18.4%(199/1 082)。圖1顯示，1～10歲呼吸道感染兒童鼻咽部肺炎鏈球菌攜帶率隨年齡增加總體呈現下降趨勢，～2歲組攜帶率最高(27.4%)，≥10歲組攜帶率最低(3.3%)。圖2顯示，1年中肺炎鏈球菌分離陽性率呈“V”型分布，1～3月和11～12月陽性率高(>20.0%)；4月始陽性率逐漸降低，7月最低(7.3%)，之后逐漸升高。

圖1 不同年齡組呼吸道感染兒童鼻咽部肺炎鏈球菌分離狀況

圖2 不同月份呼吸道感染兒童鼻咽部肺炎鏈球菌分離狀況

2.2 血清型分布 在199株肺炎鏈球菌中，有7種血清型構成比超過5%，依次為19F[29株(14.6%)]、19A[21株(10.6%)]、34[20株(10.1%)]、6A[18株(9.1%)] 23F[15株(7.5%)]、6B[15株(7.5%)]和23A型[14株(7.0%)]。其余33.5%的菌株分屬于其他21種血清型，分別為14(9株，4.5%)、15B(8株，4.0%)、10A(6株，3.0%)、15A(6株，3.0%)、15C(6株，3.0%)、42(5株，2.5%)、35B(5株，2.5%)、16F(4株，2.0%)、20(3株，1.5%)、6C(3株，1.5%)、13型(2株，1.0%)以及3、31、33、36、48、10B、18F、24F、7C、9V型各1株。

PCV13的覆蓋率為54.8%(109/199)，非PCV13覆蓋血清型有90株，包括常見血清型中的34和23A型。23價莢膜多糖疫苗(PPV23，包含1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型)的覆蓋率54.3%(108/199)。

2.3 抗生素敏感性檢測 在199株肺炎鏈球菌株中隨機選取99株行16種抗生素敏感性檢測。表1顯示，所有菌株對靜脈青霉素、頭孢曲松、萬古霉素、左氧氟沙星和利奈唑胺均敏感，阿莫西林-克拉維酸、氯霉素和泰利霉素敏感率分別為78.8%、83.8%和97.0%，口服青霉素敏感率9.1%，中介率90.9%；對紅霉素、阿奇霉素均耐藥，四環(huán)素和磺胺甲噁唑-甲氧芐啶耐藥率分別為98.0%和85.9%。

2.4 PCV13覆蓋菌株與非PCV13覆蓋菌株的抗生素不敏感率比較 表2顯示，PCV13覆蓋菌株對口服青霉素、阿莫西林-克拉維酸、頭孢吡肟、頭孢呋辛和亞胺培南的不敏感率高于非PCV13 覆蓋菌株(P<0.05)。

表1 99株肺炎鏈球菌對16種抗生素的敏感性

注 1)MIC50和90為抑制50%和90%細菌生長的最低藥物濃度；2)均采用非腦膜炎分離株青霉素敏感性判定標準(mg·L-1)，靜脈青霉素：敏感 ≤2 ，中介4，耐藥≥8；口服青霉素：敏感≤0.064，中介0.12～2，耐藥≥2；“-”表示美國臨床和實驗室標準化協(xié)會標準中未對相應折點做出規(guī)定

2.5 不同血清型菌株對β-內酰胺類抗生素的敏感性差異 表3顯示，分離菌株中構成比>5%的7種常見血清型菌株對口服青霉素的中介率高于其他不常見血清型菌株，但從其他幾種抗生素的中介率、耐藥率和MIC值來看，19F、19A和23F型的耐藥性相對較強，尤其是19F型。值得注意的是，34和23A型菌株的耐藥性雖然相對較弱，但從MIC50、MIC90和最大MIC值來看，已經具有與19F和19A型耐藥水平相似的菌株，在其他少見血清型中也發(fā)現了這樣的菌株。

表2 PCV13、非PCV13覆蓋菌株抗生素不敏感(中介+耐藥)率比較[n(%)]

表3 不同血清型肺炎鏈球菌對β-內酰胺類抗生素耐藥性差異

注 MIC為最低抑菌濃度，單位為mg·L-1，本研究中未分離到口服青霉素、阿莫西林-克拉維酸、頭孢吡肟和亞胺培南耐藥株

3 討論

本研究顯示，四川省中江縣呼吸道感染兒童肺炎鏈球菌攜帶率為18.4%，略低于北京市和重慶市報道的23.6%[10]和22.6%[11]，更低于重慶市酉陽縣的25.3%[5]?？赡芟嚓P因素：①鼻咽拭子標本在四川中江縣保存于-40℃，影響細菌存活率。②攜帶率與調查對象年齡段的構成有關[12]，因為不同地區(qū)兒童入托和生活方式的差異，不同年齡段的肺炎鏈球菌攜帶率有差異，如本研究中2歲組攜帶率最高(27.4%)，而北京市4歲組最高(38.6%)[10]。

本研究分離株的血清型分布與既往相似人群的報告數據[5,7,13～17](構成比>5%的血清型)有明顯差異(表4)。尤其與同期進行的重慶市酉陽縣研究比較也有明顯不同。重慶市酉陽分離株中，構成比超過5%的血清型都是PCV13覆蓋型別，PCV13覆蓋率達73.8%。本研究PCV13覆蓋率僅54.8%，非PCV13型達45.2%；兩種非PCV13血清型34和23A型的構成比分別為10.1%和7.0%，明顯高于重慶市酉陽縣的1.1%和3.0%；34型在構成比排序中位列第三。產生上述差異的原因可能與下列因素有關。①免疫選擇壓力：疫苗推廣應用后，群體對疫苗血清型產生免疫力，非疫苗血清型增多[18]。雖然四川省中江縣和重慶市酉陽縣均未使用過PCV7，但兩地都有兒童接種PPV23的狀況，可能影響肺炎鏈球菌的血清型分布。②抗生素選擇壓力：既往研究顯示，細菌耐藥性與血清型存在緊密聯系，抗生素選擇耐藥菌時也影響血清型構成[7]。酉陽分離株對口服青霉素、阿莫西林-克拉微酸和頭孢呋辛的耐藥率為1.5%、2.2%和61.8%，均高于中江分離株(0、0和45.4%)，提示兩地抗生素選擇壓力程度有所不同，篩選不同程度耐藥株時血清型分布也受到了影響。本研究中非PCV13覆蓋血清型中已有部分菌株對青霉素和頭孢菌素等不敏感，將來推廣接種PCV13，同時抗生素選擇壓力持續(xù)存在，這些耐藥型別就有了廣泛傳播的有利條件。③患兒臨床疾病嚴重程度：北京兒童醫(yī)院曾監(jiān)測同時期門診呼吸道感染患兒鼻咽部[10]與住院部非侵襲性菌株(主要是呼吸道分離株)的[17]血清型分布，結果顯示兩組菌株的血清型分布有較大的差異(表4)，提示患兒臨床情況的差異可能也是血清型調查結果出現差異的影響因素之一。

表4 本研究與國內其他地區(qū)兒童呼吸道標本分離肺炎鏈球菌血清型分布狀況的比較

注 PCV13：13價肺炎鏈球菌結合疫苗；RI：呼吸道感染；IPD：侵襲性肺炎鏈球菌疾病；NR：未報告；1)：研究中某些型別只明確到群，未確定型；2)：研究中166份標本的分類統(tǒng)計，其中80份為成人標本。3)：包括107份呼吸道吸取物、56份支氣管灌洗液和1份鼻咽拭子。4)：報告中評估PCV7覆蓋率為67.4%

非疫苗血清型的傳播流行對疫苗接種的效果有負面影響，尤其在已經具有一定程度流行的情況下，可能很快取代疫苗型別，成為致病主要群體，抵消疫苗免疫帶來的益處[18]。認識和評估這些非疫苗血清型流行狀況對于研發(fā)適合中國國情的新疫苗尤為重要。因此，有必要對四川省中江縣及其周邊地區(qū)開展調查，明確這些非PCV13血清型的播散范圍、流行程度，和可能原因，為制定防控策略參考。

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(本文編輯：張崇凡，孫晉楓)

Thenon-PCV13serotypeswerefrequentamongStreptococcuspneumoniaeisolatedfromnasopharyngealsamplesofhospitalizedchildrenwithrespiratoryinfectioninagradetwohospitalinwesternChina

WENDe-nian1,4,LIUYing2,4,SHIWei2,ZENGShao-qi1,ZENGHai-ling3,TANGPing3,HUANGXiao-gang1,YAOKai-hu2

(1Departmentofclinicallaboratory,People'sHospitalofZhongjiangCounty,Deyang618100,China; 2BeijingKeyLaboratoryofPediatricRespiratoryInfectionDiseases,KeyLaboratoryofMajorDiseasesinChildren,MinistryofEducation,NationalClinicalResearchCenterforRespiratoryDiseases,NationalKeyDisciplineofPediatrics(CapitalMedicalUniversity),BeijingPediatricResearchInstitute,BeijingChildren’sHospital,CapitalMedicalUniversity,NationalCenterforChildren’sHealth,Beijing100045,China; 3DepartmentofPediatrics,People'sHospitalofZhongjiangCounty,Deyang618100,China; 4Co-firstauthor)

Corresponding Author：YAO Kai-hu, E-mail: jiuhu2655@sina.com

ObjectiveTo investigate the carriage rate, serotype distribution and antibiotic resistance profiles of Streptococcus pneumoniae (S.pneumoniae) among hospitalized children with respiratory tract infections in grade two hospital in Zhongjiang County, Sichuan and to determine the epidemiological characters of these S.pneumoniae isolates. MethodsNasopharyngeal swabs of hospitalized children with respiratory tract infections aged from 1 month to 14 years were collected from January to December 2015 at the Zhongjiang County Hospital, and S.pneumoniae was cultured. The serotypes were detected by capsule swelling experiment to assess the coverage rate of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV13). The sensitivity against 16 antimicrobial agents were detected by E-test or disk diffusion method for approximately half of S.pneumoniae isolates randomly selected based on the serotypes.ResultsThe nasopharyngeal carriage rate of S.pneumoniae was 18.4% (199/1082). The common serotypes were 19F (14.6%), 19A (10.6%), 34 (10.1%), 6A (9.0%), 23F (7.5%), 6B (7.5%) and 23A(7.0%). The coverage rate of PCV13 was 54.8%. The proportion of non-PCV13 types was up to 45.2%. All of the isolates were sensitive to penicillin using the parenteral breakpoints, but the sensitive rate decreased to 9.1% for the oral penicillin breakpoints. The sensitivity rate of amoxycillin/clavulanate was 97%. All of the isolates were sensitive to ceftriaxone, vancomycin, levofloxacin and linezolid. However, all of the isolates were resistant to erythromycin and azithromycin.ConclusionColonization of S.pneumoniae was frequent in the nasopharynx of children with respiratory tract infections in Zhongjiang. About half of the S.pneumoniae isolates were identified as the PCV13 types. Non-PCV13 serotypes were common in the county, in which type 34 and 23A were frequent, which should be monitored for long time and in wider range. The isolates showed a high resistance to oral penicillin and erythromycin, but sensitive to parenteral penicillin, ceftriaxone and vancomycin.

Streptococcus pneumoniae; Carriage rate; Antibiotic resistance; Serotype distribution; Children

1 國家自然科學基金：81371853；2 國家科學技術部項目：2013BAI09B11；3 北京市科委行業(yè)定額經費自主項目：2016-bjsekyjs-3

1 四川省中江縣人民醫(yī)院兒科 德陽，618100；2 國家兒童醫(yī)學中心，首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院，北京市兒科研究所，兒科學國家重點學科，國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心，教育部兒科重大疾病研究重點實驗室，兒童呼吸道感染性疾病研究北京市重點實驗室 北京，100045；3 四川省中江縣人民醫(yī)院檢驗科 德陽，618100；4 共同第一作者

姚開虎，E-mail:jiuhu2655@sina.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2017.03.005

2017-05-22

2017-06-16)