李雪嬌，劉晨曦，楊開倫，劉明軍*

（1.新疆農業(yè)大學動物科學學院，新疆 烏魯木齊830000；2.新疆畜牧科學院生物技術研究所，新疆 烏魯木齊830000）

畜牧科學

德美羊與中美羊胎兒期骨骼肌組織學結構發(fā)育特征差異性研究

李雪嬌1，2，劉晨曦2，楊開倫1，劉明軍2*

（1.新疆農業(yè)大學動物科學學院，新疆 烏魯木齊830000；2.新疆畜牧科學院生物技術研究所，新疆 烏魯木齊830000）

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.04.001

【目的】德美羊產肉性能優(yōu)于中美羊，為了揭示綿羊產肉性能差異機制，本試驗研究德美羊和中美羊胚胎期骨骼肌組織學結構特征發(fā)育及其差異性。【方法】選擇妊娠期骨骼肌發(fā)育關鍵階（75D、105D和135D），取德美羊與中美羊胎兒，記錄體尺數(shù)據(jù)，采集背最長肌，進行石蠟包埋和組織切片，統(tǒng)計德美羊與中美羊不同發(fā)育階段胎兒單位肌纖維數(shù)量、直徑和密度。【結果】D75時德美羊肌肉發(fā)生活動滯后于中美羊，德美胎羊肌纖維數(shù)量在D105階段達到峰值，至D135時，德美羊肌纖維致密性明顯好于中美羊，肌纖維呈緊密、均勻排列。D75和D135時德美羊和中美羊單位面積肌纖維數(shù)量差異極顯著（P＜0.01）。而肌纖維直徑變化與體尺生長數(shù)據(jù)呈正相關，D105和D135德美羊和中美羊單位面積肌纖維直徑差異極顯著（P＜0.01）?！窘Y論】本試驗探究了德美羊與中美羊胎兒骨骼肌中后期的組織學發(fā)育模式，發(fā)現(xiàn)了D105是肌纖維從肌增生到肌肥大發(fā)育的關鍵時間窗口，且德美羊與中美羊發(fā)育模型存在差異，這種差異或是造成產肉性能差異的重要原因之一。

胎兒期；骨骼??；組織學結構

新疆土地遼闊，得天獨厚的牧草資源和畜種資源為新疆養(yǎng)羊業(yè)的迅猛發(fā)展奠定了堅實的基礎，綿羊一直以來都是新疆畜牧業(yè)的主要畜種[1]。羊肉的營養(yǎng)價值豐富，是人們日常生活中不可或缺的營養(yǎng)來源之一[2]。隨著新疆畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，越來越多的人開始追求高品質羊肉。影響肉品質的原因很多，骨骼肌肌纖維的組織學結構特征是決定肉品質的關鍵因素之一[3,4]。胎兒期肌纖維的數(shù)量和直徑影響著骨骼肌終生的生長發(fā)育，且肌纖維組成類型和比例也在胎兒期基本形成，胎兒期也是決定家畜產肉性能的關鍵時期。目前關于胎兒期骨骼肌肌纖維發(fā)育的相關研究多以小鼠和豬為主[5,6]，反芻動物較少。胎兒期肌纖維生長發(fā)育能力影響或決定著綿羊的產肉性能，因此弄清綿羊胎兒期骨骼肌肌纖維組織學發(fā)育性特征，對綿羊產肉和肉品質性能的提高具有重要的科學意義。

中國美利奴羊主要是以澳洲美利奴羊為父本，與波爾華斯羊和當?shù)匦陆毭蛲ㄟ^級近雜交，于1985年在新疆的鞏乃斯種羊場培育而成[7]，是我國優(yōu)良的細毛羊品種。該品種具有毛品質好、產毛量高、適應性強[8]，體格較大，四肢結實等特征，中國美利奴羊雖不是專門的肉用品種，但其綜合經濟效益可同專門化肉用羊相媲美。德國美利奴羊是由泊力考斯和英國萊斯特公羊與原產德國的美利奴羊雜交培育而成[9]，具有早熟、生長發(fā)育快、繁殖率高、被毛品質優(yōu)以及產肉性能好等[10]特點。國內研究表明，在同等飼喂環(huán)境下，中美羊單羔平均初生重為3.92 kg，德美羊初生重約4.17 kg，兩者相差不大。中美羊3月齡斷奶重20.16 kg，德美羊重25.78 kg，此時這兩個品種已拉開差距；到周歲德美羊平均體重可達58.67 kg，比周歲中美羊的45.38kg重13.29kg；6月齡德美羊的凈肉率達36.29%，比中美羊的31.87%超出4.42%，說明德美羊產肉性能顯著高于中國美利奴羊[11]。

家畜生長發(fā)育的關鍵階段是在胎兒期，胎兒期的生長決定著家畜出生后早期甚至成年后生長發(fā)育的表型性狀[12]。胎兒期或是決定著綿羊產肉性能形成的關鍵時期，并且此階段肌纖維生長發(fā)育能力或決定其終生的產肉性能。因此，弄清胎兒期肌纖維發(fā)育的組織和細胞學特征及其差異，是揭示綿羊產肉性能差異機制的重要基礎。德美羊產肉性能優(yōu)于中美羊，鑒于目前對綿羊產肉性能差異機制的認識尚不全面，而胎兒期骨骼肌的生長發(fā)育能力很有可能影響其產肉性狀，本試驗對比德美羊和中美羊胎兒不同發(fā)育階段骨骼肌纖維直徑、數(shù)量及密度變化等組織學結構研究以及免疫組化分析結果，探究德美羊和中美羊胚胎期骨骼肌組織學生長發(fā)育的差異，是揭示綿羊產肉性能差異機制的基礎，同時也為提升家畜產肉性能的技術方面提供可靠的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇年齡相近、體況良好、體重在55～60 kg的成年德國美利奴母羊（購自新疆巴州種畜場）和中國美利奴羊，經過埋栓同期發(fā)情處理后進行人工授精配種，通過超數(shù)排卵獲得胚胎并移植到身體狀況相同的受體母羊，懷孕母羊均按照國家農業(yè)行業(yè)標準（NY/T816-2004）肉羊飼養(yǎng)標準，根據(jù)母羊體重定時、定量飼喂，其后代為試驗動物。采樣時間分別為懷孕母羊妊娠的第75 d（D75）、第105 d（D105）和第135 d（D135），每組采樣個體為3只。

1.2 主要試劑

無水乙醇購自天津市致遠化學試劑有限公司，二甲苯購自天津永晟精細化工有限公司，快肌抗體(M4276，SIGMA)和慢肌抗體（M8421，SIGMA）購自Sigma公司，伊紅染液（水溶性）和蘇木素染液（Harris）購自（臺資）珠海貝索生物技術有限公司，DAB染色液（鏈霉菌-生物素法）免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.3 樣品采集及處理

分別于母羊妊娠的D75、D105、D135對懷孕母羊進行剖腹產，屠宰時盡量避免對妊娠母羊的擠壓，使其充分放血后剖皮，沿腹中線開膛取出腹中胎兒，迅速采集3只胎羊的骨骼肌組織（背最長肌），所有試驗動物取材部位相同，置于苦味酸固定液中。同時記錄試驗動物羊號，測量胎羊體長、體高、體重等數(shù)據(jù)。將試驗組織進行常規(guī)的石蠟包埋[13,14]。

1.4 H.E.染色法

將石蠟包埋好的樣品按照6μm厚度進行切片，于65℃烘箱中烘烤2～3 h，冷卻至室溫，用H.E.染色法[15-17]進行染色，具體步驟如下：二甲苯浸泡15min→二甲苯浸泡10min→100%乙醇：二甲苯（1：1）浸泡3～5min→100%乙醇3min→95%乙醇3min→80%乙醇3min→70%乙醇3min→50%乙醇3min→蘇木素溶液染色8～10min→自來水沖洗3～5min→0.5%鹽酸酒精水分色藍化3～5s→自來水沖洗3～5min→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇各浸泡3min→0.5%伊紅溶液染色2min→95%乙醇3min→95%乙醇3min→100%乙醇3min→100%乙醇3min→100%乙醇：二甲苯（1：1）3min→二甲苯5min→二甲苯5min→中性樹膠封片。

1.5 分析方法

用Olympus DP2-BSW圖像采集系統(tǒng)取10×40倍放大的圖像，每個樣本取6～8張切片進行分析，每個樣品選取不重復、不缺失的10個視野。用圖像分析軟件（Imgae）進行數(shù)據(jù)的測量，統(tǒng)計單位面積肌纖維的數(shù)量、直徑和單位面積。肌纖維數(shù)量為每個視野面積內單根肌纖維總數(shù)量的平均值，肌纖維直徑為每個視野面積內肌纖維直徑的平均值。肌纖維密度值為每個視野中肌纖維數(shù)量肌纖維數(shù)量除以視野面積所得的平均值。用圖像分析軟件統(tǒng)計視野面積快肌和慢肌數(shù)量。所測量數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計方法處理，統(tǒng)計結果以平均值±標準差（Mean±STD）表示，同時對所得試驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 德美羊和中美羊胎羊體尺變化規(guī)律對比

表1顯示德美羊與中美羊胎兒體尺數(shù)據(jù)，從D75至D135時期德美羊與中美羊胎兒各項體尺指標均呈逐漸增長的趨勢。隨著懷孕母羊妊娠天數(shù)的增加，胎羊體重逐漸增加、體長和體高也相應增長。從D75至D135時期中美羊和德美羊胎兒體重均呈近18倍增長，體長呈2.7倍增長、體高呈近3倍增長。相較中美羊而言，德美羊不同發(fā)育階段胎羊體重普遍高于中美羊，體長稍小于中美羊胎兒，各時期體高發(fā)育狀況與中美羊差異不大。

表1 德美羊和中美羊胎兒期體尺數(shù)據(jù)Table 1 The date of German and Chinese Merino sheep fetal body size

2.2 德美羊和中美羊組織學結構特征變化規(guī)律對比

德美羊和中美羊胎兒背最長肌組織切片經H.E.染色后結果如圖1所示，中國美利奴羊和德國美利奴羊在D75時期胎兒骨骼肌均可見中空管狀的初級肌纖維典型結構，且在初級肌纖維四周，圍繞著大量的次級肌纖維，從圖片可以看出，德美羊胎兒D75時胎兒肌纖維數(shù)量少于中美羊，說明此時德美羊肌肉發(fā)生活動滯后于中美羊。中美羊和德美羊于D105和D135胎兒骨骼肌切片未見初級肌纖維結構特征，均呈現(xiàn)了次級肌纖維結構。表明在D75時期后，初級肌纖維與次級肌纖維發(fā)生融合，肌纖維的形成已經完成。在D105時期中美羊與德美羊肌纖維數(shù)量基本恒定。到D135時，中美羊和德美羊肌纖維的發(fā)育均表現(xiàn)為肌纖維面積不同程度的增大，肌纖維直徑顯著增粗，且德美羊胎兒肌間脂肪含量逐漸降低，肌纖維排列較為緊密、均勻，肌纖維致密性好于中美羊胎兒。

圖1 德美羊和中美羊胎兒期不同發(fā)育時期背最長肌H.E.染色法切片對比圖Fig.1 The comparison of German and Chinese Merino sheep fetus at different developmental stages of longissimus muscle H.E.staining slice

統(tǒng)計中美羊和德美羊背最長肌組織單位面積肌纖維數(shù)量和肌纖維直徑等數(shù)據(jù)，結果如表2所示，德美羊在D75時期胎兒單位肌纖維數(shù)量較少（310.23±77.15），與中美羊相比，D75時期德美羊胎兒單位面積肌纖維數(shù)量少于中美羊，D105時德美羊胎兒單位肌纖維數(shù)量達到最大（369.41±72.64），從D75至D105時期德美羊胎兒單位面積肌纖維數(shù)量顯著增加，從D105至D135胎兒單位面積肌纖維數(shù)量逐漸減少，D105和D135時期德美羊胎兒單位面積肌纖維數(shù)量多于中美羊、直徑小于中美羊。從D75至D135時期中美羊與德美羊胎兒單位面積肌纖維直徑均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。D75和D135時德美羊和中美羊單位面積肌纖維數(shù)量差異極顯著（P＜0.01），D105和D135德美羊和中美羊單位面積肌纖維直徑差異極顯著（P＜0.01）。肌纖維密度與肌纖維數(shù)量變化規(guī)律類同，均呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢。

表2 德美羊和中美羊胎兒期單位面積肌纖維數(shù)量、直徑對比Table 2The statistical results of quantity and diameter of muscle fiber of German and Chinese Merino sheep fetal unit area

圖2反應德美羊和中美羊胎兒期單位面積肌纖維數(shù)量和直徑變化的差異。德美羊單位面積肌纖維數(shù)量變化總體均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，而中美羊單位面積肌纖維數(shù)量逐漸降低。德美羊胎兒單位面積肌纖維數(shù)量在D105時單位面積肌纖維數(shù)量出現(xiàn)拐點，此時期單位面積肌纖維數(shù)量達到最高值，從D105至D135單位面積肌纖維數(shù)量逐漸降低。D75時期德美羊胎兒單位面積肌纖維數(shù)量低于中美羊，胎兒發(fā)育后期德美羊胎兒單位面積肌纖維數(shù)量高于中美羊。中美羊和德美羊胎兒單位面積肌纖維直徑均隨妊娠天數(shù)的增加而逐漸增加，D75時期德美羊胎兒單位面積肌纖維直徑大于中美羊，發(fā)育后期德美羊單位面積肌纖維直徑顯著小于中美羊。

圖2 中美羊和德美羊胎兒期單位面積肌纖維數(shù)量、直徑變化趨勢Fig 2 The trend chart of the quantity and diameter of muscle fiber of Chinese Merino and German Merino sheep fetal unit area

3 討論

近年來，國內外研究學者相繼開展了綿羊胎兒期不同發(fā)育階段骨骼肌生長發(fā)育、肌肉組織基因表達以及母體營養(yǎng)限制對胎兒生長發(fā)育影響的研究。本研究主要比較德美羊和中美羊這兩個不同品種綿羊胎兒期不同發(fā)育階段骨骼肌組織學結構特征的差異性。結果顯示，德美羊胎兒早期肌肉發(fā)生活動滯后于中美羊，而后期妊娠天數(shù)達D135時，德美羊肌纖維致密性明顯好于中美羊，肌間脂肪含量較低，肌纖維呈緊密、均勻排列。德美羊胎兒肌纖維數(shù)量在D105階段達到峰值，骨骼肌在中期發(fā)育中主要以肌纖維數(shù)量的增加為主，到D105左右肌纖維數(shù)量基本恒定，而胎兒骨骼肌后期發(fā)育主要以肌纖維面積的增大為主。胎兒總的肌纖維數(shù)量變化趨勢呈現(xiàn)先增加后減少，而肌纖維直徑隨著發(fā)育階段的推移而逐漸增加，且肌纖維直徑變化與胎兒表型生長或胴體發(fā)育呈現(xiàn)出一定的正相關性。德美羊胎兒肌纖維發(fā)育模型基本上與其他報道的一致，但D105胎齡時其發(fā)育特征與中美羊的不同。這種發(fā)育模型上的差異有可能是造成產肉性能高低的原因。

綜上所述，本試驗比較了德美羊和中美羊胎兒骨骼肌中后期的組織學發(fā)育模式，確定了D105是綿羊肌纖維從肌增生到肌肥大的關鍵時間窗口，且發(fā)現(xiàn)德美羊胎兒早期肌肉發(fā)育狀況較為滯后，而后期肌纖維致密性較好。本研究為進一步探究綿羊胎兒骨骼肌發(fā)生機制奠定了基礎，并為提高綿羊產肉和肉品質性能提供了理論依據(jù)。

[1]蔣小懷.新疆養(yǎng)羊業(yè)生產形勢分析與發(fā)展對策研究[J].草食家畜,2014,（2）：1-5.

[2]趙有璋.羊生產學[M].北京：中國農業(yè)出版社,1993.

[3]周金星,畢亞玲,高登惠.肌肉組織學結構及其與肉品品質的關系[J].山地農業(yè)生物學報,2004,23(5)：438-441.

[4]趙曉,莫德林,張悅,等.豬的骨骼肌生長發(fā)育研究進展[J].生命科學,2011,23(1)：37-44.

[5]劉居鵬,單安山,彭濟昌.豬肌纖維發(fā)育及其與肉質的關系[J].中國飼料,2006,（16）：11-12.

[6]郭云雁,王立賢,程篤學,等.豬肌纖維組織學特性研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2007,34(8)：49-52.

[7]李志農.中國養(yǎng)羊學[M].北京：中國農業(yè)出版社,1993.

[8]張亞君,趙文生.中國美利奴羊(新疆型)產毛量的通徑分析[J].草食家畜,2000,（03）：14-15.

[9]陳曉濤,章煥然,陳偉德.德國美利奴羊在新疆的應用前景[J].草食家畜,2003,（1）：9-10.

[10]閆江林,陳明輝,代江生,等.德國美利奴羊生長發(fā)育與繁殖特性的觀察[J].草食家畜,2008,（01）：28-31.

[11]蔣烈戈,李勇忠,景亞平,等.德國美利奴羊與中國美利奴羊主要生產性能比較[J].中國草食動物科學，2013，(06)：78-79.

[12]劉瑞鑿,劉真,吳明明,等.綿羊胚胎發(fā)育中后期骨骼肌BTG2/3的表達動態(tài)及其與Myostatin的關系[J].畜牧獸醫(yī)學報,2015,(11)：1916-1923.

[13]陳璐,馬恒輝,金邦莖.骨骼肌組織石蠟制片技術的改進[J].臨床與試驗病理學雜志,2008,24(2)：233-234.

[14]吳民華,柯湛華.石蠟制片術中切片過程的常見問題及解決方法[J].海南醫(yī)學院學報,2006,12(3)：255-257.

[15]宋平,張世華,楊淑云.HE染色切片染色質量差的原因及處理方法[J].診斷病理學雜志,1995,2(1)：52.

[16]高銘都,黃義祿.病例組織切片技術[M].日本：南山堂出版社,1988：54-62.

[17]劉增輝.病理染色技術[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2001：14.

[18]吳秉銓,劉彥仿.免疫組化學病理診斷[M].北京：北京科學技術出版社,2007.3.

[19]任占平.應用SP免疫組化染色法的體會[J].診斷病例學雜志,1994,1(3)：176.

[20]楊飛云,陳代文,黃金秀,等.豬背最長肌肌纖維類型的發(fā)育性變化及品種與營養(yǎng)影響特點[J].畜牧獸醫(yī)學報,2008,39(12)：1701-1708.

Study on Differentiation of Fetal Skeletal Muscle Development Characteristics between German and Chinese Merino Sheep

LI Xue-jiao1,2,LIU Chen-xi2,YANG Kai-lun1,LIU Ming-jun2*
（1.College of Animal Science,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830000，China；2.Animal Biotechnological Research Center,Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi 830000，China）

【Objective】This study is to clarify the formation and development pattern of muscle fiber and reveal the developmental characteristics of skeletal muscle tissue in fetal period of German Merino sheep.【Method】This study selecting the critical pregnancy(75D,105D and 135D)stage of fetal development measured fetal body size and took samples of fetal longissimus muscle to perform histological analysis by tissue paraffin embedded method and H.E staining.The body size of German Merino fetal sheep was measured.Longissimus muscle tissue from fetal sheep was performed the histology sections and H.E.staining to count for the fiber number,diameter and density at different developmental stages of fetal muscle tissue.Fiber type was determined using Immunohistochemistry to clarify the number and proportion of the primary/secondary and fast/slow muscle fiber type.【Results】With the pregnant period from D75 to D135,the increase of fetal weight was nearly 20 times,the body length and height is nearly 2.5 times.The numbers of muscle fibers in unit area gradually increased to D105 with inflection point,and the overall trend first climbed up and then declined.The growth rate of diameter of muscle fibers from D75 to D105 was relatively smooth,but that of D105-D135 become significantly larger.The change of muscle fiber diameter was positively correlated with body length development.In middle stage,the slow muscle(type I muscle fiber)was the main type,and the latter was mainly composed of fast muscle(type II muscle fiber).【Conclusion】This study clarified the development model of German sheep fetal skeletal muscle tissue 0during the middle and late pregnancy.We found that the pregnant time of 105 days was a critical time window with fiber developmental transformation from muscle hyperplasia to muscle hypertrophy,and made clear the slow muscle(type I muscle fiber)was the main type during middle stage,and the latter stage was mainly composed of fast muscle(type II muscle fiber). This study laid a foundation for further study on the mechanism of fetal skeletal muscle development,and provided a theoretical basis for improving the meat and meat quality of sheep.

Fetus;skeletal muscle;histological structure

S813.3

A

1003-6377（2017）04-0001-06

國家自然科學基金項目（31560627，U1503285）

李雪嬌（1992-），女，新疆烏魯木齊人，在讀碩士，主要從事動物分子生物學研究。E-mail：825536679@qq.com

劉明軍（1965-），男，新疆奎屯人，研究員，博士生導師，主要從事動物分子生物學研究。E-mail：xjlmj2004@yahoo.com.cn

2017-04-16，

2017-04-28