莫鴻英，李玉飛

（1.長沙市婦幼保健院婦產科，長沙 410007；2.湖南師范大學醫(yī)學院，長沙 410006）

m iRNA221對宮頸癌細胞株Siha侵襲轉移行為的影響

莫鴻英1，李玉飛2

（1.長沙市婦幼保健院婦產科，長沙 410007；2.湖南師范大學醫(yī)學院，長沙 410006）

目的：探討干擾miRNA221對宮頸癌細胞侵襲轉移行為的影響。方法：實驗分為Siha，Siha-模擬物即（siha-mimic），陰性對照Siha-nc（mimic），Siha-抑制劑即（Siha-inhibitor），陰性對照Siha-nc（inhibitor）五組。采用qPCR、Western blotting、劃痕實驗和Transwell小室實驗對miRNA221在宮頸癌siha細胞株侵襲轉移中的作用。結果：在siha-mimic組，miRNA221表達明顯高于Siha組和Siha-nc（mimic）組，E-鈣粘素（E-cadherin，E-cad）表達水平明顯降低，N-鈣粘素（N-cadherin，N-cad）及波形蛋白（Vimentin）蛋白表達水平明顯上調；在Siha-inhibitor組，miRNA221表達明顯低于Siha組和Siha-nv（inhibitor）組，E-cad蛋白表達水平明顯升高，N-cad和Vimentin表達水平顯著下調。結論：干擾miRNA221抑制宮頸癌細胞侵襲轉移。

宮頸癌；miRNA221；侵襲轉移；E-鈣粘素；N-鈣粘素

宮頸癌是婦女生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居婦科惡性腫瘤第2位，宮頸癌治療的難點是腫瘤的轉移和復發(fā)［1］。因此，找到宮頸癌侵襲和轉移的分子標記和靶點，則有望為早期診斷及治療宮頸癌提供理論依據(jù)。miRNA是一類長度為18-23個核苷酸的單鏈非編碼微小RNA，其穩(wěn)定性高度遺傳，主要通過其下游靶基因調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2］。miRNA221在相關腫瘤（乳腺癌，直腸癌，卵巢癌）的侵襲轉移中發(fā)揮著重要作用［3，4］，但是在宮頸癌的侵襲轉移過程中扮演如何的作用，目前尚不清楚。因此，本研究擬在宮頸癌細胞株Siha觀察miRNA221對宮頸癌侵襲轉移行為的影響。

1 資料與方法

1.1 宮頸癌細胞株siha購自美國ATCC公司。

1.2 主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購杭州四季青公司，二甲基亞砜DMSO凍存液購自美國sigma公司。逆轉錄及熒光定量PCR試劑盒購自北京百泰克生物技術公司，miRNAmimic及inhibitor購自廣州銳博生物技術有限公司，E-cad，N-cad及Vimentin抗體購自epitomics。

1.3 方法實驗分為Siha，Siha- m im ic（m im ic即m iRNA 221模擬物），陰性對照組Siha-nc（m im ic），Siha- inhibitor（inhibitor即miRNA221抑制劑），陰性對照組Siha-nc（inhibitor）五組。Siha-nc（mimic）組為采用m iRNA221模擬物處理Siha的陰性對照，Sihanc（miRNA221抑制劑）組為采用miRNA221抑制劑處理Siha的陰性對照，Siha- m iRNA221模擬物組采用miRNA221模擬物處理Siha細胞株，Siha- miRNA221抑制劑組采用miRNA221抑制劑處理Siha細胞株。

1.3.1 熒光定量PCR利用Trizol法從宮頸癌細胞株siha中提取總RNA，測量濃度計純度，按照公司逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，進一步根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書進行定量PCR測定。

1.3.2 細胞蛋白樣品的制備培養(yǎng)瓶中的細胞經(jīng)過裂解，離心。取上清。采用BCA 法測定蛋白濃度。加入5×SDS加樣緩沖液，95℃變性4 min 后，-30℃保存。

1.3.3 蛋白濃度測定采用碧云天公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行。樣品制備完畢后采用酶標儀測定，其測定波長540-595nm。根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。

1.3.4 W estern b lotting分別配置10%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠，樣品于 100 ℃變性3 min。各孔均上樣品 50 μg，恒壓80 V，15 min濃縮。再恒壓100V，電泳約100min。之后進行轉膜。封閉1 h。一抗孵育。二抗孵育。經(jīng)過雜交后，放置發(fā)光儀，顯影。

1.3.5 轉染培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細胞，感染前一天將目的細胞分入6-well培養(yǎng)板培養(yǎng)，用于后續(xù)熒光定量PCR及westernblotting實驗用。按照miRNA221mimic及inhibitor試劑說明書稀釋干粉，為轉染做好準備。感染實驗相應組別加入慢病毒顆粒進行目的細胞的感染實驗。之后培養(yǎng)24-72h收集細胞進行相關實驗。

1.3.6 劃痕實驗按照事先實驗設計組別，在孔中加入約3X104個感染后的細胞。第二天上午換低濃度血清培養(yǎng)基，將劃痕儀對準96孔板的下端中央部位，朝上輕推劃痕。用無血清培養(yǎng)基漂洗2遍，再加入低濃度血清培養(yǎng)基，拍照0h。放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～24h，取出后用熒光顯微鏡拍照。

1.3.7 體外細胞侵襲實驗溶膠，之后用冷無血清McCoy’s 5A稀釋Matrigel膠（1：3稀釋）；接種培養(yǎng)細胞，孵育48小時；4%多聚甲醛固定tranwell小室30～40min，0.1%結晶紫700m lμl染色tranwell小室30min，隨機取6個視野計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean± SEM）表示，符合正態(tài)分布，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進行處理，各組間差異采用單因素方差one-way ANOVA分析，方差分析前進行方差齊性檢驗，多重比較采用LSD法。P<0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 干擾m iRNA221的表達對宮頸癌細胞株Siha侵襲轉移相關因子E-cad，N-cad，VimentinmRNA表達的影響

本實驗通過轉染miRNA221的mimic和inhibitor干擾miRNA221表達后，檢測EMT相應指標的變化。實驗結果顯示，與Siha以及陰性對照Siha-nc（m）組比較，轉染mimic組E-cad表達下調顯著，N-cad及Vimentin表達顯著上調；與Siha以及陰性對照Siha-nc（i）組比較，轉染inhibitor組E-cad表達上調顯著，N-cad及Vimentin表達顯著下調，差異有統(tǒng)計學意義（F=34.08，P<0.01；F=27.03，P<0.01；F=17.02，P<0.01）（圖1，表1）。這表明miRNA可以使宮頸癌細胞發(fā)生EMT。

圖1 熒光定量PCR檢測干擾miRNA221表達對宮頸癌細胞株Siha侵襲轉移行為的影響

表1 熒光定量PCR檢測干擾miRNA221表達對宮頸癌細胞株Siha侵襲轉移行為的影響

2.2 干擾m iRNA 221的表達對宮頸癌Siha細胞株蛋白E-cad，N-cad，Vim entin的影響為了檢測轉染miRNA221的mimic和inhibitor后，EMT相關蛋白E-cad，N-cad和Vimetin表達變化，本實驗通過western blotting的方法檢測了E-cad，N-cad和Vimetin蛋白的變化。實驗結果顯示（如圖2A，B，C，D所示）：與siha以及陰性對照Siha-nc（m）組比較，轉染mimic組E-cad表達下調顯著，N-cad及Vimentin表達顯著上調；與siha以及陰性對照Siha-nc（i）組比較，轉染inhibitor組E-cad表達上調顯著，N-cad及Vimentin表達顯著下調，差異有統(tǒng)計學意義。這表明干擾miRNA221能阻止宮頸癌細胞發(fā)生EMT。

圖2 干擾miRNA221對E-cad，N-cad和Vimetin表達變化的影響.與Siha 組和Siha-nc（mimic）組比較，P<0.05。

2.3 干擾m iRNA 221的表達對宮頸癌細胞株siha遷移能力的影響為了觀察干擾miRNA221表達對宮頸癌Siha細胞株遷移行為的影響。實驗結果顯示（如圖3所示）：與Siha以及陰性對照Siha-nc（m）組比較，宮頸癌細胞株Siha培養(yǎng)48h后，轉染mimic的siha-m組細胞遷移能力增強明顯；與Siha以及陰性對照siha-nc（i）組比較，宮頸癌細胞株Siha培養(yǎng)48h后，轉染inhibitor的Siha-i組細胞遷移能力減弱明顯。這表明干擾miRNA221能減弱宮頸癌細胞的遷移能力。

圖3 干擾miRNA221的表達對宮頸癌細胞株Siha遷移能力的影響

2.4 干擾m iRNA 221的表達對宮頸癌細胞株siha侵襲能力的影響為了觀察干擾miRNA221表達對宮頸癌細胞株Siha侵襲行為的影響。實驗結果顯示（如圖4所示）：與Siha和陰性對照Siha-nc（m）組比較，轉染mimic的Siha-m組細胞侵襲能力顯著增強；與Siha和陰性對照Siha-nc（i）組比較，轉染inhibitor的Siha-i組細胞遷移能力顯著減弱。這表明干擾miRNA221能減弱宮頸癌細胞的侵襲能力。

圖4 干擾miRNA221的表達對宮頸癌細胞株Siha侵襲轉移行為的影響

3 討論

m iRNAs對基因的轉錄后表達調控是最近研究中的一個突破性發(fā)現(xiàn)，研究報道已在人類發(fā)現(xiàn)700多種miRNAs，參與調節(jié)機體基因表達，但大多數(shù)miRNAs在疾病中的功能及其作用機制尚未完全闡明。文獻報道腫瘤的發(fā)生發(fā)展與miRNAs的異常調控有關［5，6］。

已有研究報道在乳腺癌，前列腺癌，肝癌等多種腫瘤中存在miRNAs差異表達，miRNAs的異常表達參與腫瘤侵襲，轉移等過程［3，4］。目前有文獻發(fā)現(xiàn)基因芯片篩選及表達譜芯片分析得出miRNA221的表達與腫瘤的侵襲轉移呈正相關關系［7-9］。其支持的依據(jù)為：miRNA221在前列腺癌中表達上調［7］；敲低miRNA221可以抑制腦膜膠質瘤的發(fā)生發(fā)展［8］；在甲狀腺乳頭狀癌中miRNA221的表達明顯增高［9］。通過整理文獻我們得出結論miRNA221在大多數(shù)腫瘤中可能是一個促癌因子，其表達異常也可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展可能存在一定的聯(lián)系。本研究在宮頸癌細胞株Siha上檢測miRNA221的表達與腫瘤細胞侵襲轉移行為間關系。我們的結果發(fā)現(xiàn)miRNA221在宮頸癌細胞株Siha中扮演促癌因子的作用，與宮頸癌轉移相關因子N-cad和VimetinmRNA相對表達量增加，與抑制腫瘤轉移的E-cadmRNA相對表達量下調以及相應蛋白N-cad和Vimetin表達增加和E-cad蛋白表達減少緊密有關，這表明miRNA221通過影響相關因子（E-cad，N-cad和Vimetin）而促進宮頸癌細胞株Siha的遷移侵襲能力增強。此外，我們利用過表達及抑制劑等一系列的分子生物學手段、劃痕及體外侵襲實驗進一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA221增強宮頸癌細胞細胞株Siha的遷移能力和細胞增殖。通過干擾m iRNA221抑制宮頸癌細胞株Siha發(fā)生上皮間質轉化以及減弱腫瘤細胞侵襲遷移能力，有利于腫瘤的轉歸和治療。

m iRNAs的異常表達參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，miRNAs與其下游靶點的結合不是一對一的關系，可能為多個miRNAs同時作用于一個基因，一個miRNA的異常表達可以引發(fā)其下游級聯(lián)反應，從而對下游靶基因進行精確調控。因此，進一步研究m iRNA221在宮頸癌細胞株Siha侵襲轉移中的機制，為下一步探討miRNA221相關作用靶點提供理論依據(jù)。

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Effect of m iRNA221 on the invasion and metastasis of cervical cancer cell lines Siha

Mo Hong-ying1, Li Yu-fei2
(1. Department of Obstetrics and Gynecology Maternity and Children’s Health Care Centers of Changsha, Changsha 410007, China; 2. Hunan Normal University School of Medicine, Changsha 410006, China)

Objective To investigate the effect of miRNA221 on the invasion and metastasis of cervical cancer cell lines Siha. M ethod The experiment was divided into five groups: Siha, Siha-nc (mimic), Siha-nc (inhibitor), Siha-mimic, Siha-inhibitor. Testing the effect of miRNA221 on the invasion and metastasis of cervical cancer cell lines Siha by qPCR, Western blotting, the scratch test and Transwell chamber experiment. Results In Siha-mimic group, the expression of miRNA221 was significantly higher than that in Siha group and Siha-nc (mimic) group, the expression level of E-cad significantly decreased, the protein expressionsof N-cad and Vimentin significantly increased in Siha-inhibitor group, the expression of miRNA221 was significantly lower than that in Siha group and Siha-nc (inhibitor) group, the expression level of E-cad protein significantly increased, the expression levels of Vimentin and N-cad significantly decreased. Conclusion miRNA221 inhibits the invasion and metastasis of cervical cancer cell lines Siha.

cervical cancer; miRNA221; invasion and metastasis; E-cad; N-cad

R737.33

A

1673-016X（2017）03-0063-04

2017-01-03

李玉飛，E-mail：liyu fei666@163.com