莫鴻英,李玉飛
(1.長沙市婦幼保健院婦產科,長沙 410007;2.湖南師范大學醫(yī)學院,長沙 410006)
m iRNA221對宮頸癌細胞株Siha侵襲轉移行為的影響
莫鴻英1,李玉飛2
(1.長沙市婦幼保健院婦產科,長沙 410007;2.湖南師范大學醫(yī)學院,長沙 410006)
目的:探討干擾miRNA221對宮頸癌細胞侵襲轉移行為的影響。方法:實驗分為Siha,Siha-模擬物即(siha-mimic),陰性對照Siha-nc(mimic),Siha-抑制劑即(Siha-inhibitor),陰性對照Siha-nc(inhibitor)五組。采用qPCR、Western blotting、劃痕實驗和Transwell小室實驗對miRNA221在宮頸癌siha細胞株侵襲轉移中的作用。結果:在siha-mimic組,miRNA221表達明顯高于Siha組和Siha-nc(mimic)組,E-鈣粘素(E-cadherin,E-cad)表達水平明顯降低,N-鈣粘素(N-cadherin,N-cad)及波形蛋白(Vimentin)蛋白表達水平明顯上調;在Siha-inhibitor組,miRNA221表達明顯低于Siha組和Siha-nv(inhibitor)組,E-cad蛋白表達水平明顯升高,N-cad和Vimentin表達水平顯著下調。結論:干擾miRNA221抑制宮頸癌細胞侵襲轉移。
宮頸癌;miRNA221;侵襲轉移;E-鈣粘素;N-鈣粘素
宮頸癌是婦女生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率位居婦科惡性腫瘤第2位,宮頸癌治療的難點是腫瘤的轉移和復發(fā)[1]。因此,找到宮頸癌侵襲和轉移的分子標記和靶點,則有望為早期診斷及治療宮頸癌提供理論依據(jù)。miRNA是一類長度為18-23個核苷酸的單鏈非編碼微小RNA,其穩(wěn)定性高度遺傳,主要通過其下游靶基因調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。miRNA221在相關腫瘤(乳腺癌,直腸癌,卵巢癌)的侵襲轉移中發(fā)揮著重要作用[3,4],但是在宮頸癌的侵襲轉移過程中扮演如何的作用,目前尚不清楚。因此,本研究擬在宮頸癌細胞株Siha觀察miRNA221對宮頸癌侵襲轉移行為的影響。
1.1 宮頸癌細胞株siha購自美國ATCC公司。
1.2 主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司,胎牛血清購杭州四季青公司,二甲基亞砜DMSO凍存液購自美國sigma公司。逆轉錄及熒光定量PCR試劑盒購自北京百泰克生物技術公司,miRNAmimic及inhibitor購自廣州銳博生物技術有限公司,E-cad,N-cad及Vimentin抗體購自epitomics。
1.3 方法實驗分為Siha,Siha- m im ic(m im ic即m iRNA 221模擬物),陰性對照組Siha-nc(m im ic),Siha- inhibitor(inhibitor即miRNA221抑制劑),陰性對照組Siha-nc(inhibitor)五組。Siha-nc(mimic)組為采用m iRNA221模擬物處理Siha的陰性對照,Sihanc(miRNA221抑制劑)組為采用miRNA221抑制劑處理Siha的陰性對照,Siha- m iRNA221模擬物組采用miRNA221模擬物處理Siha細胞株,Siha- miRNA221抑制劑組采用miRNA221抑制劑處理Siha細胞株。
1.3.1 熒光定量PCR利用Trizol法從宮頸癌細胞株siha中提取總RNA,測量濃度計純度,按照公司逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄,進一步根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書進行定量PCR測定。
1.3.2 細胞蛋白樣品的制備培養(yǎng)瓶中的細胞經(jīng)過裂解,離心。取上清。采用BCA 法測定蛋白濃度。加入5×SDS加樣緩沖液,95℃變性4 min 后,-30℃保存。
1.3.3 蛋白濃度測定采用碧云天公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行。樣品制備完畢后采用酶標儀測定,其測定波長540-595nm。根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。
1.3.4 W estern b lotting分別配置10%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠,樣品于 100 ℃變性3 min。各孔均上樣品 50 μg,恒壓80 V,15 min濃縮。再恒壓100V,電泳約100min。之后進行轉膜。封閉1 h。一抗孵育。二抗孵育。經(jīng)過雜交后,放置發(fā)光儀,顯影。
1.3.5 轉染培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細胞,感染前一天將目的細胞分入6-well培養(yǎng)板培養(yǎng),用于后續(xù)熒光定量PCR及westernblotting實驗用。按照miRNA221mimic及inhibitor試劑說明書稀釋干粉,為轉染做好準備。感染實驗相應組別加入慢病毒顆粒進行目的細胞的感染實驗。之后培養(yǎng)24-72h收集細胞進行相關實驗。
1.3.6 劃痕實驗按照事先實驗設計組別,在孔中加入約3X104個感染后的細胞。第二天上午換低濃度血清培養(yǎng)基,將劃痕儀對準96孔板的下端中央部位,朝上輕推劃痕。用無血清培養(yǎng)基漂洗2遍,再加入低濃度血清培養(yǎng)基,拍照0h。放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8~24h,取出后用熒光顯微鏡拍照。
1.3.7 體外細胞侵襲實驗溶膠,之后用冷無血清McCoy’s 5A稀釋Matrigel膠(1:3稀釋);接種培養(yǎng)細胞,孵育48小時;4%多聚甲醛固定tranwell小室30~40min,0.1%結晶紫700m lμl染色tranwell小室30min,隨機取6個視野計數(shù)。
1.4 統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean± SEM)表示,符合正態(tài)分布,采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進行處理,各組間差異采用單因素方差one-way ANOVA分析,方差分析前進行方差齊性檢驗,多重比較采用LSD法。P<0.05為顯著性差異。
2.1 干擾m iRNA221的表達對宮頸癌細胞株Siha侵襲轉移相關因子E-cad,N-cad,VimentinmRNA表達的影響
本實驗通過轉染miRNA221的mimic和inhibitor干擾miRNA221表達后,檢測EMT相應指標的變化。實驗結果顯示,與Siha以及陰性對照Siha-nc(m)組比較,轉染mimic組E-cad表達下調顯著,N-cad及Vimentin表達顯著上調;與Siha以及陰性對照Siha-nc(i)組比較,轉染inhibitor組E-cad表達上調顯著,N-cad及Vimentin表達顯著下調,差異有統(tǒng)計學意義(F=34.08,P<0.01;F=27.03,P<0.01;F=17.02,P<0.01)(圖1,表1)。這表明miRNA可以使宮頸癌細胞發(fā)生EMT。
圖1 熒光定量PCR檢測干擾miRNA221表達對宮頸癌細胞株Siha侵襲轉移行為的影響
表1 熒光定量PCR檢測干擾miRNA221表達對宮頸癌細胞株Siha侵襲轉移行為的影響
2.2 干擾m iRNA 221的表達對宮頸癌Siha細胞株蛋白E-cad,N-cad,Vim entin的影響為了檢測轉染miRNA221的mimic和inhibitor后,EMT相關蛋白E-cad,N-cad和Vimetin表達變化,本實驗通過western blotting的方法檢測了E-cad,N-cad和Vimetin蛋白的變化。實驗結果顯示(如圖2A,B,C,D所示):與siha以及陰性對照Siha-nc(m)組比較,轉染mimic組E-cad表達下調顯著,N-cad及Vimentin表達顯著上調;與siha以及陰性對照Siha-nc(i)組比較,轉染inhibitor組E-cad表達上調顯著,N-cad及Vimentin表達顯著下調,差異有統(tǒng)計學意義。這表明干擾miRNA221能阻止宮頸癌細胞發(fā)生EMT。
圖2 干擾miRNA221對E-cad,N-cad和Vimetin表達變化的影響.與Siha 組和Siha-nc(mimic)組比較,P<0.05。
2.3 干擾m iRNA 221的表達對宮頸癌細胞株siha遷移能力的影響為了觀察干擾miRNA221表達對宮頸癌Siha細胞株遷移行為的影響。實驗結果顯示(如圖3所示):與Siha以及陰性對照Siha-nc(m)組比較,宮頸癌細胞株Siha培養(yǎng)48h后,轉染mimic的siha-m組細胞遷移能力增強明顯;與Siha以及陰性對照siha-nc(i)組比較,宮頸癌細胞株Siha培養(yǎng)48h后,轉染inhibitor的Siha-i組細胞遷移能力減弱明顯。這表明干擾miRNA221能減弱宮頸癌細胞的遷移能力。
圖3 干擾miRNA221的表達對宮頸癌細胞株Siha遷移能力的影響
2.4 干擾m iRNA 221的表達對宮頸癌細胞株siha侵襲能力的影響為了觀察干擾miRNA221表達對宮頸癌細胞株Siha侵襲行為的影響。實驗結果顯示(如圖4所示):與Siha和陰性對照Siha-nc(m)組比較,轉染mimic的Siha-m組細胞侵襲能力顯著增強;與Siha和陰性對照Siha-nc(i)組比較,轉染inhibitor的Siha-i組細胞遷移能力顯著減弱。這表明干擾miRNA221能減弱宮頸癌細胞的侵襲能力。
圖4 干擾miRNA221的表達對宮頸癌細胞株Siha侵襲轉移行為的影響
m iRNAs對基因的轉錄后表達調控是最近研究中的一個突破性發(fā)現(xiàn),研究報道已在人類發(fā)現(xiàn)700多種miRNAs,參與調節(jié)機體基因表達,但大多數(shù)miRNAs在疾病中的功能及其作用機制尚未完全闡明。文獻報道腫瘤的發(fā)生發(fā)展與miRNAs的異常調控有關[5,6]。
已有研究報道在乳腺癌,前列腺癌,肝癌等多種腫瘤中存在miRNAs差異表達,miRNAs的異常表達參與腫瘤侵襲,轉移等過程[3,4]。目前有文獻發(fā)現(xiàn)基因芯片篩選及表達譜芯片分析得出miRNA221的表達與腫瘤的侵襲轉移呈正相關關系[7-9]。其支持的依據(jù)為:miRNA221在前列腺癌中表達上調[7];敲低miRNA221可以抑制腦膜膠質瘤的發(fā)生發(fā)展[8];在甲狀腺乳頭狀癌中miRNA221的表達明顯增高[9]。通過整理文獻我們得出結論miRNA221在大多數(shù)腫瘤中可能是一個促癌因子,其表達異常也可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展可能存在一定的聯(lián)系。本研究在宮頸癌細胞株Siha上檢測miRNA221的表達與腫瘤細胞侵襲轉移行為間關系。我們的結果發(fā)現(xiàn)miRNA221在宮頸癌細胞株Siha中扮演促癌因子的作用,與宮頸癌轉移相關因子N-cad和VimetinmRNA相對表達量增加,與抑制腫瘤轉移的E-cadmRNA相對表達量下調以及相應蛋白N-cad和Vimetin表達增加和E-cad蛋白表達減少緊密有關,這表明miRNA221通過影響相關因子(E-cad,N-cad和Vimetin)而促進宮頸癌細胞株Siha的遷移侵襲能力增強。此外,我們利用過表達及抑制劑等一系列的分子生物學手段、劃痕及體外侵襲實驗進一步研究發(fā)現(xiàn),miRNA221增強宮頸癌細胞細胞株Siha的遷移能力和細胞增殖。通過干擾m iRNA221抑制宮頸癌細胞株Siha發(fā)生上皮間質轉化以及減弱腫瘤細胞侵襲遷移能力,有利于腫瘤的轉歸和治療。
m iRNAs的異常表達參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,miRNAs與其下游靶點的結合不是一對一的關系,可能為多個miRNAs同時作用于一個基因,一個miRNA的異常表達可以引發(fā)其下游級聯(lián)反應,從而對下游靶基因進行精確調控。因此,進一步研究m iRNA221在宮頸癌細胞株Siha侵襲轉移中的機制,為下一步探討miRNA221相關作用靶點提供理論依據(jù)。
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Effect of m iRNA221 on the invasion and metastasis of cervical cancer cell lines Siha
Mo Hong-ying1, Li Yu-fei2
(1. Department of Obstetrics and Gynecology Maternity and Children’s Health Care Centers of Changsha, Changsha 410007, China; 2. Hunan Normal University School of Medicine, Changsha 410006, China)
Objective To investigate the effect of miRNA221 on the invasion and metastasis of cervical cancer cell lines Siha. M ethod The experiment was divided into five groups: Siha, Siha-nc (mimic), Siha-nc (inhibitor), Siha-mimic, Siha-inhibitor. Testing the effect of miRNA221 on the invasion and metastasis of cervical cancer cell lines Siha by qPCR, Western blotting, the scratch test and Transwell chamber experiment. Results In Siha-mimic group, the expression of miRNA221 was significantly higher than that in Siha group and Siha-nc (mimic) group, the expression level of E-cad significantly decreased, the protein expressionsof N-cad and Vimentin significantly increased in Siha-inhibitor group, the expression of miRNA221 was significantly lower than that in Siha group and Siha-nc (inhibitor) group, the expression level of E-cad protein significantly increased, the expression levels of Vimentin and N-cad significantly decreased. Conclusion miRNA221 inhibits the invasion and metastasis of cervical cancer cell lines Siha.
cervical cancer; miRNA221; invasion and metastasis; E-cad; N-cad
R737.33
A
1673-016X(2017)03-0063-04
2017-01-03
李玉飛,E-mail:liyu fei666@163.com