張永佳， 張 皓， 李成輝， 金 鑫

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

延邊株氣腫疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因克隆及生物信息學(xué)分析

張永佳， 張 皓， 李成輝， 金 鑫*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

根據(jù)氣腫疽鞭毛基因(GenBank登錄號(hào)：AB058932)的參考序列，PCR擴(kuò)增并克隆延邊株氣腫疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因。成功克隆后測(cè)序，并采用生物信息學(xué)方法對(duì)鞭毛蛋白FliA基因的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)功能域、三級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原表位等重要參數(shù)進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明：與AB058932序列相比，存在38處突變，核苷酸序列的同源性和氨基酸序列的同源性均為97%；FliA蛋白的理論等電點(diǎn)為6.99，不存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽序列，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-折疊為主，主要有15個(gè)潛在B細(xì)胞抗原表位區(qū)，17個(gè)限制性CTL抗原表位區(qū)。本試驗(yàn)為延邊株氣腫疽FliA蛋白功能的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

氣腫疽梭菌；延邊株；FliA基因；克隆；生物信息學(xué)分析

氣腫疽梭菌(Clostridiumchauvoei)又稱肖氏梭菌、費(fèi)氏梭菌，俗稱黑腿病桿菌，屬細(xì)菌綱芽孢桿菌科梭菌屬，為專性厭氧菌。是反芻動(dòng)物細(xì)菌性傳染病—?dú)饽[疽的病原菌。革蘭氏染色不規(guī)則，病料及幼齡培養(yǎng)物中呈革蘭氏陽(yáng)性，而老齡培養(yǎng)菌則呈陰性。主要通過消化道和外傷感染，往往來(lái)不及治療就會(huì)導(dǎo)致病畜死亡。該病主要感染牛，感染癥狀為肌肉豐滿部位，如股部、臀部、腰部、肩部、頸部及胸部等，發(fā)生氣性水腫，呈暗紅棕色到黑色，按壓有捻發(fā)音，剖檢局部呈黑色，肌肉干燥呈海綿狀，病變肌肉與正常肌肉相間，局部骨骼肌、皮下和肌間結(jié)締組織發(fā)生出血或壞死性炎，并產(chǎn)生氣體。病原菌以芽胞形式存在于土壤中，所以不易消滅[1-3]。

氣腫疽梭菌鞭毛為周生鞭毛，主要成分為蛋白質(zhì)，由鞭毛蛋白(flagella)的亞單位組成，是氣腫疽梭菌的重要抗原，稱為鞭毛抗原或H抗原，Mayumi等人研究表明，氣腫疽梭菌的鞭毛至少有3個(gè)抗原決定簇，F(xiàn)liA全長(zhǎng)1 239 bp，編碼413個(gè)氨基酸。經(jīng)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析得知，羧基端活性區(qū)域在第960～1 188 bp之間；胺基端活性區(qū)域在第81～486 bp之間[4-7]。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

氣腫疽梭菌延邊株由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并保存；DL2000 DNA Marker購(gòu)自Newbio industry公司；ExTaqDNA聚合酶、pMD19-T Simple 載體、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 鞭毛蛋白FliA基因引物的設(shè)計(jì)與合成

應(yīng)用Premier5.0軟件，根據(jù)氣腫疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因序列(登錄號(hào)：AB058932)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，預(yù)期的擴(kuò)增全長(zhǎng)為1 258 bp。上游引物5'端加入BamHⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，下游引物5' 端加入XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，由上海生工生物工程有限公司合成。

上游引物P1：5′-CGGGATCCATGATTATCAATCACAATATG-3′；

下游引物P2：5′-CCCTCGAGTTATCTTAATAATTGAAGAACA-3′。

1.3 鞭毛蛋白FliA基因的擴(kuò)增與克隆

采用細(xì)菌基因組抽提試劑盒提取氣腫疽梭菌延邊株菌體DNA。以氣腫疽梭菌延邊株基因組DNA為模板進(jìn)行鞭毛蛋白FliA基因PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)在50 μL體系中進(jìn)行：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物純化后與 pMD 19-T Simple連接，經(jīng)過PCR鑒定和酶切鑒定后將正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送往上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 鞭毛蛋白FliA基因的序列比對(duì)分析

應(yīng)用分子生物學(xué)軟件Genedoc對(duì)測(cè)序后的鞭毛蛋白FliA基因序列與GenBank中(登錄號(hào)：AB058932)FliA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，對(duì)核苷酸及氨基酸序列的差異進(jìn)行比較。

1.5 鞭毛蛋白FliA蛋白的理化性質(zhì)及功能區(qū)域分析

應(yīng)用ExPASy、SignalP、MHMM和Biotech軟件對(duì)鞭毛蛋白FliA基因的理化性質(zhì)、信號(hào)肽位點(diǎn)、跨膜區(qū)及蛋白質(zhì)特性進(jìn)行分析。

1.6 鞭毛蛋白FliA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用SOPMA方案[8]對(duì)鞭毛蛋白FliA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)成分進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.7 鞭毛蛋白FliA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用SWISS-PDB viewer軟件的SWISS-model[9]與CPHmodels軟件對(duì)鞭毛蛋白FliA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子模擬。

1.8 鞭毛蛋白FliA蛋白抗原表位預(yù)測(cè)

應(yīng)用DNA Star、SYFPEITHI、BepiPred預(yù)測(cè)該蛋白的抗原表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 鞭毛蛋白FliA基因擴(kuò)增

以氣腫疽梭菌延邊株的DNA為模板，P1、P2為引物，擴(kuò)增出片段為1 258 bp的特異性產(chǎn)物，與預(yù)期目的條帶相符(圖1)。

2.2 鞭毛蛋白FliA基因的全序列比對(duì)分析

三是構(gòu)建完善的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體系。政策設(shè)計(jì)超前、技術(shù)支撐滯后的現(xiàn)象并不鮮見。由于歷史和認(rèn)識(shí)的原因，技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)遠(yuǎn)不適應(yīng)新時(shí)代土地管理的需要。標(biāo)準(zhǔn)是一個(gè)尺度，是開展技術(shù)活動(dòng)和進(jìn)行行政管理的依據(jù)，構(gòu)建完善的土地質(zhì)量管理技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體系，是一項(xiàng)基礎(chǔ)性、根本性的工作。

將測(cè)序得到的鞭毛蛋白FliA基因核苷酸序列與GenBank中氣腫疽梭菌ATCC 10092株中鞭毛蛋白FliA基因序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，與GenBank中序列相比存在38處點(diǎn)突變，其中，11處為同義突變，核苷酸序列同源性與氨基酸序列同源性同為97%(圖2)。

M：DL 2 000 DNA Marker；1：目的基因擴(kuò)增

2.3 鞭毛蛋白FliA的理化性質(zhì)分析

應(yīng)用ExPASy軟件的ProtParam工具對(duì)鞭毛蛋白FliA蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，鞭毛蛋白FliA共編碼414個(gè)氨基酸，其相對(duì)分子量為43.61 KD，理論等電點(diǎn)(PI)為6.99，接近中性。

2.4 鞭毛蛋白FliA信號(hào)肽、跨膜區(qū)及表達(dá)后的可溶性預(yù)測(cè)

應(yīng)用SignalP軟件、Biotech軟件對(duì)鞭毛蛋白FliA的信號(hào)肽及該蛋白質(zhì)表達(dá)后的可溶性進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，該蛋白不存在信號(hào)肽序列和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，且重組后的鞭毛蛋白FliA蛋白在大腸桿菌內(nèi)可溶性幾率為91.8%。

2.5 鞭毛蛋白FliA的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用PSIPRED方案對(duì)鞭毛蛋白FliA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)成分進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，組成該蛋白的結(jié)構(gòu)有α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲(圖3)。

圖2 利用Gendoc軟件比對(duì)鞭毛蛋白FliA氨基酸序列

圖3 鞭毛蛋白FliA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.6 鞭毛蛋白FliA的三級(jí)結(jié)構(gòu)分子模型

在SWISS-model軟件數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)與鞭毛蛋白FliA相似的結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Phyre 2軟件對(duì)鞭毛蛋白FliA的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)(圖4)。

經(jīng)SYFPEITHI在線分析，鞭毛蛋白FliA具有17個(gè)HLA-A*02:01限制性CTL抗原表位(臨界值為21分)(表1)

圖4 鞭毛蛋白FliA三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

順序氨基酸位置潛在的CTL抗原表位序列分值1109AIQDEINSL28251KMRGQIRGL26316SLTEEINRI264184NLADGSYKI265229LADGAVLTV25679ALSETHSIL24785SILQRMREL248173SLESKALAL249254KLSSGSYEI2410284LNIEGIGEV2411304MLAGTKFTI2412350RLEHTINNL24132IINHNMNAL231415NMMGNIATA2315228ALADGAVLT2316329TINSAIEQV2317343KLGAVQNRL22

應(yīng)用BepiPred、DNA Star軟件對(duì)鞭毛蛋白FliA的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示15個(gè)潛在的B細(xì)胞抗原表位，分別位于22～29位、38～45位、59～68位、77～81位、96～105位、108～112、122～131位、145～153位、185～192位、197～211位、246～243位、311～323位、335～344位、358～368位、399～406位氨基酸處(臨界值為0.35)(圖5)。

圖5 鞭毛蛋白FliA蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

3 討論與結(jié)論

鞭毛是負(fù)責(zé)大多數(shù)細(xì)菌物種運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞器。一個(gè)細(xì)菌鞭毛的基本結(jié)構(gòu)可分為3個(gè)部分：基體、吊鉤和鞭毛絲。鞭毛絲由鞭毛蛋白重復(fù)亞基組成。Yoshimasa Sasaki等人發(fā)現(xiàn)，至少有2個(gè)拷貝的FliA基因存在于染色體，發(fā)現(xiàn)C.chauvoeiFliA基因的上游和下游的序列(序列登錄號(hào)d89073)是相同的，C.chauvoei染色體上可能存在FliA基因串聯(lián)拷貝，其他梭菌屬梭菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育集群，如溶血梭菌、諾維梭菌、腐敗梭菌也可能隱藏著FliA基因串聯(lián)拷貝[10-17]。

本試驗(yàn)通過擴(kuò)增鞭毛蛋白FliA基因的片段，純化回收并與pMD 19-T Simple 載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化鑒定后將測(cè)序結(jié)果與GenBank上已發(fā)表菌株的序列進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的鞭毛蛋白FliA基因序列與原序列相比共存在38處堿基突變，其中，有27處堿基使氨基酸序列發(fā)生了改變，氨基酸改變集中在270～310 aa，這表明該蛋白的氨基酸序列兩端較為保守，中間不穩(wěn)定，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋主要在兩端，β-折疊集中在中下游，序列不穩(wěn)定的部分集中于中下游的無(wú)規(guī)則卷曲部分。本試驗(yàn)應(yīng)用Phyre 2軟件對(duì)鞭毛蛋白FliA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)成功進(jìn)行了模擬，為進(jìn)一步探索氣腫疽梭菌鞭毛蛋白FliA的結(jié)構(gòu)及功能提供了更全面的研究依據(jù)[18]。

與生物信息學(xué)分析相比，動(dòng)物體內(nèi)的免疫應(yīng)答復(fù)雜多變，因此每一種預(yù)測(cè)方法都存在局限性[19-20]。利用DNA Star軟件和BepiPred軟件綜合分析鞭毛蛋白FliA蛋白的抗原表位可能區(qū)域，預(yù)測(cè)鞭毛蛋白FliA蛋白的B細(xì)胞抗原表位主要存在15處，潛在T細(xì)胞抗原表位17處，本試驗(yàn)為FliA基因的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and bioinformatics analysis of the flagellin gene (FliA) ofClostridiumchauvoeiof Yanbian strain

ZHANG Yongjia， ZHANG Hao， LI Chenghui， JIN Xin*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

Based on the reference sequencing of the flagellin gene (FliA) (GenBank Assession Number：AB058932), The FliA gene of Yanbian strain was amplified by PCR and inserted into cloning vector. After sequencing, the bioinformatics analysis was performed, such as the secondary structure, structure domains, tertiary structure, and antigenic epitopes. The results showed that the sequence homologies of nucleotides and amino acids both of them are 97%, and have 38 amino acids points mutation compared with the AB058932. The theoretical isoelectric point of protein is 6.99. There is not the transmembrane region and signal peptide sequence in the FliA protein. The secondary structure mainly consists of α-helixes, β-folding, 15 potentional B cell epitope regions and 17 restricted CTL epitopes. This experiment provides the foundation to study the FliA protein function.

Clostridiumchauvoei; Yanbian strain; flagellin gene (FliA)；cloning；bioinformatics analysis

2017-04-15 基金項(xiàng)目：吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目

張永佳(1992—)，女，吉林延吉人，在讀碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病學(xué)。金鑫為通信作者，

E-mail:jinxin@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)02-0035-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.02.006

S852.61

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