劉冠甫， 金善玉， 李 賀， 車成來(lái)， 樸炫春， 金美玉*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院；2.延邊州食品藥品檢驗(yàn)所：吉林 延吉 133000；3.延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院,吉林 龍井 133400)

懸浮培養(yǎng)福建金線蓮叢生芽中酚及黃酮積累影響因素研究

劉冠甫1， 金善玉2， 李 賀1， 車成來(lái)3， 樸炫春1， 金美玉1*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院；2.延邊州食品藥品檢驗(yàn)所：吉林 延吉 133000；3.延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院,吉林 龍井 133400)

為篩選懸浮培養(yǎng)福建金線蓮叢生芽中酚和黃酮積累的適宜培養(yǎng)基，對(duì)MS基本培養(yǎng)基濃度、芐基腺嘌呤(BA)、激動(dòng)素(KT)及萘乙酸(NAA)濃度的4因素8水平及蔗糖、磷和氮濃度3因素7水平利用均勻設(shè)計(jì)法，研究了2組均勻設(shè)計(jì)的不同組合處理對(duì)福建金線蓮叢生芽中酚和黃酮積累的影響。同時(shí)，對(duì)培養(yǎng)基中NO3-和NH4+濃度比的影響也進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：酚和黃酮的最高含量和生產(chǎn)量出現(xiàn)在3/4 MS+BA2.0 mg/L+KT 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L組合和蔗糖35 g/L+磷0.93 mM+氮45 mM組合。培養(yǎng)基中總氮濃度為45 mM的條件下，對(duì)NO3-和NH4+濃度的影響進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)NO3-和NH4+濃度分別為30和15 mM時(shí)，最利于酚和黃酮積累，總酚和總黃酮生產(chǎn)量分別達(dá)到112.7和87.9 mg/L。因此，在福建金線蓮叢生芽懸浮培養(yǎng)時(shí)，將3/4 MS培養(yǎng)基中的總磷濃度調(diào)節(jié)為0.93 mM，NO3-和NH4+濃度分別調(diào)節(jié)為30和15 mM，加入BA 2.0 mg/L，KT 0.2 mg/L，NAA 0.5 mg/L和蔗糖35 g/L時(shí)可獲得較多的酚和黃酮。

金線蓮；叢生芽；培養(yǎng)基；酚；黃酮

福建金線蓮(Anoectochilusroxburghii)為蘭科開(kāi)唇蘭屬的多年生珍貴藥用草本植物[1-3]，富含多糖、黃酮、微量元素、氨基酸、酚和三萜類等多種物質(zhì)，具有抗氧化、清除自由基、延緩衰老、預(yù)防癌癥等生物活性，對(duì)高血壓、糖尿病和肝炎等慢性疾病療效顯著，也可治療肺熱咳嗽、風(fēng)濕骨痛、膀胱炎等疾病[4-8]。金線蓮可以全草入藥，在民間被視為珍稀名貴藥材，其藥用價(jià)值倍受人們青睞，因此，有“藥王”之稱[9]。近年來(lái)，福建金線蓮的生存環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞[10]，而人工栽培因環(huán)境制約及福建金線蓮本身所具有的生長(zhǎng)緩慢等特點(diǎn)，加上高要求的栽培管理?xiàng)l件，生產(chǎn)量難以滿足市場(chǎng)需求[11]。因此，迫切需要探尋一種可大量獲取福建金線蓮植物材料的方法，而植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)是較為有效的途徑。目前，以有效物質(zhì)生產(chǎn)為目的的金線蓮細(xì)胞、組織或器官培養(yǎng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)研究福建金線蓮叢生芽懸浮培養(yǎng)中影響酚和黃酮積累的諸多培養(yǎng)基因素，旨在篩選適宜的培養(yǎng)基，為進(jìn)一步利用生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)叢生芽提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

將0.5 cm的福建金線蓮組培苗莖端接種于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(花寶一號(hào)1 g/L+花寶二號(hào)1 g/L+蛋白胨2 g/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH值5.8)中，培養(yǎng)30 d后，將誘導(dǎo)出的叢生芽切成單芽接種到叢生芽增殖培養(yǎng)基[MS+芐氨基嘌呤(BA)3.0 mg/L+激動(dòng)素(KT) 0.3 mg/L+萘乙酸(NAA) 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+ 瓊脂7 g/L，pH值5.8]中，每30 d進(jìn)行1次繼代培養(yǎng)。將增殖培養(yǎng)得到的叢生芽切成單芽后作為外植體用作本研究的試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 MS培養(yǎng)基濃度和BA、KT及NAA濃度對(duì)叢生芽中酚及黃酮的影響

利用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)MS培養(yǎng)基濃度和BA、KT及NAA進(jìn)行4因素8水平的設(shè)計(jì)，得到8種組合(表1)，每個(gè)組合中均加入蔗糖30 g/L，培養(yǎng)基中的pH值調(diào)節(jié)為5.8。將鮮重為3 g/L的外植體接入含有100 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在轉(zhuǎn)速為121 r/min的振蕩器上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光照強(qiáng)度為1 600 Lx，每天光照16 h。培養(yǎng)30 d后，取出叢生芽，用自來(lái)水清洗并瀝干表面水分后烘干，稱干重(DW)，并測(cè)定叢生芽干樣品中酚和黃酮的含量，并計(jì)算2種物質(zhì)的生產(chǎn)量，以物質(zhì)生產(chǎn)量作為主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

物質(zhì)生產(chǎn)量/(mg/L)=叢生芽干重/(mg/L)×物質(zhì)含量/(mg/g)。

表1 U8(84)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平

1.2.2 培養(yǎng)基中蔗糖、總磷及總氮濃度的影響

在上述試驗(yàn)結(jié)果得到的最佳組合(3/4 MS+BA 2.0 mg/L+KT 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)基中蔗糖濃度、總磷及總氮濃度進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)，得到不同的組合(表2)。將3 g/L的外植體接入含有100 mL不同組合處理培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶后，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同試驗(yàn)1.2.1。

表2 U7(73)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平

1.2.3 NO3-/NH4+濃度比的影響

在上述2種試驗(yàn)篩選的培養(yǎng)基 [3/4 MS(總磷0.93 mM)+BA 2.0 mg/L+KT 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖45 g/L]中，總氮濃度固定為45 mM，調(diào)節(jié)NO3-和NH4+濃度為45/0、37.5/7.5、30/15、22.5/22.5、15/30、7.5/37.5和0/45(mM)，調(diào)查NO3-/NH4+濃度比的影響。其他同試驗(yàn)1.2.1。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 總酚含量的測(cè)定

參照Folin和Ciocallteu[12]的方法測(cè)定總酚含量。將叢生芽干品磨碎后，取0.1 g加入15 mL的80%甲醇后置于80 ℃水浴鍋煮2 h，冷卻后在5 000 r/min下離心15 min，取上清液，定容至25 mL。利用紫外分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)為760 nm下測(cè)定吸光值。

1.3.2 總黃酮含量的測(cè)定

黃酮含量的測(cè)定采用硝酸鋁比色法[5]。將磨碎的叢生芽干品0.1 g放于50 mL的三角瓶中，加入70%乙醇10 mL，在60 ℃下水浴2 h。冷卻后，在溫度4 ℃，轉(zhuǎn)速5 000 r/min條件下離心15 min，取上清，定容至25 mL。用紫外分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)為510 nm下測(cè)定吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。利用Excel整理分析，數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 MS培養(yǎng)基濃度和BA、KT及NAA濃度對(duì)叢生芽中酚及黃酮的影響

對(duì)MS培養(yǎng)基濃度和BA、KT及NAA濃度進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)得到8種不同組合，發(fā)現(xiàn)各組合叢生芽酚和黃酮積累有很大差異。由圖1可知，A3組合叢生芽中酚和黃酮的含量高于其他組合，總酚含量達(dá)到5.6 mg/g DW，而總黃酮含量達(dá)到4.4 mg/g DW。

生產(chǎn)量/(mg/L)=干重/(mg/L)×含量(mg/g)，下同。

同時(shí)，A3組合中，總酚和總黃酮生產(chǎn)量也達(dá)到最大值，分別為83.4和65.6mg/L。因此，在進(jìn)行福建金線蓮叢生芽培養(yǎng)時(shí)，在3/4MS培養(yǎng)基中加入BA 2.0 mg/L，KT 0.2 mg/L和NAA 0.5 mg/L較為適宜。

2.2 培養(yǎng)基中蔗糖、總磷及總氮濃度的影響

培養(yǎng)基中的糖起著調(diào)節(jié)滲透壓和代謝物合成的作用，而磷和氮是植物生長(zhǎng)過(guò)程中所必要的元素。因此，本研究對(duì)培養(yǎng)基中蔗糖、總磷及總氮濃度進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)得到不同組合叢生芽中總酚和總黃酮積累不同，B4組合中總酚和總黃酮含量最高，分別為5.8和4.3 mg/g DW(圖2)。同樣，B4處理中，總酚和總黃酮的生產(chǎn)量也達(dá)到最高，分別達(dá)到98.0和72.7 mg/L。因此，將3/4 MS培養(yǎng)基中的磷濃度調(diào)節(jié)為0.93 mM，氮濃度調(diào)節(jié)為45 mM后加入蔗糖35 g/L時(shí)，最適于叢生芽中酚和黃酮的生產(chǎn)。

圖2 蔗糖濃度和磷及氮濃度組合對(duì)懸浮培養(yǎng)福建金線蓮叢生芽中酚和黃酮積累的影響

2.3 NO3-/NH4+濃度比的影響

在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，植物可利用氮源主要是NO3-和NH4+。因此，2種氮濃度影響組培效果。本研究將3/4MS培養(yǎng)基中的總氮濃度設(shè)為45 mM后，將NO3-和NH4+設(shè)置不同濃度后探究對(duì)酚和黃酮積累的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NO3-/NH4+為30/15 (mM)時(shí)，酚含量(5.9 mg/g DW)和生產(chǎn)量(112.7 mg/L)及黃酮含量(4.6 mg/g DW)和生產(chǎn)量(87.9 mg/L)達(dá)到最大值(圖3)。

圖3 NO3-/NH4+濃度對(duì)懸浮培養(yǎng)福建金線蓮叢生芽中酚和黃酮積累的影響

3 討論

在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，MS培養(yǎng)基是應(yīng)用最多的基本培養(yǎng)基，含有較多的無(wú)機(jī)鹽，但MS培養(yǎng)基對(duì)一些植物并不適宜。因此，許多研究通過(guò)調(diào)節(jié)無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)MS培養(yǎng)基進(jìn)行改良后應(yīng)用[13]。另外，培養(yǎng)基中加入的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中細(xì)胞分裂素可促進(jìn)芽分化，生長(zhǎng)素具有促進(jìn)生長(zhǎng)及生根的作用。趙元增等[14]研究表明在離體培養(yǎng)的特殊環(huán)境下,培養(yǎng)基中添加一定濃度的激素對(duì)太行菊不定芽的增殖與生長(zhǎng)仍是必須的。細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比例影響植物器官分化，二者比例高時(shí)利于芽分化，比例低益于根分化[15]。這種細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比例對(duì)植物細(xì)胞或器官培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物也有不同影響，于榮敏等[16]表明，在MS培養(yǎng)基中，添加0.4 mg/L NAA和0.3 mg/L BA時(shí)，促進(jìn)何首烏毛狀根的生長(zhǎng)及蒽醌類化合物的合成。張澤等[17]研究表明在MS培養(yǎng)基中加入0.6 mg/L的NAA對(duì)五鶴續(xù)斷叢生芽的組織培養(yǎng)有促進(jìn)作用。張萬(wàn)博等[18]發(fā)現(xiàn)，1 mg/L BA及0.8 mg/L NAA促進(jìn)狼爪瓦松愈傷組織生長(zhǎng)與有效物質(zhì)積累。本研究中，福建金線蓮叢生芽在3/4MS培養(yǎng)基中加入2.0 mg/L BA，0.2 mg/L KT和0.5 mg/L NAA時(shí)，適宜于叢生芽中酚和黃酮的積累。這些研究表明，對(duì)于不同植物種、不同外植體培養(yǎng)及不同目的產(chǎn)物的生產(chǎn)要求不同的培養(yǎng)基條件。

培養(yǎng)基中添加的糖是植物組培過(guò)程中植物培養(yǎng)物生長(zhǎng)不可缺少的碳源，即可為細(xì)胞提供合成新化合物的碳骨架，又可為細(xì)胞呼吸和代謝提供底物與能源，還可維持細(xì)胞的滲透壓。因此，有很多研究對(duì)糖濃度的影響進(jìn)行了探明，張萬(wàn)博[18]等探究了蔗糖濃度對(duì)狼爪瓦松愈傷組織生長(zhǎng)的影響，認(rèn)為30 g/L的蔗糖最利于狼爪瓦松愈傷組織的生長(zhǎng)。另外，培養(yǎng)基中所需的磷素是植物生長(zhǎng)發(fā)育必須的營(yíng)養(yǎng)元素之一，是構(gòu)成核酸和磷脂等大分子物質(zhì)的重要成分[19];同樣，氮素也是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必要元素，氮素營(yíng)養(yǎng)在作物干物質(zhì)形成的過(guò)程中起重要作用[20]，植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，NO3-和NH4+濃度比影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和有效物質(zhì)的積累。楊娟等[21]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中NO3-/NH4+濃度調(diào)節(jié)為30/30(mM)時(shí)，茶樹(shù)組培苗的生長(zhǎng)狀況最好；高日等[22]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中總氮濃度分別為30 mM時(shí)，單獨(dú)使用硝態(tài)氮更有利于人參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中皂苷的積累；Cui等[23]在進(jìn)行貫葉連翹不定根懸浮培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，最適合酚和黃酮積累的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮濃度比為5/25(mM)。這些研究結(jié)果表明，在不同組培體系中適宜的培養(yǎng)基條件有很大差異。為了獲得最佳的培養(yǎng)效果，培養(yǎng)基的篩選是組培成功的首要條件。對(duì)于福建金線蓮叢生芽懸浮培養(yǎng)，為了獲得較多的酚和黃酮，將培養(yǎng)基中的磷調(diào)節(jié)為0.93 mM，總氮含量為45 mM條件下將NO3-/NH4+濃度調(diào)節(jié)為30/15(mM)，蔗糖濃度調(diào)節(jié)為35 g/L較為適宜。

4 結(jié)論

福建金線蓮叢生芽懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，在總磷濃度為0.93 mM，總氮濃度為45 mM，NO3-/NH4+濃度比為30/15 mM的改良3/4 MS培養(yǎng)基中，加入BA 2.0 mg/L，KT 0.2 mg/L，NAA 0.5 mg/L及蔗糖35 g/L時(shí)，利于叢生芽中有效物質(zhì)的積累，可得到較多的酚和黃酮。

[1] 廣東省植物研究所.海南植物志:第四卷[M].北京:科學(xué)出版社,1977,203-204.

[2] 鄭純,黃以忠,季蓮芳.金線蓮文獻(xiàn)考證、原植物及商品調(diào)查[J].中草藥,1996,27(2):169-171.

[3] 林宗鏗.名貴藥材“金線蓮”[J].福建熱作科技,2003,28(2):45-46.

[4] 王晉成.金線蓮化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].東南園藝,2014,6:68-74.

[5] Hakimuddin F,Paliyath G,Meckling K.Selective cytotoxicity of a red wine flavonoid fraction against MCF-7 cells[J].Breast Cancer Res Tr,2004,85(1):65.

[6] 《全國(guó)中草藥匯編》編寫組.全國(guó)中草藥匯編[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1996:392-393.

[7] 何春年,王春蘭,郭順星,等.蘭科開(kāi)唇蘭屬植物的化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2004,39(2):81-84.

[8] Du X M,Irino N,Furusho N,et al.Pharmacologically active compounds in the Anoectochilus and Goodyera species[J].J Nat Med,2008,62(2):132-148.

[9] 李萍,潘曉麗,鄭小香.金線蓮多糖提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(13): 105-107.

[10] 韓曉紅,張林成,段春紅.金線蓮練苗及移栽技術(shù)研究[J].北方園藝,2013,(10):78-81.

[11] 朱小鵬.臺(tái)灣金線蓮的栽培技術(shù)[J].林業(yè)勘察設(shè)計(jì),2006(2):209-211.

[][]

[12] Folin O,Ciocalteu V.On tyrosine and tryptophane determination in proteins[J].J Biol Chem,1927,73:627-650.

[13] 李金蓉,丁遙,姜利健,等． MS和生長(zhǎng)素濃度對(duì)大櫻桃“明珠”組培苗生根的影響[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào),2015,37(2):123-126.

[14] 趙元增,楊靖,孫海燕.不同激素配比對(duì)太行菊不定芽增殖與生長(zhǎng)的影響[J].河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015,43(3):16-20.

[15] 李慶偉,梁明勤,樊亞敏,等.不同取材時(shí)期和處理方法對(duì)瓦松無(wú)菌體系建立的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(1):55-58.

[16] 于榮敏,馬娜,嚴(yán)春艷.外源激素對(duì)何首烏毛狀根生長(zhǎng)及蒽醌類成分生物合成的影響. 生物工程學(xué)報(bào),2006,22(4):619-623.

[17] 張澤,武蕓.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)五鶴續(xù)斷組織培養(yǎng)的影響[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,28(2):219-221.

[18] 張萬(wàn)博,樸炫春,楊帆,等.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和蔗糖濃度對(duì)狼爪瓦松愈傷組織生物量及有效物質(zhì)積累的影響[J].北方園藝,2016(19):171-175.

[19] 劉海濤,童良軍,趙立琴,等.寒地水稻磷素適宜施用量的研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),2011,23(4):15-19.

[20] 侯迷紅,范富,紀(jì)鳳輝,等.氮肥用量對(duì)庫(kù)倫旗蕎麥干物質(zhì)積累與分配的影響[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2017,32(1):65-69.

[21] 楊娟,李中林,鄔秀宏,等.氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)茶樹(shù)組培苗生長(zhǎng)影響研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013,26(5):1962-1965.

[22] 高日,樸炫春,于曉坤,等.人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中蔗糖和無(wú)機(jī)鹽對(duì)皂苷生產(chǎn)的影響[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(2):89-93.

[23] Cui X H,Chakrabarty D,Lee E J,et al.Production of adventitious roots and secondary metabolites byHypericumperforatumL.in a bioreactor[J].Bioresource Technol,2010,101(12):4708-4716.

Effect of factors affecting phenolic and flavonoid accumulation ofAnoectochilusroxburghiiduring suspension cultureof adventitious buds

LIU Guanfu, JIN Meiyu, LI He, WANG Hongqiu, JIANG Xiaolong, PIAO Xuanchun*

(AgriculturalcollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

In order to screening out a suitable culture medium for phenolic and flavonoid accumulation of adventitious buds during suspension culture, four factors and 8 levels with MS medium strength, concentrations of benzyladenine (BA), kinetin (KT), and α-naphthylacetic acid (NAA) and the 3 factors and 7 levels with concentrations of sucrose, total phosphorus, and total nitrogen were designed by the uniform design method, and their effects on phenolic and flavonoid accumulation were investigated. The results showed that among the combinations of MS medium strength, BA, KT, and NAA, phenolic and flavonoid contents and productivities were favorable at the combination of 3/4MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA; among the combinations of sucrose, phosphorus, and nitrogen, the combination of 35 g/L sucrose+0.93 mM phosphorus+45 mM nitrogen was optimal. The ratio of NO3-/NH4+also had an influence, the maximum phenolic and flavonoid accumulation were found at the NO3-/NH4+ratio of 30/15 mM, where the productivities of total phenolics and flavonoids reached 112.7 mg/L and 87.9 mg/L, respectively. Therefore, the suspension culture of adventitious buds for phenolic and flavonoid production, the suitable culture medium was 3/4 MS culture containing 0.93 mM phosphorus, 30 mM NO3-and 15 mM NH4+supplemented with 2.0 mg/L BA, 0.2 mg/L KT, 0.5 mg/L NAA, and 35 g/L sucrose.

anoectochilusroxburghii; adventitious bud; culture medium; phenolics; flavonoids

2017-03-10 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31260182和31660080);延邊大學(xué)青年基金項(xiàng)目[延大科合字(2017)23號(hào)]

劉冠甫(1992—)，男，吉林敦化人，在讀碩士，研究方向?yàn)橹参锝M織培養(yǎng)及生物反應(yīng)器的應(yīng)用。金美玉為通信作者，

E-mail:jinmeiyu@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)02-0023-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.02.004

S567.239

A