車爽，程然，蔣薇，張健，薄士儒

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132001）

鹿茸膠原蛋白對創(chuàng)傷愈合作用的試驗研究

車爽，程然，蔣薇，張健，薄士儒*

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132001）

目的：研究鹿茸膠原蛋白對創(chuàng)傷愈合的影響，比較不同濃度膠原蛋白對創(chuàng)傷愈合的影響程度。方法：采用低溫酶解法提取鹿茸膠原蛋白，在正常小鼠皮部造成急性創(chuàng)傷模型，設(shè)1個對照組，1個京萬紅陽性對照組，3個實驗組分別涂不同濃度膠原蛋白。觀察創(chuàng)面愈合情況，用創(chuàng)傷愈合率體現(xiàn)。并測其皮膚強脯氨酸含量，進而對比膠原含量。結(jié)果：高濃度膠原蛋白涂抹的傷口愈合率較高，其皮部膠原較多。結(jié)論：鹿茸膠原蛋白對創(chuàng)傷愈合有促進作用，且愈合程度與膠原蛋白的濃度有關(guān)。

生藥學(xué)；膠原蛋白；創(chuàng)傷愈合；羥脯氨酸

鹿茸具有廣泛的藥理作用，但是深加工研究滯后，對其提取物有效活性成分的研究甚少。膠原蛋白由于結(jié)構(gòu)獨特，理化性質(zhì)及生物特性非常突出，在醫(yī)療上的應(yīng)用具體表現(xiàn)在膠原蛋白具有低免疫源性、組織之間的協(xié)調(diào)作用強、物理機械性能好，可生物降解度高，具體體現(xiàn)在止血、治療燒傷和骨折等方面手術(shù)的應(yīng)用。

目前，以鹿茸為主料，分離提取出對醫(yī)學(xué)，對機體具有調(diào)節(jié)作用的膠原蛋白活性物質(zhì)成分，研究其對皮膚創(chuàng)傷愈合作用的研究未見報道。通過本研究為后續(xù)開發(fā)鹿茸膠原蛋白相應(yīng)的藥品（如噴劑）奠定理論基礎(chǔ)，以達到科學(xué)利用現(xiàn)有的鹿茸資源，增加鹿茸產(chǎn)品附加值的目的，從而促進我國鹿業(yè)養(yǎng)殖實現(xiàn)可持續(xù)性發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計、高速離心機、真空冷凍干燥機。

1.2 實驗材料

新鮮鹿茸，清潔級胰蛋白酶，清潔級小白鼠50只，羥脯氨酸標準品等。

1.3 方法

1.3.1 提取在4℃條件下，利用鹽酸使梅花鹿茸灰分中的不溶物變成可溶性鹽類，選擇氯化鈉溶液作為除雜蛋白的主要試劑，達到將其脫除的目的[1]。采用徐云鳳的胰蛋白酶水解制備鹿茸膠原蛋白的方法，取新鮮的鹿茸50克，加入150毫升乳酸鹽的緩沖液，用組織絞碎機絞碎，加入胰蛋白酶0.5克，加入激活劑氯化錳0.05克，p H值調(diào)為8.0，將溶液的溫度調(diào)至52℃，放入反應(yīng)罐3小時，離心去殘渣，收集透明澄清的液體，在10℃條件下進行酶解提取[2]。

1.3.2 純化在中性條件下鹽析全部膠原蛋白，方法如下：向梅花鹿茸膠原蛋白酶解液中緩慢加入，并攪拌經(jīng)過研磨的氯化鈉，充分攪拌，靜止10～24小時,以便膠原蛋白充分析出，再以8000轉(zhuǎn)的速度離心，收集沉淀物后用0.5m o l/L乙酸進行溶解，并對0.5m o l/L乙酸進行透析，以便除去沉淀中的多余鹽分，最后將樣品進行真空凍干[3]。

1.3.3 動物造模分組及給藥購買清潔級小白鼠50只，分別用乙醚進行淺麻醉。局部備皮，常規(guī)消毒，將小鼠皮部取直徑為1厘米的圓形切口，切開皮膚全層,至深筋膜,制作出直徑相同的圓形創(chuàng)面,然后以無菌紗布覆蓋,造模完成。把小鼠隨機分成五組，根據(jù)人和小鼠的體重與表面積比計算得出小鼠給藥量=小鼠體表面積×小鼠體重/人的體表面積×人的體重×人體用量。設(shè)高、中、低3個實驗組，1個空白對照組，1個陽性對照組，將實驗組創(chuàng)面分別使用0.05m o l/L，0.25m o l/L，0.5m o l/L的梅花鹿茸膠原蛋白，每日兩次，空白組不進行藥物治療，陽性對照組用京萬紅以相同藥量做陽性對照。以無菌紗布覆蓋，防止感染，連續(xù)給藥觀察。

1.3.4 羥脯氨酸含量檢測膠原蛋白是構(gòu)成結(jié)締組織中膠原纖維的主要成分，含羥脯氨酸的量最多，是愈合組織中最重要的成分，在一定時間內(nèi)，創(chuàng)傷愈合部位組織中的膠原蛋白的含量會反映傷口的愈合程度[4]。羥脯氨酸是膠原蛋白中的特征性氨基酸，因此測定動物組織中羥脯氨酸的含量即可定量觀察創(chuàng)傷組織的愈合程度。取創(chuàng)面皮膚經(jīng)脫水及脫脂處理后水解，根據(jù)羥脯氨酸的測定原理，使用氯化亞錫對梅花鹿茸膠原蛋白樣品進行水解使其釋放羥脯氨酸，加入氯氨T、二甲氨基苯甲醛，于558納米波長處比色，比較羥脯氨酸含量。若實驗組羥脯氨酸含量高于空白對照組，則說明創(chuàng)面膠原蛋白水平提高，即創(chuàng)面?zhèn)谟锨闆r較好[5]。

1.3.5 創(chuàng)面愈合情況評價描記創(chuàng)面愈合面積，以創(chuàng)面完全上皮化（病理證實）作為判斷依據(jù)，記錄創(chuàng)面愈合時間。每天觀察傷口愈合情況，并將創(chuàng)面描記在半透明的紙上，再以半透明紙作為模板，將質(zhì)地均勻的硬紙片剪成圖樣大小，以硬紙片重量間接表示創(chuàng)面及愈合部分面積大小，將數(shù)據(jù)統(tǒng)計起來，并以下式計算：創(chuàng)面愈合率（%）=（開始創(chuàng)傷面積-未愈合創(chuàng)面面積）/開始創(chuàng)傷面積[6]。再以實驗組和對照組的創(chuàng)面愈合率進行對比，來確定鹿茸膠原蛋白是否起到愈合傷口的作用[7]。

2 實驗結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

5個分組創(chuàng)傷涂藥后均有不同程度的創(chuàng)面腫脹、滲出現(xiàn)象。傷口用藥組涂藥后創(chuàng)面出現(xiàn)腫脹、滲出程度較對照組輕。5個分組創(chuàng)傷2天后創(chuàng)面均有不同程度的干燥、結(jié)痂現(xiàn)象，其痂皮呈淡黃色，質(zhì)地較軟，無異常分泌物出現(xiàn)及感染情況出現(xiàn)。

2.2 小鼠創(chuàng)面愈合率（見表1）

表1 分別在第2天、5天、8天、12天測得創(chuàng)面愈合率

2.3 羥脯氨酸標準樣品濃度與吸光度的測定結(jié)果（見表2）

表2 羥脯氨酸標準樣品濃度與吸光度的測定結(jié)果

2.4 以羥脯氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線（見圖1）

圖1 標準曲線

計算其回歸方程為：y=0.076x+0.0035，r＝0.9995（P＜0.001），因此，吸光度和羥脯氨酸濃度之間有很好的相關(guān)性。2.5小鼠組織中羥脯氨酸含量的測定（見表3）

表3 小鼠組織中羥脯氨酸含量的測定

由表3可知，小鼠創(chuàng)傷處組織中羥脯氨酸的含量逐漸遞增，由于羥脯氨酸濃度和膠原蛋白濃度成正相關(guān)，羥脯氨酸濃度的變化即可反映小鼠組織中膠原蛋白的變化，由此可知，鹿茸膠原蛋白對傷口愈合的對比情況。

3 討論與分析

經(jīng)實驗初步證明，鹿茸膠原蛋白對傷口創(chuàng)傷愈合有促進作用，不同濃度膠原蛋白對傷口的愈合率不同，高濃度的愈合率大于不用藥的傷口愈合率，且傷口的愈合程度與鹿茸膠原蛋白的濃度有關(guān)。

[1]葉易春,但衛(wèi)華.酶法提取牛鍵膠原的研究[J].中國皮革,2005,34(07)∶4-7.

[2]周文常,但衛(wèi)華,廖隆理,等.豬皮膠原蛋白的提取及其結(jié)構(gòu)表征[J].中國皮革,2004,33(13)∶36-38.

[3]王燕,付萬冬,鄭斌.酶法提取魷魚皮膠原蛋白[J].食品科技,2011,(06).

[4]付小兵,孫同柱.幾種用于創(chuàng)作修復(fù)研究的動物模型.中華實驗外科雜志,1999,16(05)∶479-480.

[5]陳玉華,廖仕成,李瑞園,等.乳及乳制品中羥脯氨酸測定方法的研究[J].職業(yè)與健康,2010,2(03)∶283-285.

[6]彭方毅,周歡,姜海蓉,袁兵占,崔玉花.一種新型優(yōu)化的肺組織羥脯氨酸水平測定方法的建立[J].重慶醫(yī)學(xué),2014,(11).

[7]楊晶,孫鳳,丁武.波爾山羊雜交代肌肉中羥脯氨酸含量的測定及其與肌肉品質(zhì)的關(guān)系[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2012,(01).

S865.42

A

10.14025/j.cnki.jlny.2017.13.017

車爽，在讀本科生，研究方向，制藥工程。

薄士儒，碩士，助教，研究方向：生藥學(xué)和藥理學(xué)。