時麗冉，趙明輝，李會敏，喬文臣，孫書孌，孟祥海，李丁，李強(qiáng)，魏建偉，白麗容，趙鳳梧*

（1.衡水學(xué)院，河北衡水053000；2.河北省農(nóng)作物抗旱研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所，河北衡水053000）

小麥基因型衡9966與親本及近緣品種葉綠素組分分析

時麗冉1，趙明輝2，李會敏2，喬文臣2，孫書孌2，孟祥海2，李丁2，李強(qiáng)2，魏建偉2，白麗容1，趙鳳梧2*

（1.衡水學(xué)院，河北衡水053000；2.河北省農(nóng)作物抗旱研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所，河北衡水053000）

從植物生理學(xué)角度，對小麥雙親和衍生后代以及親本近緣品種葉綠素組分、比例和總含量進(jìn)行分析，可為品種選育及知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供依據(jù)。取越冬期冬小麥基因型衡9966及其親本良星99和良星66以及親本近緣品種濟(jì)麥22的幼苗葉片，進(jìn)行葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a＋b含量以及葉綠素a/b測定與顯著性分析。結(jié)果表明：衡9966的葉綠素a含量、葉綠素b含量及其二者總量和比值均高于雙親本及濟(jì)麥22，其中，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a＋b含量差異達(dá)到了極顯著水平；葉綠素a/b與雙親和雙親平均值差異達(dá)到了顯著水平，但與濟(jì)麥22無顯著差異。衡9966葉綠素a含量分別較良星66、良星99、濟(jì)麥22高57.89%、46.34%和17.65%，較高的葉綠素a含量導(dǎo)致其葉片顏色較深。葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素a＋b含量、葉綠素a/b這4個指標(biāo)均具有明顯的正向超親現(xiàn)象，育種選擇十分有效。葉綠素組分、比例及總含量可以作為檢測品種真實(shí)性的手段和方法之一，用于知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)。

小麥；親本；葉綠素；品種保護(hù)

小麥?zhǔn)鞘澜缰饕Z食作物之一，也是我國的三大糧食作物之一，世界上有35%的人口以小麥為主食。研究表明，不斷選育和推廣優(yōu)良品種是提高小麥產(chǎn)量最經(jīng)濟(jì)有效的措施[1]。因此，小麥遺傳多樣性研究和品質(zhì)改良顯得越發(fā)突出，其對生物多樣性的保護(hù)和生物資源的可持續(xù)利用都具有重要意義，因而受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視[2]。知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)是對創(chuàng)新成果的法律確認(rèn)和有效保障[3]，其中，植物新品種保護(hù)事關(guān)國家農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)地位的穩(wěn)定，是農(nóng)業(yè)和種業(yè)發(fā)展的焦點(diǎn)，也是農(nóng)民可持續(xù)增收的有力支撐，在作物新品種審定與應(yīng)用中起到越來越大的作用[4]。在品種審定中，比較試驗(yàn)指標(biāo)[5]、DUS測試指標(biāo)、DNA指紋檢測[6]、轉(zhuǎn)基因檢測等一系列科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑u價標(biāo)準(zhǔn)勢必會對品種的真實(shí)性檢測、審定、開發(fā)、分類、管理、保護(hù)等產(chǎn)生重大影響，進(jìn)一步規(guī)范我國種業(yè)的發(fā)展道路[7，8]，同時，還可為小麥遺傳資源的收集、保存、分類、評價以及核心種質(zhì)的建立等研究工作提供理論依據(jù)[9]。

鑒于遺傳育種的進(jìn)步與遺傳背景差異、新品種的要求與資源創(chuàng)新進(jìn)展要求、統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用在新品種DUS特異性判定等方面的作用日趨明顯[10，11]，Eeuwijk等[12]提出了使用單元和多元統(tǒng)計方法來判定植物新品種的特異性，程海榮等[13]對水稻（Oryza sativa L.）申請品種及其近似品種測試性狀的差異顯著性判定進(jìn)行了分析，為判定品種的特異性提供了依據(jù)；徐振江等[14]則針對水稻申請品種數(shù)量性狀倒二葉葉舌長度、莖稈長度、莖稈粗細(xì)、劍葉葉片長度、劍葉葉片寬度、穗長、每穗粒數(shù)、谷粒長、谷粒寬、谷粒長寬比DUS田間測試，利用t顯著性統(tǒng)計分析方法判別特異性，指出統(tǒng)計分析判別是除指南判別外的重要判別依據(jù)。在測試性狀的篩選和判定方面，我國學(xué)者利用變異系數(shù)、t檢驗(yàn)、系統(tǒng)聚類法等方法，分別對百合、唐菖蒲、菊花的DUS測試指南候選性狀的一致性、穩(wěn)定性進(jìn)行了分析判定，進(jìn)而篩選出可用于品種特異性判定的葉片顏色、莖顏色分布、花柱顏色、葉片寬度、株高等性狀[15～18]。

葉綠體是小麥進(jìn)行光合作用的場所，葉綠素是小麥葉綠體中參與光合途徑最為重要的光合色素，其在光合作用的過程中扮演著重要角色[19]。葉綠素是一類含脂的色素家族，位于類囊體膜，改良小麥葉綠素的遺傳特性成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)[20～23]。董連生[24]通過分子生物學(xué)與生理學(xué)結(jié)合的方法，對雙親及RILs群體等材料定位了2個控制小麥?zhǔn)⒒ㄆ凇⒐酀{期的葉綠素含量主效QTL，分別位于2AS和5AL上。

葉綠素吸收大部分的紅光和紫光，但反射綠光，因此呈現(xiàn)綠色，其在光合作用的光吸收方面起核心作用。葉綠素為鎂卟啉化合物，包括葉綠素a、b、c、d、f以及原葉綠素和細(xì)菌葉綠素等[25]。其中，葉綠素a的最大吸收光波長為420～663 nm，葉綠素b的最大吸收波長范圍為460～645 nm。在顏色上，葉綠素a呈藍(lán)綠色，而葉綠素b呈黃綠色[26]。較高的葉綠素a含量和葉綠素a/b（葉綠素a含量/葉綠素b含量）與作物的抗逆性呈正相關(guān)[27～29]，與光合作用產(chǎn)物的多少有著非常密切的關(guān)系[30]，并均能影響小麥基因的一般配合力和特殊配合力[31]。但截至目前，采用上述生理指標(biāo)即葉綠素含量、組分和熒光對后代以及親本進(jìn)行評判的研究尚未見報道。

衡9966是河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所選育的一個小麥新品系，目前已參加河北省冀中南節(jié)水組生產(chǎn)試驗(yàn)。田間目測發(fā)現(xiàn)，衡9966與其親本良星99和良星66以及親本近緣品種濟(jì)麥22（與良星99和良星66來源于共同親本魯麥14）的苗期葉片顏色存在較大差異，推測該現(xiàn)象與葉片的葉綠素組成即葉綠素a含量、葉綠素b含量及其比例有關(guān)。因此，對衡9966與其親本以及親本近緣品種濟(jì)麥22苗期葉片的葉綠素組成指標(biāo)進(jìn)行了測定，分析了4個基因型小麥的差異，根據(jù)研究結(jié)果，作者提出可以將后代與親本的葉綠素組分和比例作為檢測品種真實(shí)性的手段和方法之一，用于知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試小麥基因型為衡9966，來源于河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所小麥遺傳育種課題組。其選育過程為：2009年配制雜交組合〔8099（良星99/小黑麥//良星99）/良星66），收獲后對F0進(jìn)行60Co輻射處理；2010年F1代選育，同時對收獲種子再次進(jìn)行輻射處理，以增加優(yōu)良變異；2011～2016年后代系譜法選育。

親本良星99和良星66，均來源于山東德州市良星種子研究所；親本近緣品種濟(jì)麥22，來源于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間設(shè)計田間試驗(yàn)在河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所節(jié)水試驗(yàn)站（東經(jīng)115°42′、北緯37°44′，海拔31.7 m）進(jìn)行。2016年10月6日造墑播種小麥，設(shè)衡9966、良星99、良星66和濟(jì)麥22計4個基因型處理。小區(qū)面積11.48 m2（行長8.5 m，行距15 cm，9行/區(qū)），間比法排列，小麥種植順序?yàn)榱夹?6—衡9966—良星99—衡9966—濟(jì)麥22，2次重復(fù)。小麥基本苗數(shù)量均為330萬株/hm2，田間管理同常規(guī)。

1.2.2 測定項目與方法參考張憲政[32]的丙酮-乙醇混合液提取法，測定葉綠素含量。2017年2月15日，每品種均田間選取越冬期幼苗5株，帶回室內(nèi)；剪取整株葉片混合，用蒸餾水沖洗干凈、吸水紙吸干，切成長1 cm的小段；準(zhǔn)確稱量0.2 g，放入具塞的試管中，加入丙酮和無水乙醇各10 mL，蓋好塞子搖勻，在室溫、黑暗條件下提取，直至葉片變白（約48 h）；然后，分別在663 nm和645 nm處測定吸光度。利用公式，計算葉綠素組分各指標(biāo)值：

葉綠素a含量（mg/g）=（12.7A663-2.69A645）×提取液體積（L）/植物材料鮮重（g）

葉綠素b含量（mg/g）=（22.9 A645-4.68 A663）×提取液體積（L）/植物材料鮮重（g）

葉綠素a＋b含量（mg/g）=（8.02 A663+20.21 A645）×提取液體積（L）/植物材料鮮重（g）

葉綠素a/b=葉綠素a含量/葉綠素b含量

超親優(yōu)勢（%）=（衡9966指標(biāo)值-親本指標(biāo)值）/親本指標(biāo)值×100

雙親平均數(shù)（%）=（親本1指標(biāo)值+親本2指標(biāo)值）/2×100

超雙親優(yōu)勢（%）=（衡9966指標(biāo)值-雙親指標(biāo)值平均數(shù)）/雙親指標(biāo)值平均數(shù)×100

1.2.3 數(shù)據(jù)分析利用DPSc數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 參試小麥基因型的苗期葉片顏色

苗期田間目測結(jié)果（圖1）顯示，衡9966與其親本以及近緣品種濟(jì)麥22的葉片顏色深淺有一定差異，顏色由深到淺的品種順序依次為衡9966、濟(jì)麥22、良星99、良星66。

圖1 參試小麥基因型的苗期葉片顏色Fig.1 Leaves color performance of 4 genotypes young seedlings in field

2.2 參試小麥基因型的葉綠素組分分析

測定結(jié)果（表1和2）顯示，衡9966與其親本以及近緣品種濟(jì)麥22的葉綠素含量及其組成差異較大，其中，葉綠素a含量分別較良星66、良星99、雙親平均值、濟(jì)麥22高57.89%、46.34%、51.90%和17.65%，葉綠素b含量分別較良星66、良星99、雙親平均值、濟(jì)麥22高49.17%、35.74%、42.14%和13.30%，葉綠素a+b含量分別較良星66、良星99、雙親平均值、濟(jì)麥22高55.97%、42.89%、49.14%和16.56%，差異均達(dá)到了極顯著水平；葉綠素a/b分別較良星66、良星99、雙親平均值、濟(jì)麥22高6.43%、7.31%、6.87%和4.08%，其中，與雙親及其平均值差異達(dá)到了顯著水平，但與濟(jì)麥22差異不顯著。可以看出，衡9966的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素含量以及葉綠素a/b均出現(xiàn)了明顯的超中親和超高親優(yōu)勢。

表1 參試小麥基因型的葉綠素含量及其組成Table 1 Recording of chlorophyll content and com position of genotypes

表2 衡9966與雙親以及濟(jì)麥22葉綠素含量及其組成的比較Table 2 Comparison of chlorophyll content and composition of Heng 9966 w ith its parents and Jimai 22

3 結(jié)論與討論

統(tǒng)計分析結(jié)果表明，衡9966與親本良星99和良星66以及親本近緣品種濟(jì)麥22相比，葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素a+b含量和葉綠素a/b均出現(xiàn)了正向超親優(yōu)勢，其中，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量差異均達(dá)到了極顯著水平；而葉綠素a/b，與雙親相比差異達(dá)到了顯著水平，但與濟(jì)麥22差異并不顯著。上述結(jié)果，與SNP（單核苷酸多態(tài)性）芯片Wheat660對良星99和良星66材料分析，多態(tài)性位點(diǎn)32 663個的結(jié)果（另文報道）相同。

衡9966與雙親以及親本近緣品種濟(jì)麥22葉片顏色的差異，主要是葉綠素a含量發(fā)生變化引起[26，33]，其葉綠素a含量分別超雙親46.34%和57.89%，本研究結(jié)果高于韋宏恩等[33]后代超雙親29.16%和38.41%的試驗(yàn)結(jié)果，可能與試驗(yàn)所選親本、親本遺傳力以及后代選育方法的不同有關(guān)。鑒于衡9966既來源于雙親雜交，且中間F0和F1種子又經(jīng)過輻射處理，二者對葉綠素組成、比例及葉綠素總含量的影響，有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，衡9966的葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素a/b均明顯地超過了高親值，揭示出該現(xiàn)象與雙親遺傳背景有關(guān)。與前人葉綠素含量a/b是穩(wěn)定的遺傳性狀，具有雜種優(yōu)勢，屬數(shù)量遺傳性狀，受微效多基因控制的研究結(jié)論[22，34]相一致。張志鵬[31]對24個小麥品種葉綠素觀察發(fā)現(xiàn)，不同品種間葉綠素含量差異較大，最低品種與最高品種相差18.7%，并認(rèn)為葉綠素a含量、b含量、a+b含量和a/b均能影響小麥基因型的一般配合力以及特殊配合力，而小麥基因型的一般配合力與特殊配合力都能直接或間接地影響小麥葉綠素的遺傳力。本研究中，衡9966與親本良星99和良星66在葉綠素a含量、葉綠素b含量及葉綠素a+b含量上差異均達(dá)到了極顯著水平，對生理育種親本選擇和后代選育帶來了啟示。在小麥育種實(shí)踐中注重生理學(xué)與遺傳學(xué)相結(jié)合進(jìn)行生理育種，注重親本葉綠素含量以及葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素a+b含量、葉綠素a/b選擇，將為實(shí)現(xiàn)光合速率與抗逆性的同步提高提供遺傳基礎(chǔ)。上述4個指標(biāo)均具有超親優(yōu)勢，育種選擇十分有效。同時，與親本相比，衡9966較高的葉綠素含量及a/b，揭示出其抗逆性和豐產(chǎn)性較雙親更突出，展示出其應(yīng)用前景。該結(jié)論已在芹菜、菠菜、豌豆及芝麻等其他植物上所證實(shí)[35～37]。

葉綠素組分、比例及葉綠素總含量等參數(shù)可以作為檢測品種真實(shí)性的手段和方法之一，用于知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)和新品種審定及管理。目前，有關(guān)衡9966較高的葉綠素含量和a/b與其抗逆性、豐產(chǎn)性以及與親本之間的遺傳關(guān)系研究將進(jìn)一步開展，部分試驗(yàn)正在進(jìn)行之中。

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Analysis of Chlorophyll Composition of W heat Genotype Heng 9966 w ith Its Parents and Their Closely Related Variety

SHI Li-ran1，ZHAO ming-hui2，LI Hui-min2，QIAO Wen-chen2，SUN Shu-luan2，MENG Xiang-hai2，LI Ding2，LI Qiang2，WEI Jian-wei2，BAI Li-rong1，ZHAO Feng-wu2*
（1.Hengshui University，Hengshui 053000，China；2.Hebei Key Laboratory of Crop Drought Tolerance Research，Dry Farming Institute of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Hengshui 053000，China）

This paper analyzed the composition，proportion and total content of chlorophyll in wheat parents，their offspring and their closely relative cultivars，in order to provide basis for variety breeding and protection of intellectual property rights from the physiological point of view.Leaves of seedlings of winter wheat genotypes Heng 9966 and the parents of Liangxing 99 and Liangxing 66，and their closely relative cultivar Jimai 22 were sampled，4 indexes of chlorophyll a，chlorophyll b，the ratio of chlorophyll a with chlorophyll b（a/b）and total chlorophyll content were analyzed by ways of significant test.Results showed that the 4 indexes of chlorophyll a，chlorophyll b，the total chlorophyll of a＋b content and the ratio of chlorophyll a with chlorophyll b（a/b）of Heng 9966 were all higher than those 3 ones.Among them the chlorophyll a，chlorophyll b and chlorophyll a＋b content were all matched extremely significant differences at 0.01 levels than that of parents，mid-parent value and Jimai 22.The ratio of a/b was 0.05 significantly higher than the parents and mid-parent value，but there was no difference with Jimai 22.The content of chloroph yll a of Heng 9966 was 57.89%，46.34%and 17.65%higher than that of Liangxing 66，Liangxing 99 and Jimai 22，respectively，that led to the deep er color of leaves.The 4 indexes of chlorophyll a，chlorophyll b，chlorophyll a+b and chlorophyll a/b were all demonstrated positive super parent heterosis，and theselection of breeding was very effective.Parameters of chlorophyll composition，proportion，and total content could be used as one of the means and methods to detect the authenticity of varieties and for the protection of intellectual property rights.

Wheat；Parents；Chlorophyll；Variety protection

S512.1＋1

：A

：1008-1631（2017）02-0072-05

2017-03-10

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2016YFD0101602）；國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2016YFD0102101）；國家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-3-2）；河北省小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目

時麗冉（1970-），女，河北深縣人，教授，主要從事植物生理學(xué)研究。E-mail：slr701212@163.com。

趙鳳梧（1958-），男，河北棗強(qiáng)人，研究員，主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail：zhaofw@126.com。