高 超，劉 陽，趙 佳，張雪松，王宇飛，楊月欣

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所，北京 100050)

姜黃素對(duì)急性游泳訓(xùn)練小鼠骨骼肌損傷的保護(hù)作用

高 超，劉 陽，趙 佳，張雪松，王宇飛，楊月欣

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所，北京 100050)

目的：探討姜黃素對(duì)急性游泳訓(xùn)練小鼠骨骼肌損傷的保護(hù)作用。方法：成年雄性BALB/C小鼠隨機(jī)分為安靜對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)+姜黃素組[100 mg/(kg·d)]和安靜+姜黃素組[100 mg/(kg·d)]。干預(yù)期為4w，干預(yù)期最后1w同時(shí)進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，每天訓(xùn)練90min，采用以上運(yùn)動(dòng)方式連續(xù)運(yùn)動(dòng)7d，末次運(yùn)動(dòng)完成后即刻處死小鼠。測(cè)定血清肌酸激酶(CK)含量及骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平，并觀察骨骼肌普通及超微病理學(xué)改變。結(jié)果：與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比，姜黃素干預(yù)明顯抑制了游泳運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的小鼠血清CK水平的上升(P<0.01)，減輕了運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的骨骼肌普通及超微病理結(jié)構(gòu)異常。姜黃素干預(yù)顯著抑制了運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的小鼠骨骼肌GSH水平的下降(P<0.05)，同時(shí)拮抗了ROS和MDA含量水平的上升(P<0.01)。結(jié)論：姜黃素對(duì)小鼠急性游泳訓(xùn)練導(dǎo)致的骨骼肌損傷具有明顯的抗氧化保護(hù)作用。

姜黃素；急性游泳訓(xùn)練；氧化應(yīng)激；超微病理

研究發(fā)現(xiàn)，在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)、訓(xùn)練誘發(fā)肌肉損傷的機(jī)制方面，活性氧(ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[1-2]。機(jī)體在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，ROS大量產(chǎn)生，細(xì)胞抗氧化和氧化平衡被打破，氧化應(yīng)激水平增加，細(xì)胞膜和線粒體膜受到ROS攻擊，其通透性、流動(dòng)性改變，線粒體的氧化磷酸化解偶聯(lián)水平增加，進(jìn)一步抑制ATP合成，細(xì)胞動(dòng)作電位也發(fā)生改變，最終影響骨骼肌細(xì)胞的生理功能，導(dǎo)致肌肉發(fā)生過勞性損傷[3-5]。因此，尋找天然、安全的拮抗運(yùn)動(dòng)勞損的抗氧化營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑，及時(shí)、有效地清除急性運(yùn)動(dòng)過程中骨骼肌過多產(chǎn)生的自由基，對(duì)于預(yù)防運(yùn)動(dòng)過勞性肌肉損傷、保障訓(xùn)練效果越發(fā)關(guān)鍵[6-7]。姜黃素可作為高效的抗氧化劑清除體內(nèi)自由基，同時(shí)具有很好的抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)糖脂代謝以及免疫等多種生物學(xué)活性[8-9]。本研究建立小鼠急性游泳訓(xùn)練損傷模型，評(píng)價(jià)姜黃素對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)骨骼肌損傷的保護(hù)效應(yīng)，為天然植物化合物應(yīng)用于抗運(yùn)動(dòng)勞損營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的研發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性BALB/C清潔級(jí)小鼠，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，5w齡，體重18～20 g，共計(jì)40只。小鼠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室清潔級(jí)動(dòng)物房，自由飲食，動(dòng)物室溫度20±2 ℃，相對(duì)濕度50%±5%。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 BS-200全自動(dòng)生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；5804-R低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Spectra Max M2 酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2.2 主要試劑 肌酸激酶(CK)試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；姜黃素、DTNB、TBA、GSH、TTOP等試劑，美國(guó)Sigma公司；DHE熒光探針，碧云天生物技術(shù)公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立 經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，40只成年雄性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(Ct)、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(Ex)、運(yùn)動(dòng)+姜黃素100 mg/(kg·d)組(Ex+Cur)和安靜+姜黃素100 mg/(kg·d)組(Cur)，每組10只。姜黃素以灌胃方式進(jìn)行干預(yù)，而安靜對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)對(duì)照組則灌胃以等量的生理鹽水，干預(yù)期為4w，干預(yù)期最后1w同時(shí)進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，水溫控制在30±1℃，水深45 cm，進(jìn)行連續(xù)7d無負(fù)重游泳訓(xùn)練，每天持續(xù)90min。

1.3.2 取材及樣品制備 小鼠最后1d游泳結(jié)束后，摘眼球取血并分離血清，測(cè)定血清CK含量。迅速切取骨四頭肌組織塊后立即于4%的中性多聚甲醛溶液中固定，準(zhǔn)備制作石蠟切片；取各組股四頭肌1 mm3左右放在2.5%戊二醛中4℃固定，進(jìn)行電鏡樣品制備。另取股四頭肌制備10%的勻漿液，離心(3 000r/min、10 min、4℃)，取上清液，測(cè)定GSH、MDA含量和SOD活性。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定 血清CK由BS-200全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)、GSHDTNB改良比色法、SOD按照南京建成試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定、MDA采用TBA比色法、ROS采用冰凍切片孵育DHE熒光探針法。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)小鼠血清CK水平的影響

如圖1所示，游泳訓(xùn)練導(dǎo)致小鼠血清中CK水平顯著升高(P<0.01)，而姜黃素干預(yù)顯著降低了運(yùn)動(dòng)組小鼠血清CK水平(P<0.01)。姜黃素自身對(duì)安靜小鼠血清CK含量未見明顯影響(P>0.05)。

圖1 姜黃素對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠血清CK水平的影響注：**P<0.01vs安靜對(duì)照組、##P<0.01vs運(yùn)動(dòng)對(duì)照組

2.2 姜黃素對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)小鼠骨骼肌病理形態(tài)學(xué)的影響

圖2光鏡下H&E染色顯示，安靜組小鼠肌纖維排列均勻、整齊，細(xì)胞核分布均勻。運(yùn)動(dòng)對(duì)照組肌纖維出現(xiàn)廣泛腫脹、扭曲、斷裂和破壞，肌纖維細(xì)胞核分布不均勻，出現(xiàn)輕微核聚集現(xiàn)象。運(yùn)動(dòng)+姜黃素組肌纖維排列大致整齊，細(xì)胞核分布較均勻，部分肌纖維出現(xiàn)扭曲、斷裂，但較運(yùn)動(dòng)對(duì)照組輕微。

本研究通過使用透射電子顯微鏡進(jìn)一步觀察姜黃素對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠骨骼肌超微病理損傷的保護(hù)效應(yīng)。由圖3可知，安靜對(duì)照組小鼠骨骼肌細(xì)胞肌纖維排列整齊、結(jié)構(gòu)完好，線粒體大小正常、外膜完整、嵴清晰。運(yùn)動(dòng)對(duì)照組小鼠骨骼肌細(xì)胞表現(xiàn)為損傷的、紊亂和不規(guī)則的肌纖維，以及低電子密度基質(zhì)、嚴(yán)重的水腫變形、嵴損毀或溶解等線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。而姜黃素干預(yù)小鼠則表現(xiàn)出肌纖維的局部紊亂以及線粒體的輕度腫脹變形，與運(yùn)動(dòng)對(duì)照小鼠相比，其超微結(jié)構(gòu)損傷明顯較輕。姜黃素本身對(duì)安靜小鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。

圖2 光鏡下觀察姜黃素對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠骨骼肌病理改變的影響(H&E染色，×400)

圖3 電鏡下觀察姜黃素對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠骨骼肌超微病理改變的影響

2.3 姜黃素對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)小鼠骨骼肌抗氧化防御系統(tǒng)的影響

如圖4所示，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組小鼠骨骼肌GSH含量較安靜對(duì)照組降低24.5%(P<0.01)，姜黃素干預(yù)顯著減輕了游泳運(yùn)動(dòng)引發(fā)的骨骼肌GSH水平的下降幅度(P<0.05)。從圖5可以看出，與安靜組小鼠相比，游泳運(yùn)動(dòng)使骨骼肌SOD活性增加了15.7%(P<0.05)，與運(yùn)動(dòng)組小鼠相比，姜黃素干預(yù)組小鼠SOD活力沒有顯著差異(P>0.05)。此外，姜黃素自身對(duì)骨骼肌的GSH水平和SOD活力未見明顯影響(P>0.05)。

圖5 姜黃素對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠骨骼肌SOD活性的影響注：*P<0.05vs安靜對(duì)照組

2.4 姜黃素對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)小鼠骨骼肌氧化應(yīng)激水平的影響

如圖6所示，與安靜對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組骨骼肌ROS的生成和MDA的含量分別增加了55.8%(P<0.01)和28.2%(P<0.01)。與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比，姜黃素干預(yù)使得骨骼肌ROS和MDA水平分別下降了10.0%(P<0.01)和11.6%(P<0.05)。與安靜對(duì)照組相比，姜黃素自身對(duì)骨骼肌ROS生成以及MDA含量沒有顯著影響(P>0.05)。

圖6 姜黃素對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠骨骼肌ROS水平的影響注：**P<0.01vs安靜對(duì)照組、##P<0.01vs運(yùn)動(dòng)對(duì)照組

圖7 姜黃素對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠骨骼肌MDA水平的影響 注：*、**P<0.05、P<0.01vs安靜對(duì)照組；#P<0.05vs運(yùn)動(dòng)對(duì)照組

3 討論

長(zhǎng)期接受大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的軍事人員和運(yùn)動(dòng)員等人群作為過勞性損傷的高發(fā)群體，其身體健康和正常的體能、軍事訓(xùn)練都可能受到嚴(yán)重影響[5]。本研究表明，1w的游泳訓(xùn)練導(dǎo)致了小鼠骨骼肌氧化損傷，而姜黃素發(fā)揮了良好的抗氧化保護(hù)作用。

正常情況下，血清CK活性較低，當(dāng)由于各種原因(肌肉萎縮、大量自由基攻擊等)引起肌肉細(xì)胞膜通透性增加或者細(xì)胞壞死時(shí)會(huì)大量釋放入血，常被認(rèn)為是肌肉損傷的重要標(biāo)志。本研究顯示，游泳運(yùn)動(dòng)組小鼠血清CK水平顯著上升，表明急性運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致小鼠骨骼肌細(xì)胞損傷使得CK大量釋放入血液。與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比，姜黃素干預(yù)小鼠血清CK含量明顯降低，提示姜黃素對(duì)游泳導(dǎo)致的肌細(xì)胞損傷發(fā)揮了明顯的拮抗效應(yīng)。Davis[10]等研究發(fā)現(xiàn)，下坡跑運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致小鼠血清CK水平增加和比目魚肌損傷，而姜黃素干預(yù)明顯抑制了血清CK的上升幅度。此外，本研究中，H&E染色及超微病理學(xué)檢查也顯示出，姜黃素干預(yù)明顯減輕了游泳運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的小鼠骨骼肌纖維和線粒體的超微結(jié)構(gòu)紊亂或異常。

研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的、大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)或者訓(xùn)練，導(dǎo)致機(jī)體生成過量的自由基，可能是誘發(fā)骨骼肌、心肌等組織損傷的關(guān)鍵因素[11-12]。本研究顯示，游泳運(yùn)動(dòng)小鼠骨骼肌的ROS和MDA含量增加，提示游泳后肌細(xì)胞受到大量自由基攻擊，細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平升高，同時(shí)，GSH也因拮抗肌細(xì)胞自由基反應(yīng)的增強(qiáng)而出現(xiàn)明顯消耗，其抗氧化能力顯著減弱，間接揭示了骨骼肌氧化損傷的加重。游泳小鼠骨骼肌SOD活力上升，可能是由于游泳產(chǎn)生的活性氧刺激以及相對(duì)應(yīng)的機(jī)體反饋調(diào)節(jié)。研究表明，運(yùn)動(dòng)過程中肌細(xì)胞缺氧時(shí)，ATP產(chǎn)生的數(shù)量與速率降低，供能不足，胞漿內(nèi)AMP、次黃嘌呤等產(chǎn)物大量累積，線粒體膜功能受損，大量產(chǎn)生ROS[13-14]，同時(shí)，SOD、GSH-Px等抗氧化酶嚴(yán)重消耗。當(dāng)肌細(xì)胞再次供氧時(shí)，次黃嘌呤氧化系統(tǒng)等方式生成過多自由基，使肌細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等受到直接攻擊，引發(fā)細(xì)胞膜以及線粒體和溶酶體的膜功能受損、胞漿Ca2+堆積等一系列的功能紊亂以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷[5，15-16]。

本研究中，姜黃素干預(yù)小鼠骨骼肌的ROS和MDA水平較運(yùn)動(dòng)對(duì)照組均有明顯降低，而GSH含量與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比有所增加，表明姜黃素發(fā)揮了良好的抗氧化作用。Kawanishi[17]等研究也發(fā)現(xiàn)，小鼠-15%坡度、22 m/min速度、150 min的下坡跑運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)模型中，姜黃素有效抑制了小鼠肌肉過氧化氫濃度和NADPH-oxidase mRNA表達(dá)的增高。Takahashi[18]等發(fā)現(xiàn)，在65% VO2max、60min的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)中，姜黃素增加了血液中的抗氧化能力，降低了運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的人體活性氧代謝產(chǎn)物的血清衍生物的上調(diào)。研究表明，姜黃素結(jié)構(gòu)中富含酚羥基，可通過直接捕捉自由基、抑制氧化酶系、激活和保護(hù)抗氧化酶系、螯合金屬離子等方式，清除自由基，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，減輕細(xì)胞損傷[19-20]。此外，姜黃素還可通過影響Nrf2、NF-kappaB等多種信號(hào)調(diào)控通路對(duì)細(xì)胞發(fā)揮抗氧化、抗炎等保護(hù)效應(yīng)，其機(jī)制有待深入研究[21-22]。

本研究表明，姜黃素對(duì)1w的游泳訓(xùn)練小鼠骨骼肌損傷發(fā)揮了明顯的抗氧化保護(hù)作用，為姜黃素拮抗急性運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肌肉損傷提供實(shí)驗(yàn)支持。◇

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Protective Effects of Curcumin on Intense Swimming Training Skeletal Muscle Damage in Mice

GAO Chao，LIU Yang，ZHAO Jia，ZHANG Xue-song，WANG Yu-fei，YANG Yue-xin

(National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China)

ObjectiveTo investigate protective effect of curcumin against intense swimming training-induced skeletal muscle damage.MethodAdult male BALB/C mice were randomly divided into 4 groups including rested controls，intense exercise，exercise + curcumin (100 mg/kg BW)and rested plus curcumin (100 mg/kg BW)supplementation. Curcumin was administrated for 4 weeks and exercise program (swimming for 90 min/d)was performed concurrently at the fourth week. Immediately upon final exercise，the mice were sacrificed. Serum creatine kinase and skeletal muscle ultrastructural malformation were examined.SOD，GSH，ROS，and MDA of skeletal muscle were analyzed.ResultCompared to exercise group，curcumin treatment declined intense swinmming-triggered the leakage of creatine kinase (P<0.01)and skeletal muscle ultrastructural malformation. Curcumin pretreatment evidently alleviated oxidative stress by inhibiting glutathione depletion (P<0.05)，ROS over-generation (P<0.01)，and lipid peroxidation in skeletal muscle of intense exercise mice (P<0.01).ConclusionCurcumin exhibited antioxidative protective role in intense exercise-induced injuries of skeletal muscle.

curcumin；intense swimming training；oxidative stress；ultrastructural pathology

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(項(xiàng)目編號(hào)：2012BAD33B01)；中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所青年科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：NINH201606)；中國(guó)科協(xié)青年人才托舉工程(項(xiàng)目編號(hào)：YESS20160164)。

高 超(1986— )，男，博士，助理研究員，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與健康。

楊月欣(1955— )，女，研究員，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與健康。