王文佳，陳志明，張納敏，周夢(mèng)穎，何華紅，李薇（廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣州510160）

凝膠法測(cè)定脂肪乳(10％)/氨基酸(15)/葡萄糖(20％)注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素

王文佳＊，陳志明，張納敏，周夢(mèng)穎，何華紅，李薇#（廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣州510160）

目的：采用凝膠法測(cè)定脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素。方法：依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”項(xiàng)下凝膠法，通過(guò)干擾試驗(yàn)確定樣品最大有效稀釋倍數(shù)，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證；將檢測(cè)結(jié)果與顯色基質(zhì)法比較。結(jié)果：凝膠法中供試品溶液稀釋24倍或以下時(shí)對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)無(wú)干擾作用，而顯色基質(zhì)法則為稀釋76倍或以下。結(jié)論：凝膠法可用于脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素；凝膠法；干擾試驗(yàn)；顯色基質(zhì)法

脂肪乳氨基酸-葡萄糖注射液為國(guó)家基本藥物之一，作為靜脈補(bǔ)給能量制劑，應(yīng)用越來(lái)越廣泛[1]。目前，2015年版《中國(guó)藥典》并未收錄脂肪乳/氨基酸/葡萄糖注射液品種，尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌內(nèi)毒素法，也尚無(wú)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)企業(yè)多采用顯色基質(zhì)法（Kinetic chromogenic assay，KCA）進(jìn)行測(cè)定。凝膠法雖靈敏度不如光度法[2]，但操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，適用范圍廣，受干擾小，是我國(guó)法定的仲裁檢驗(yàn)方法。

脂肪乳作為脂溶性的藥物載體[3]，其離子對(duì)凝膠法有很強(qiáng)的干擾作用；氨基酸注射液的凝膠試驗(yàn)亦有干擾作用[4]，十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）是助溶的表面活性劑[5]，本試驗(yàn)擬使用SDS溶液對(duì)脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液進(jìn)行稀釋以增強(qiáng)脂肪乳的穩(wěn)定性，消除干擾作用，并依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”項(xiàng)下凝膠法測(cè)定該制劑中的細(xì)菌內(nèi)毒素，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TW 12型水浴鍋（德國(guó)Julabo公司）；LK164-03型動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀（英國(guó)Lab Kinetics Ltd公司）。

1.2 藥品與試劑

脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液（英國(guó)Baxter SA公司，批號(hào)：13K06N20、13I19N20、13I18N40，規(guī)格：1 500m L∶10%脂肪乳注射液300m L+ 5.5%復(fù)方氨基酸600m L+20%葡萄糖注射液600m L）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150601-201479，規(guī)格：60EU/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1502120，規(guī)格：50m L/支）；鱟試劑[TAL，均通過(guò)鱟試劑靈敏度復(fù)核，凝膠法：湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1503112、1503042、1501212，標(biāo)示靈敏度（λ）：0.25、0.25、0.03 EU/m L；福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào)：14030312、14112212，λ：0.25、0.25、0.03EU/m L；KCA：湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1507310，檢測(cè)范圍：50～0.005 EU/ m L]。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

根據(jù)公式L＝K/M計(jì)算L[6]。式中，K為人每1 kg體質(zhì)量每1 h最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，注射劑K＝5 EU/（kg·h）；M為人每1 kg體質(zhì)量每1 h最大供試品劑量[6-7]。

根據(jù)樣品說(shuō)明書(shū)靜脈滴注1 h最大劑量為180m L，我國(guó)人均體質(zhì)量按60 kg計(jì)，滴注時(shí)間按1 h計(jì)（不足1 h仍按1 h計(jì)），故M＝180m L/（60 kg·1 h）＝3m L/（kg· h）。則L＝5 EU/（kg·h）/3m L/（kg·h）＝1.7 EU/m L。廠家附錄的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中三元混合物L(fēng)≤0.77 EU/m L，考慮老年患者及兒童用藥，按企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)定L＝0.77EU/m L。

2.2 干擾試驗(yàn)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

根據(jù)公式MVD＝c·L/λ[6]計(jì)算MVD。式中，L＝0.77 EU/m L；c為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/m L表示時(shí)，則c＝1.0m L/m L；λ為TAL的標(biāo)示靈敏度（《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》[7]建議干擾試驗(yàn)使用0.5EU/m L或0.25 EU/m L的TAL，本試驗(yàn)選擇λ＝0.25 EU/m L的TAL，MVD＝[（1.0 m L/m L）·0.77（EU/m L）]/0.25（EU/ m L）＝3，檢測(cè)不同λ的TAL（市售TAL的λ分別為0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU/m L）相對(duì)應(yīng)的MVD為1.5、3、6、12和24倍。

2.3 TAL靈敏度復(fù)核

將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用BET水溶解，制成2.0、1.0、0.5、0.25λ的溶液，按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“通則1143法”[6]操作，以BET水做2支陰性對(duì)照管（NC），對(duì)2個(gè)廠生產(chǎn)的TAL進(jìn)行λ復(fù)核。結(jié)果，5批TAL復(fù)核靈敏度均在0.5～2.0λ范圍內(nèi)，符合規(guī)定，詳見(jiàn)表1（注：“+”表示陽(yáng)性反應(yīng)，“-”表示陰性反應(yīng)，下同）。

表1 TAL的λ復(fù)核結(jié)果Tab 1 Recheck resultsofλfor TAL

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn)

取3批樣品各適量，等體積混合得樣品混合原液，用BET水將樣品稀釋成1.5、3、6、12倍溶液作為貯備液1～4，用0.002‰SDS溶液將樣品混合原液稀釋1.5倍得1.5倍供試品陰性對(duì)照溶液（NPC），再將貯備液1～4等比稀釋為3、6、12和24倍的NPC；同時(shí)，每一稀釋倍數(shù)下制備供試品陽(yáng)性對(duì)照系列溶液[PPC，即用該濃度的供試品稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ（0.5 EU/m L）濃度]。分別用上述不同稀釋倍數(shù)的NPC和PPC反應(yīng)，每一稀釋倍數(shù)平行做2支管。另取2支管加入BET水作為NC，2支管加入2.0λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽(yáng)性對(duì)照（PC）。取以上4種溶液進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Resultsof interference pretestof sam p les

由表2可見(jiàn)，3批樣品均分別稀釋24倍后，對(duì)2個(gè)廠家生產(chǎn)的λ＝0.25 EU/m L的TAL與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)無(wú)干擾作用。

2.5 干擾試驗(yàn)

根據(jù)干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，取3批樣品用BET水分別稀釋12倍后作為供試品溶液；用供試品溶液和BET水分別稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，制成細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.162 5EU/m L的系列溶液，每個(gè)濃度平行做4支管，再進(jìn)行TAL反應(yīng)。另取供試品溶液和BET水做2支NC，參考相關(guān)文獻(xiàn)[4]進(jìn)行干擾試驗(yàn)，按公式Es＝lg－1（∑Xs/4）和Et＝lg－1（∑Xt/4）[式中，Es為用BET水制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值；Et為用供試品溶液或0.002‰SDS溶液制成的細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值；Xs和Xt分別為用BET水和供試品溶液或0.002‰SDS溶液制成的細(xì)菌內(nèi)毒素（標(biāo)準(zhǔn)）溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)值（lg）]計(jì)算各濃度溶液反應(yīng)終點(diǎn)細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的絕對(duì)值，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，Es在0.5～2.0λ范圍內(nèi)，Et在0.5～2.0 λEs范圍內(nèi)，表明樣品稀釋24倍后對(duì)TAL（λ＝0.25 EU/ m L）與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)無(wú)干擾作用，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.6 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取“2.4”項(xiàng)的貯備液4用0.002‰SDS溶液等比稀釋，得稀釋24倍的溶液，用λ＝0.03 EU/m L的TAL進(jìn)行樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并按“2.4”“2.5”項(xiàng)下方法做PPC、PC、NPC、NC對(duì)照，詳見(jiàn)表4。由表4可知，2組TAL的檢查結(jié)果一致，均符合規(guī)定[6]。

表3 干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Resultsof interference test

表4 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab 4 Resultsofbacterialendotoxins testof samp les

2.7 KCA法（驗(yàn)證試驗(yàn)）

根據(jù)公式MVD＝c·L/λ計(jì)算MVD。L＝0.77EU/m L，KCA法的TAL靈敏度為50～0.005 EU/m L，因此選擇λ＝0.005 EU/m L。經(jīng)計(jì)算，MVD＝154。

根據(jù)可靠性試驗(yàn)將數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為lg T＝2.739 7－0.292 3 lgc，式中T為反應(yīng)時(shí)間（達(dá)限時(shí)間），單位為s；c為細(xì)菌內(nèi)毒素濃度（EU/m L）。其中，陰性對(duì)照時(shí)間＞3 600 s，其絕對(duì)值＞0.98，故標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

2.8 兩種方法檢測(cè)樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素

按L＝0.77 EU/m L用BET水稀釋至76倍，加入KCA法TAL 0.1m L，作為供試品溶液[6]；再把上述供試品溶液稀釋2倍，等比加入用BET水制備的1 EU/m L細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入KCA法TAL 0.1m L，作為供試品干擾溶液；并按“2.4”“2.5”項(xiàng)下方法做NC對(duì)照。根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”項(xiàng)下的KCA法和凝膠法進(jìn)行檢測(cè)[6]，結(jié)果見(jiàn)表5 [回收率（%）＝（供試品干擾溶液細(xì)菌內(nèi)毒素含量－供試品溶液的細(xì)菌內(nèi)毒素含量）/加入的細(xì)菌內(nèi)毒素含量× 100%；表中“-”為未檢出]。由表5可知，2種方法內(nèi)毒素檢測(cè)值均在規(guī)定限值以下[6]。

3 討論

表5 兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較Tab 5 Com parison of the resultsof 2 kindsofmethods

在日常檢驗(yàn)中，脂肪乳注射液對(duì)TAL有干擾作用[7-8]。這可能與脂肪乳所帶的電荷干擾TAL的凝集有關(guān)。SDS是陰離子表面活性劑和助溶劑，助溶劑能夠增加難溶性物質(zhì)的溶解度，增強(qiáng)穩(wěn)定性，SDS在低濃度下能夠發(fā)揮助溶作用且毒性較少[9]。由試驗(yàn)結(jié)果表明，SDS能消除樣品的干擾作用。這可能與中和作用和其對(duì)脂肪乳的穩(wěn)定作用有關(guān)。

本研究對(duì)脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液用0.002‰SDS溶液進(jìn)行稀釋，樣品稀釋至24倍后無(wú)干擾。本研究亦采用KCA法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，樣品在稀釋了76倍及以下對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾作用，均符合藥典要求[6]。

綜上所述，凝膠法可用于脂肪乳（10%）/氨基酸（15）/葡萄糖（20%）注射液的細(xì)菌內(nèi)檢查。

[1]胡長(zhǎng)纓，趙朋娟.脂肪乳氨基酸-葡萄糖注射液致靜脈炎1例的分析[J].抗感染藥學(xué)，2014，11（1）：75-76.

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（編輯：劉柳）

Determination of Bacterial Endotoxin in Fat Emulsion（10%）/Am ino Acid（15）/Glucose（20%）Injection by Gel Method

WANG W enjia，CHEN Zhim ing，ZHANG Nam in，ZHOU M engying，HE Huahong，LIW ei（Guangzhou Institute for Drug Control，Guangzhou 510160，China）

OBJECTIVE：To adopt gelmethod for the determ ination of bacterial endotoxin in Fat emulsion（10%）/am ino acid（15）/glucose（20%）injection.METHODS：According to the gelmethod in term of“bacterial endotoxin testmethod”in Chinese Pharmacopeia（2015 edition），themaximal valid dilution（MVD）of sampleswere determined through interference test and the validated.The resultswere compared w ith chromogenic method.RESULTS：In gelmethod，the interference to agglutination reaction of TAL and bacterial endotoxin can be excluded when samples were diluted 24 times or less.In chromogenic method，the samples should be diluted 76 times or less.CONCLUSIONS：Gelmethod can be used for bacterial endotoxin test of Fat emulsion（10%）/ am ino acid（15）/glucose（20%）injection.

Fat emulsion（10%）/amino acid（15）/glucose（20%）injection；Bacterial endotoxin test；Gelmethod；Interference test；Chromogenicmethod

R 927

A

1001-0408（2017）18-2576-03

2016-06-30

2016-12-12）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：藥理毒理學(xué)、安全性評(píng)價(jià)。電話：020-81744947。E-mail：464114381@qq.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：藥物分析、藥理毒理學(xué)、安全性評(píng)價(jià)。電話：020-26283334。E-mail：Liw@gzfda.gov.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.36