周巧玲，王遠航，林 泓，汪 彬，石剛剛，鄭付春

(汕頭大學醫(yī)學院 1.藥理學教研室、2.第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 汕頭 515041)

鈣拮抗劑調(diào)節(jié)鈣非依賴磷脂酶A2拮抗心臟微血管內(nèi)皮細胞缺氧/復氧損傷的研究

周巧玲1，王遠航1，林 泓1，汪 彬1，石剛剛1，鄭付春2

(汕頭大學醫(yī)學院 1.藥理學教研室、2.第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 汕頭 515041)

目的 探討經(jīng)典鈣拮抗劑維拉帕米(Ver)、硝苯地平(Nif)、地爾硫(Dil)及本課題組合成的新型鈣拮抗劑-碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)通過調(diào)節(jié)鈣非依賴磷脂酶A2(iPLA2)抗心臟微血管內(nèi)皮細胞(CMECs)缺氧/復氧(H/R)損傷的作用與機制。方法 培養(yǎng)大鼠原代CMECs,制作H/R模型，在H/R的基礎(chǔ)上，用不同濃度梯度的鈣拮抗劑及F2處理細胞，比色法測定細胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)的漏出反映細胞損傷程度；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定白介素-6(IL-6) 和花生四烯酸(AA)的含量；TUNEL法檢測細胞晚期凋亡水平；Real-time PCR檢測iPLA2mRNA表達，Western blot檢測iPLA2蛋白表達。結(jié)果 鈣拮抗劑F2、Ver和Nif均可量效-依賴性地減少H/R過程中LDH漏出(P<0.05)，降低IL-6和AA含量(P<0.05)，減少細胞凋亡(P<0.05)，而Dil對上述指標均無作用；同時，F(xiàn)2和Ver均可量效-依賴性地降低iPLA2mRNA和蛋白表達水平，Nif和Dil對H/R過程中iPLA2mRNA和蛋白表達水平并無影響。結(jié)論 H/R可導致CMECs損傷，鈣拮抗劑F2、Ver、Nif能保護CMECs抗H/R損傷，Dil無抗H/R損傷的作用；而F2和Ver是部分通過調(diào)節(jié)iPLA2抗H/R損傷作用的。

鈣拮抗劑；碘化N-正丁基氟哌啶醇；鈣非依賴磷脂酶A2；花生四烯酸；心臟微血管內(nèi)皮細胞；缺氧/復氧

心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷是臨床常見的病理現(xiàn)象，是指心肌在缺血的基礎(chǔ)上恢復血流后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆損傷的現(xiàn)象。I/R損傷主要表現(xiàn)在生物膜損傷、細胞器功能改變、炎癥發(fā)生和細胞凋亡發(fā)生等[1-2]。鈣非依賴磷脂酶A2(iPLA2)是磷脂酶A2(PLA2)家族的一大亞族，其發(fā)揮催化活性不需要鈣離子的參與，可以水解膜磷脂，生成花生四烯酸(AA)和溶血磷脂酰膽堿(LPC)[3]。AA和LPC作為細胞內(nèi)信號分子，涉及廣泛的生理病理效應，主要包括類花生四烯酸的產(chǎn)生、葡萄糖誘導胰島素分泌、Fas誘導的細胞凋亡、細胞增殖、細胞膜代謝融合等，這些都與心肌缺血有密切關(guān)系[4-5]。AA作為iPLA2的主要產(chǎn)物之一，也是生成眾多炎癥因子的一個關(guān)鍵因子，能激發(fā)下游瀑布式的炎癥反應。

鈣拮抗劑(calcium antagonists)，也叫鈣通道阻滯劑(calcium channel blockers，CCB)，主要通過阻斷心肌和血管平滑肌細胞膜上的L-型鈣離子通道，抑制細胞外鈣離子內(nèi)流，使細胞內(nèi)鈣離子水平降低而改善心血管等組織器官功能[6]。碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide, F2)是我們實驗室在氟哌啶醇(haloperidol, Hal)的基礎(chǔ)上改造合成的一種具有心血管活性的新型鈣拮抗劑，通過阻斷心肌細胞膜鈣通道而拮抗心I/R損傷[7]。本實驗室前期研究表明，F(xiàn)2無論是對整體的I/R損傷，還是對離體的心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)損傷均有保護作用，其作用機制可能與阻斷心肌細胞細胞膜上L-型鈣通道(L-VDCC)，拮抗心肌細胞鈣超載，抑制早期生長反應基因-1(early growth response gene-1, Egr-1)過表達有關(guān)[8-10]。實驗室前期研究表明，心肌細胞轉(zhuǎn)染iPLA2質(zhì)粒使iPLA2高表達后，H/R損傷加重；轉(zhuǎn)染iPLA2-siRNA沉默iPLA2基因，H/R損傷減輕，驗證了iPLA2參與心肌細胞H/R損傷[11]。而關(guān)于iPLA2能否作為鈣拮抗劑的作用靶點介導細胞抗H/R損傷，成為鈣拮抗劑抗心肌I/R損傷的另一個機制，未有文獻報道。故本研究擬采用I/R損傷中最先受累且參與調(diào)控I/R病理生理進程的心臟微血管內(nèi)皮細胞(CMECs)制備H/R模型[12]，選取3種經(jīng)典鈣拮抗劑硝苯地平(Nif)、地爾硫(Dil)、維拉帕米(Ver)及F2，探討其調(diào)節(jié)iPLA2抗H/R損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 新生(1～4 d)SD乳鼠(汕頭大學醫(yī)學院實驗動物中心)♀♂不限。胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；肝素鈉注射液(成都市海通藥業(yè)有限公司，中國)；內(nèi)皮細胞生長添加劑(ECGS)(Merk Millipore公司，德國)；青霉素-鏈霉素溶液(Biosharp公司，中國)；iPLA2兔多克隆抗體(Proteintech，美國)；β-actin小鼠單克隆抗體、HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；TRIzol、PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time、SYBRPrem ExTaqII(TaKaRa公司，日本)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒 (南京建成生物研究所，中國)；白介素-6(IL-6) ELISA試劑盒(Ebioscience公司，美國)；花生四烯酸(AA) ELISA試劑盒(Cusabio公司，中國)；DeadEndTMFlourumetric TUNEL System(Promega公司，美國)；鹽酸維拉帕米(Ver)注射液(上海禾豐制藥有限公司，中國)；硝苯地平(Nif)、地爾硫(Dil)(Sigma公司，美國)；F2由汕頭大學醫(yī)學院藥物研究室化學組合成，實驗前用DMSO配成所需濃度；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。SW-CJ-1F超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國)；CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司，日本)；倒置相差顯微鏡(Nilkon公司，日本)；PB-10 pH酸度計(Sarotorius公司，德國)；低溫高速離心機(Heraeus公司，德國)；SpectraMax M2多功能酶標儀(Molecular Devices公司，美國)；Olympus BX53正置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；ABI 7500實時熒光定量儀(ABI公司，美國)；Invivo 2400低氧/厭氧工作站(Ruskinn公司，英國)；Gel-pro圖像分析軟件(Media cybernetics, USA)。

1.2 原代CMECs培養(yǎng) 將出生1～4 d的SD乳鼠經(jīng)75%酒精消毒，仰臥，四肢固定(以下步驟均為無菌操作)。開胸，剝離心臟，取心臟下端1/3心室肌部分，置于預冷(4℃)PBS中充分清洗，用眼科剪將心肌組織剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，加入10倍體積的0.1%胰蛋白酶，37℃消化5 min，輕輕吹打，靜置1 min，吸取上清液，余下組織塊加入0.1%胰蛋白酶消化5 min，收集上清液。將2次收集的上清液合并，加入含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基滅活胰酶終止消化，1 000 r·min-1，4℃離心10 min，棄上清，收集細胞。加入含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基(含有100 kU·L-1青霉素、100 kU·L-1鏈霉素、6 250 U·L-1肝素鈉、15 mg·L-1ECGS)，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，6 h后，更換培養(yǎng)基去除未貼壁細胞。CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)基，以后每2 d換液1次，至CMECs融合成單層，當細胞長至85%～90%可進行消化傳代培養(yǎng)。采用3～8代CMECs進行實驗。

1.3 實驗分組及H/R模型建立 將CMECs隨機分為對照(Control，簡稱Ctrl)組、H/R組、H/R+溶劑(DMSO)組、H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Nif(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Dil(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組。Ctrl組于實驗前更換為0.5%FBS DMEM培養(yǎng)基(復氧液)，按正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)4.5 h。其余各組制備缺氧模型，均更換為高純度氮氣飽和30 min的缺氧液，放入低氧/厭氧工作站中培養(yǎng)4 h。缺氧完成后，更換復氧液，放入CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)0.5 h，造成CMECs H/R損傷。

1.4 CMECs上清液中LDH活性測定 將CMECs接種于24孔板中，待細胞融合率達到85%～90%，按上述分組。復氧結(jié)束后，收集細胞上清復氧液，按LDH試劑盒說明書操作，比色法測定LDH活性。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法測定IL-6和AA濃度 將CMECs接種于24孔板中，待融合率達到85%～90%時制備H/R模型。收集細胞上清復氧液，按ELISA試劑盒說明書操作，于450 nm波長處檢測各組吸光值，并擬合標準曲線，代入各組OD值，計算各組IL-6和AA濃度。

1.6 熒光顯微鏡觀測細胞凋亡水平 首先將75%乙醇消毒過的蓋玻片紫外滅菌30 min后放入24孔板中，接種CMECs，爬片成功后，根據(jù)實驗要求分組處理。預冷PBS洗滌3次，將蓋玻片浸沒在4%甲醛溶液(溶于1×PBS)中固定，室溫孵育15 min。去掉多余液體，每孔加入500 μL 0.3% TritonX-100，室溫孵育15 min。在1×TBS溶液中浸沒清洗樣本3次，輕輕去掉多余液體。滴加100 μL 1×TdT平衡緩沖液(蒸餾水稀釋)，使其全部覆蓋樣本，室溫孵育10 min。吸干樣本周圍的平衡緩沖液，立即滴加50 μL TdT標記反應混合物(平衡緩沖液 ∶核苷混合物 ∶rTDT=45 ∶5 ∶1)。用Paraflim?封口膜覆蓋樣本，置于濕盒中37℃避光孵育60 min。移走封口膜，并將蓋玻片置于1×TBS溶液中室溫孵育1 min。去掉多余液體，換用新鮮的1×TBS溶液室溫孵育1 min，重復1次。用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的TBS溶液。逐滴滴加Mounting Media封片劑并蓋上蓋玻片。熒光顯微鏡下觀察，使用DAPI的濾光片觀察樣本中的全體細胞，使用標準的綠色熒光濾光片觀察凋亡的細胞。

1.7 Real time-PCR檢測iPLA2mRNA表達 將CMECs接種于24孔板中，待細胞融合率達到85%～90%，按上述分組。采用TRIzol一步法提取細胞總RNA，Nano2000測其RNA濃度。用RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，通過Real time-PCR檢測iPLA2的表達。以β-actin為內(nèi)參，計算 2-ΔΔCT值。

1.8 Western blot檢測iPLA2蛋白表達 CMECs接種至直徑7 cm的培養(yǎng)皿中，待鋪滿皿底，給予相應處理后，每皿加70 μL裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r·min-1、4℃離心收集上清液。BCA法蛋白定量。將蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜；二抗37℃孵育1 h，ECL化學發(fā)光，暗室曝光。Gel-pro圖像分析軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 鈣拮抗劑對CMECs H/R后LDH漏出的影響 如Fig 1所示，與Ctrl組相比，H/R組與H/R+DMSO組LDH漏出量明顯增加(P<0.05)；與H/R+DMSO組相比，H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Nif(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組均能量效依賴性地減少LDH漏出量，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而H/R+Dil(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組與H/R+DMSO組相比，有劑量依賴減少LDH漏出量的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。

Fig 1 Effect of calcium antagonists on LDH induced by H/R(±s，n=5)

1:Ctrl;2:H/R;3:H/R+DMSO;4:H/R+F2(10.0 μmol·L-1);5:H/R+F2(1.0 μmol·L-1);6:H/R+F2(0.1 μmol·L-1);7:H/R+Ver(10.0 μmol·L-1);8:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1);9:H/R+Ver(0.1 μmol·L-1);10:H/R+Nif(10.0 μmol·L-1);11:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1);12:H/R+Nif(0.1 μmol·L-1);13:H/R+Dil(10.0 μmol·L-1);14:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1);15:H/R+Dil(0.1 μmol·L-1).*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsH/R+DMSO

2.2 鈣拮抗劑對CMECs H/R后IL-6濃度的影響 如Fig 2所示，與Ctrl組相比，H/R組與H/R+DMSO組IL-6濃度明顯增加(P<0.05)；與H/R+DMSO相比，H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組均能量效-依賴性地降低IL-6濃度，H/R+Nif(10.0、1.0 μmol·L-1)組能明顯降低IL-6濃度，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且呈量效-依賴性；而H/R+Nif(0.1 μmol·L-1)組和H/R+Dil(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組與H/R+DMSO組相比，IL-6濃度差異沒有顯著性。

2.3 鈣拮抗劑對CMECs H/R后細胞凋亡的影響 如Fig 3所示，與Ctrl組相比，H/R組與H/R+DMSO組細胞凋亡明顯增加(P<0.05)；與H/R+DMSO組相比，H/R+F2(1.0 μmol·L-1)組、H/R+Ver(1.0 μmol·L-1)組、H/R+Nif(1.0 μmol·L-1)組均能減少細胞凋亡，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而H/R+Dil(1.0 μmol·L-1)組與H/R+DMSO組相比，未發(fā)現(xiàn)細胞凋亡減少，兩組間差異無統(tǒng)計學意義。

Fig 2 Effect of calcium antagonists on IL-6 induced by H/R(±s，n=5)

1:Ctrl;2:H/R;3:H/R+DMSO;4:H/R+F2(10.0 μmol·L-1);5:H/R+F2(1.0 μmol·L-1);6:H/R+F2(0.1 μmol·L-1);7:H/R+Ver(10.0 μmol·L-1);8:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1);9:H/R+Ver(0.1 μmol·L-1);10:H/R+Nif(10.0 μmol·L-1);11:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1);12:H/R+Nif(0.1 μmol·L-1);13:H/R+Dil(10.0 μmol·L-1);14:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1);15:H/R+Dil(0.1 μmol·L-1).*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsH/R+DMSO

2.4 鈣拮抗劑對iPLA2的影響 如Fig 4、5所示，與Ctrl組相比，H/R組與H/R+DMSO組iPLA2表達明顯增高(P<0.05)；與H/R+DMSO組相比，H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組和H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組均能量效依賴性地降低iPLA2mRNA和蛋白表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而H/R+Nif(10、1.0、0.1 μmol·L-1)和H/R+Dil(10、1.0、0.1 μmol·L-1)組與H/R+DMSO組相比，未發(fā)現(xiàn)iPLA2mRNA和蛋白表達的降低，兩組間無統(tǒng)計學差異。

2.5 鈣拮抗劑對CMECs H/R后AA濃度的影響 如Fig 6所示，與Ctrl組相比，H/R組與H/R+DMSO組AA濃度明顯增加(P<0.05)；與H/R+DMSO組相比，H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組、H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組均能量效依賴性地降低AA濃度，H/R+Nif(10.0 、1.0 μmol·L-1)組能明顯降低AA濃度，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而H/R+Nif(0.1 μmol·L-1)組和H/R+Dil(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)組與H/R+DMSO組相比，AA濃度沒有統(tǒng)計學差異。

Fig 3 Effect of calcium antagonists on apoptosis induced by H/R(±s，n=3)

1:Ctrl;2:H/R;3:H/R+DMSO;4:H/R+F2(1.0 μmol·L-1);5:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1);6:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1);7:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1).*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsH/R+DMSO

3 討論

心肌I/R損傷是一個復雜的多因素參與的病理過程，損傷的發(fā)生機制包括氧自由基產(chǎn)生、鈣超載、白細胞趨化作用、能量代謝障礙和炎癥反應等[1-2,13]。缺血前或早期給予鈣拮抗劑可以通過對細胞膜L-VDCC的阻斷作用，減少胞內(nèi)的鈣離子，減輕細胞內(nèi)鈣超載，減少心肌的不可逆損傷。然而，近年來有學者認為，鈣拮抗劑也可能通過作用其它環(huán)節(jié)而發(fā)揮效應，且多年來對于鈣拮抗劑減輕I/R損傷的機制報道也并非一致[14-16]。有人認為是通過其負性肌力和負性頻率作用，節(jié)省能量，改善I/R損傷；也有報道鈣拮抗劑具有抗氧自由基和調(diào)節(jié)NO合酶的作用[17-18]。

Fig 4 Effect of calcium antagonists on expression of iPLA2 mRNA(±s，n=9)

1:Ctrl;2:H/R;3:H/R+DMSO;4:H/R+F2(10.0 μmol·L-1);5:H/R+F2(1.0 μmol·L-1);6:H/R+F2(0.1 μmol·L-1);7:H/R+Ver(10.0 μmol·L-1);8:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1);9:H/R+Ver(0.1 μmol·L-1);10:H/R+Nif(10.0 μmol·L-1);11:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1);12:H/R+Nif(0.1 μmol·L-1);13:H/R+Dil(10.0 μmol·L-1);14:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1);15:H/R+Dil(0.1 μmol·L-1).*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsH/R+DMSO

研究表明，炎性反應血管高通透性被認為是心肌I/R損傷的中心環(huán)節(jié)，此過程中內(nèi)皮細胞功能紊亂是I/R損傷發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細胞缺氧損傷后促進炎癥因子的釋放，進而引起白細胞聚集、黏附、血管收縮、血栓形成及內(nèi)皮細胞腫脹造成無復流現(xiàn)象，加重H/R損傷[12]，再灌注前給予保護內(nèi)皮功能的藥物可對抗內(nèi)皮細胞功能紊亂，減少心肌損傷。iPLA2作為磷脂酶超家族的一員，文獻報道其在心肌中有相對高的活性。心肌膜由磷脂雙分子層構(gòu)成，能調(diào)節(jié)細胞生長、信號轉(zhuǎn)導和運輸功能。心肌缺血時，心肌膜破損，導致細胞功能紊亂，進一步加重心肌損傷，iPLA2在細胞膜磷脂的維持和修復程度中發(fā)揮關(guān)鍵作用。iPLA2對于心肌I/R的病理發(fā)展也具有重要的作用，其水解膜磷脂生成AA和LPC產(chǎn)物，兩個產(chǎn)物具有多樣性的生物效應，介導不同信號通路產(chǎn)生有害反應，參與了一系列炎癥、凋亡等反應，從離子通道的調(diào)節(jié)到對多種信號通路的作用，尤其是在心肌I/R損傷中發(fā)揮重要作用。實驗室前期研究表明iPLA2參與心肌細胞H/R損傷[11]，心肌I/R或細胞H/R情況下，iPLA2高表達，活性增加，所生成的AA和LPC引起細胞損傷，鈣拮抗劑對iPLA2這樣一個重要的“上游”酶類的調(diào)節(jié)發(fā)揮多方面的效應。鈣拮抗劑通過抑制iPLA2高表達，主要是通過對產(chǎn)物AA的產(chǎn)生發(fā)揮作用，通過降低心肌I/R情況下AA的產(chǎn)生，從而抑制AA所激發(fā)的下游瀑布式炎癥效應，保護心肌損傷?；诖?，許多學者認為iPLA2很可能成為諸多疾病的藥物作用靶點。本實驗在前期工作的基礎(chǔ)上，探討在細胞H/R情況下，鈣拮抗劑是否通過調(diào)控iPLA2異常表達產(chǎn)生抗損傷作用。

Fig 5 Effect of calcium antagonists on expression of iPLA2 protein(±s，n=3)

Fig 6 Effect of calcium antagonistson AA induced by H/R(±s，n=5)

1:Ctrl;2:H/R;3:H/R+DMSO;4:H/R+F2(10.0 μmol·L-1);5:H/R+F2(1.0 μmol·L-1);6:H/R+F2(0.1 μmol·L-1);7:H/R+Ver(10.0 μmol·L-1);8:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1);9:H/R+Ver(0.1 μmol·L-1);10:H/R+Nif(10.0 μmol·L-1);11:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1);12:H/R+Nif(0.1 μmol·L-1);13:H/R+Dil(10.0 μmol·L-1);14:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1);15:H/R+Dil(0.1 μmol·L-1).*P<0.05vsCtrl;#P<0.05vsH/R+DMSO

本實驗結(jié)果提示，0.1～10.0 μmol·L-1的鈣拮抗劑F2、Ver及Nif具有抗H/R損傷、保護CMECs的作用，且F2和Ver是通過抑制iPLA2高表達抗H/R損傷的，Nif對iPLA2高表達無作用。Hempel等[19]發(fā)現(xiàn)，在無L-VDCC的內(nèi)皮細胞上，Nif可通過直接抑制PKC轉(zhuǎn)位，減少缺血引起的內(nèi)皮細胞通透性增加，降低內(nèi)皮細胞的通透性，從而保護內(nèi)皮細胞缺血損傷。這些研究都表明[11,19]，鈣拮抗劑除了能阻斷鈣通道外，還可能存在非鈣通道阻斷途徑 (如非L-VDCC依賴機制)。至于Dil與其他3種鈣拮抗劑的不同作用，仍需進一步探討。結(jié)果表明，F(xiàn)2和Ver量效依賴地降低了iPLA2的表達，提示iPLA2可能是鈣拮抗劑F2和Ver抗H/R損傷新的作用靶點，為其臨床應用提供了科學依據(jù)。

(致謝：本文實驗是在汕頭大學醫(yī)學院藥理學教研室完成，感謝在實驗過程中給予建議與幫助的老師和同學。)

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Calcium antagonists protect cardiac microvascular endothelial cells against hypoxia/reoxygenation injury through iPLA2

ZHOU Qiao-ling1，WANG Yuan-hang1，LIN Hong1，WANG Bin1，SHI Gang-gang1，ZHENG Fu-chun2
(1.DeptofPharmacology，ShantouUniversityMedicalCollege，2.DeptofPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege，Shantou，Guangdong515041，China)

Aim To investigate the effects of classic calcium antagonists verapamil(Ver), nifedipine(Nif), diltiazem(Dil) and the novel calcium antagonistN-n-butyl haloperidol iodide(F2) which was synthesized by our lab by regulating Ca2+-independent phospholipase A2(iPLA2) on hypoxia / reoxygenation(H/R) injury of cardiac microvascular endothelial cells(CMECs) and the mechanisms.Methods The CMECs were isolated from SD neonatal rats. The H/R model was established, then cells were treated with different concentrations of calcium antagonists and F2.The content of LDH in the cell supernatant was measured by colorimetric method. The levels of IL-6 and AA in cell supernatant were measured by ELISA; and late-stage apoptosis was measured by TUNEL. The mRNA and protein expression levels of iPLA2in CMECs were examined by real time-PCR and Western blot analysis.Results Calcium antagonists except Dil decreased the generation of LDH，IL-6 and AA in a dose-dependent manner(P<0.05), and reduced the apoptosis(P<0.05). F2and Ver decreased the mRNA and protein expression of iPLA2in a dose-dependent manner, while there were no such effects for Nif and Dil.Conclusions Calcium antagonists except Dil have protective effects against H/R injury. F2and Ver protect CMECs against H/R injury partly through iPLA2.

calcium antagonist；N-n-butyl haloperidol iodide；Ca2+-independent phospholipase A2；arachidonic acid; cardiac microvascular endothelial cells；hypoxia/reoxygenation

2017-03-22,

2017-04-23

國家自然科學基金-廣東聯(lián)合基金資助項目(No U0932005) ；國家自然科學基金資助項目(No 81473215)；廣東省科技廳公益研究與能力建設(shè)專項資金項目(No 2014A020212290)

周巧玲(1991-)，女，碩士，研究方向：心血管藥物研發(fā)，E-mail：qlchou@163.com； 鄭付春(1967-)，女，碩士，主任藥師，碩士生導師，研究方向：心血管藥物研發(fā)、藥物臨床研究，通訊作者，E-mail：zhengfc@stu.edu.cn

時間：2017-7-7 11:04 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.032.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.016

A

1001-1978(2017)08-1119-07

R-332；R322.11；R322.12；R542.22；R845.22；R972；R977.3