陳新顏，楊培周*，姜紹通，鄭 志，操麗麗，操新民，朱星星，張丹峰，劉廣慶（合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

天然紅色素靈菌紅素的急性經(jīng)口毒性和遺傳毒性

陳新顏，楊培周*，姜紹通，鄭 志，操麗麗，操新民，朱星星，張丹峰，劉廣慶
（合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

靈菌紅素屬于天然色素，具有離體抑制腫瘤和癌癥細(xì)胞增殖、抑制微生物生長(zhǎng)以及抗瘧疾和免疫抑制等功效，具有潛在的巨大應(yīng)用價(jià)值。缺少急性經(jīng)口毒性和遺傳毒性實(shí)驗(yàn)的研究限制了靈菌紅素在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。本研究依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了靈菌紅素的小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)、哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，靈菌紅素急性經(jīng)口半數(shù)致死劑量LD50＞10 g/kg（以體質(zhì)量計(jì)），3 項(xiàng)遺傳毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，靈菌紅素對(duì)小鼠的急性經(jīng)口毒性屬無(wú)毒級(jí)，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒，對(duì)動(dòng)物生殖系統(tǒng)沒(méi)有毒害。

靈菌紅素；急性經(jīng)口毒性；遺傳毒性；食品安全

靈菌紅素（prodigiosin）屬于天然色素，是由粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）等微生物合成的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，其表達(dá)和積累主要受微生物發(fā)酵溫度的調(diào)控。靈菌紅素已經(jīng)被證明具有抗腫瘤[2-3]、抗瘧疾[4]和免疫抑制[5]等功效，對(duì)癌細(xì)胞有較強(qiáng)的針對(duì)性[6]，而在其有效濃度范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成傷害，對(duì)肺[7]、肝臟[8]、腎[9]、結(jié)腸[10]和乳房[11-12]等組織器官的癌細(xì)胞均有一定的生長(zhǎng)性抑制作用[13]。目前的抗癌抗腫瘤藥物大都是在發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞后使用的，在通過(guò)化學(xué)和物理等強(qiáng)力手段殺死癌細(xì)胞的過(guò)程中，正常細(xì)胞和組織受到極大傷害，破壞人體正常功能，增加病人的痛苦。開(kāi)發(fā)一種能夠有效抑制癌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖的食品，將對(duì)保護(hù)人們身體健康、降低后期抗癌藥物對(duì)身體傷害、預(yù)防癌細(xì)胞的增殖等具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本課題組已從魚(yú)腸道中分離出一種高產(chǎn)靈菌紅素的微生物[14]，通過(guò)結(jié)構(gòu)鑒定、靈菌紅素表達(dá)定量方法、發(fā)酵條件優(yōu)化[15]、以及抑制癌細(xì)胞增殖等研究，初步建立靈菌紅素高產(chǎn)菌株選育，發(fā)酵條件控制以及分離純化生產(chǎn)體系，為開(kāi)發(fā)基于靈菌紅素的食藥用產(chǎn)品提供良好基礎(chǔ)。靈菌紅素雖然在自然界廣泛存在，但是其在動(dòng)物體內(nèi)的代謝機(jī)理研究缺乏，已有的報(bào)道側(cè)重于高產(chǎn)菌株選育[16]、發(fā)酵條件[17-18]以及抗癌機(jī)制[2,13]等方面，而對(duì)靈菌紅素在動(dòng)物體內(nèi)的食品安全性方面還鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究擬從食品安全角度進(jìn)行急性經(jīng)口毒性和遺傳毒性實(shí)驗(yàn)，為開(kāi)發(fā)對(duì)正常細(xì)胞無(wú)害的靈菌紅素食品原料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

本研究采用的靈菌紅素是由本課題組篩選獲得的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）HFUT 1301發(fā)酵大豆油表達(dá)的次生代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)離心沉淀收集菌絲體，超聲波輔助乙醇萃取浸提以及硅膠色譜分離純化，純度為95%[19]，對(duì)靈菌紅素進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光全波長(zhǎng)掃描、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用以及核磁共振圖譜分析[19]，確定該色素為靈菌紅素色素，分子式為C20H25N3O，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 靈菌紅素的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of prodigiosin used in this study

SPF級(jí)健康昆明小鼠由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2011-0003。

環(huán)磷酰胺、疊氮鈉、2-氨基芴、狄克松、1,8-二羥蒽醌、二甲基亞砜 Sigma-Aldrichi（中國(guó)）公司；大鼠肝勻漿S-9混合物（S9） 上海寶錄生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

80i光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司；普通生物顯微鏡日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 前期準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)前對(duì)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室、飼養(yǎng)籠、飲水瓶以及實(shí)驗(yàn)設(shè)備和器具等進(jìn)行清洗消毒，紫外殺菌；為提高小鼠的環(huán)境適應(yīng)能力，將小鼠在喂養(yǎng)室喂養(yǎng)3 d，觀察其生命活力及飲食飲水狀況，確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康小鼠，小鼠灌胃體積為0.2 mL。

1.3.2 急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)

小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)（限量法）選用體質(zhì)量為18～22 g的健康小鼠20 只，其中雌雄各10 只，分兩組；實(shí)驗(yàn)前禁食6 h，自由飲水。小鼠一次灌胃體積0.2 mL，將分離得到的純度為95%的靈菌紅素與淀粉混合獲得混懸液，含靈菌紅素含量約為200 mg（根據(jù)小鼠體質(zhì)量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整），確保喂飼靈菌紅素的劑量達(dá)到10.0 g/kg（以體質(zhì)量計(jì)）。一次性給予受試物后繼續(xù)禁食1.5 h，然后正常飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14 d；每天觀察實(shí)驗(yàn)小鼠的進(jìn)食情況、活動(dòng)能力、糞便有無(wú)異常及精神狀況，觀察是否存在中毒癥狀以及死亡情況，每隔7 d稱(chēng)體質(zhì)量并記錄，分析體質(zhì)量的變化。14 d后剖檢存活小鼠，分割心、肝、脾、肺和腎等器官，并進(jìn)行稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算臟體比；制備肝臟切片，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行病理組織學(xué)分析。

1.3.3 遺傳毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)

平板摻入法采用經(jīng)鑒定符合要求的4 株組氨酸缺陷型鼠傷沙門(mén)氏菌（TA97、TA98、TA100和TA102）。靈菌紅素的質(zhì)量濃度設(shè)置為50、158、500、1 580 μg/皿和5 000 μg/皿，并設(shè)置空白對(duì)照、溶劑對(duì)照（二甲基亞砜）和陽(yáng)性對(duì)照（疊氮鈉、狄克松、2-氨基砜、1,8-二羥蒽醌）。每組加大鼠肝勻漿S-9混合物和不加S9的均設(shè)置3 個(gè)平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基平板上菌落數(shù)。以實(shí)驗(yàn)菌株的回復(fù)突變數(shù)等于或大于空白對(duì)照組的2 倍，且具有明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系定為陽(yáng)性，小于2 倍確定為陰性。

1.3.3.2 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)

選擇7～12 周齡，體質(zhì)量25～35 g的健康小鼠50 只，雌雄各半，隨機(jī)分為5 組，每組10 只。陽(yáng)性對(duì)照組劑量為40 mg/kg（以體質(zhì)量計(jì)，下同）的環(huán)磷酰胺，陰性對(duì)照組為等量的淀粉溶液，由經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果將靈菌紅素的劑量設(shè)為2.5、5.0、10.0 g/kg，經(jīng)口灌胃，第1次灌胃后間隔24 h后第2次給予受試物，而后6 h頸椎脫臼處死小鼠，取股骨，剪去兩端，小牛血清多次沖洗，制成細(xì)胞懸液，涂片，自然干燥后放入甲醇中固定5～10 min，Giemsa染色10～15 min，然后立即用蒸餾水沖洗，干燥，標(biāo)簽記錄，保存。從小鼠眼眶采血，制成血涂片。普通生物顯微鏡油鏡下對(duì)每個(gè)動(dòng)物的骨髓涂片，觀察2 000 個(gè)噬多染紅細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)有微核的噬多染紅細(xì)胞數(shù)，計(jì)算噬多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比例（PCE/NCE）。

1.3.3.3 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)

選取6～8 周齡體質(zhì)量為25～30 g的成年雄性小鼠25 只，隨機(jī)分為5 組，每組各5 只。陽(yáng)性對(duì)照組為劑量為40 mg/kg（以體質(zhì)量計(jì)，下同）的環(huán)磷酰胺，陰性對(duì)照組為等量淀粉。由經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)將靈菌紅素劑量設(shè)為2.5、5.0、10 g/kg。經(jīng)口灌胃5 d，每天1 次，于受試物首次給予35 d后取頸椎脫臼處死小鼠，解剖，取出兩側(cè)附睪盛放于含有2mL生理鹽水的平皿中，將附睪縱向剪1～3 刀，靜置3～5 min后，輕微搖動(dòng)，過(guò)濾，吸取濾液涂片；干燥后置于甲醇中固定5～10 min，伊紅浸泡染色時(shí)間1 h，滅菌蒸餾水輕沖洗，去除表面雜物，光學(xué)顯微鏡下觀察精子形態(tài)，每只小鼠樣品涂片鑒定1 000個(gè)小鼠精子，分析精子形態(tài)類(lèi)型，統(tǒng)計(jì)畸形數(shù)，計(jì)算畸形率。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)觀察期間，喂飼靈菌紅素的小鼠正常進(jìn)食，飲水，身體活動(dòng)正常且生長(zhǎng)發(fā)育良好，未觀察到明顯的中毒特征，無(wú)小鼠死亡，觀察期間小鼠的體質(zhì)量記錄結(jié)果見(jiàn)表1，小鼠的體質(zhì)量正常增長(zhǎng)，雄性小鼠的體質(zhì)量稍高于雌性小鼠，小鼠的生長(zhǎng)狀況良好。

表1 靈菌紅素對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（n=10）Table 1 Mouse acute oral toxicity of prodigiosin in terms of body weight,n=10)

表1 靈菌紅素對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（n=10）Table 1 Mouse acute oral toxicity of prodigiosin in terms of body weight,n=10)

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圖2 小鼠肝臟觀察Fig. 2 Liver of mice

將小鼠肝臟解剖后進(jìn)行檢查（圖2），與對(duì)照相比，喂飼靈菌紅素的實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟顏色正常、紅潤(rùn)（圖中未顯示），無(wú)中毒特征體現(xiàn)，無(wú)創(chuàng)傷和其他異常炎癥。對(duì)圖2相應(yīng)的肝臟進(jìn)行病理切片，如圖3所示，實(shí)驗(yàn)小鼠的肝臟與對(duì)照小鼠的肝臟相比較，細(xì)胞紋路清晰，組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)異常情形，未發(fā)現(xiàn)明顯的病理特征。

圖3 小鼠的肝臟病理切片F(xiàn)ig. 3 Liver pathological sections of mice

表2 小鼠急性毒性臟體比結(jié)果（n=10）Table 2 Ratio of viscera to body weight in mouse in acute oral toxicity test (,n=10)

表2 小鼠急性毒性臟體比結(jié)果（n=10）Table 2 Ratio of viscera to body weight in mouse in acute oral toxicity test (,n=10)

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分析靈菌紅素喂飼小鼠的急性毒性臟體比見(jiàn)表2，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)小鼠的臟體比處于正常范圍，未見(jiàn)明顯的靶器官；小鼠的經(jīng)口急性毒性半數(shù)致死量（lethal dose 50%，LD50）大于10 g/kg；根據(jù)急性毒性劑量（LD50）分級(jí)表，屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)別。

2.2 遺傳毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 靈菌紅素Ames試驗(yàn)（x±s）Table 3 Ames test of prodigiosin (x±s)

由表3可見(jiàn)，靈菌紅素各劑量組在加或不加S9的細(xì)菌回復(fù)突變數(shù)與空白對(duì)照和溶劑對(duì)照組相似，均未達(dá)到其2 倍，且靈菌紅素各劑量組間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果未見(jiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。陽(yáng)性對(duì)照組在加或不加S9的細(xì)菌回復(fù)突變數(shù)與空白組和溶劑對(duì)照組相比均大于其2倍，有劑量-效應(yīng)關(guān)系。表明受試物實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，在實(shí)驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)，靈菌紅素對(duì)4 株組氨酸缺陷型鼠傷沙門(mén)氏菌無(wú)致突變作用。

2.2.2 小鼠紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖4可見(jiàn)，小鼠紅細(xì)胞包括帶有微核的噬多染紅細(xì)胞（圖4A）、未帶有微核的噬多染紅細(xì)胞（圖4B）、陽(yáng)性對(duì)照紅細(xì)胞（圖4C）。微核實(shí)驗(yàn)在普通生物顯微鏡的油鏡下進(jìn)行鏡檢及計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表4，靈菌紅素3 個(gè)劑量組的雌、雄性小鼠微核數(shù)、微核率與陰性對(duì)照組相比差異性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），3 個(gè)劑量組之間也沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，靈菌紅素對(duì)小鼠紅細(xì)胞微核誘導(dǎo)量和劑量間沒(méi)有明顯關(guān)系，可以研究劑量和功能之間的關(guān)系。而陽(yáng)性對(duì)照組環(huán)磷酰胺的小鼠微核率與陰性對(duì)照組相比差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。綜上，表明在實(shí)驗(yàn)條件下，靈菌紅素不能夠引起小鼠噬多染紅細(xì)胞含微核率增加且與劑量無(wú)關(guān)。

圖4 紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)Fig. 4 Erythrocyte micronucleus test

表4 靈菌紅素的小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）Table 4 Mouse bone marrow micronucleus test of prodigiosin)

表4 靈菌紅素的小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）Table 4 Mouse bone marrow micronucleus test of prodigiosin)

注：**.與陰性對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）。表5同。

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2.2.3 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 靈菌紅素小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Sperm shape abnormality test of prodigiosin in mice

通過(guò)油鏡鏡檢考察小鼠精子的畸形情況，包括正常精子、不定形精子、雙尾精子、胖頭等形狀。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明靈菌紅素3 個(gè)劑量組精子畸形率與陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且3 個(gè)劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組精子畸形率與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）

3 結(jié)論與討論

（表5）。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下，靈菌紅素不會(huì)引起小鼠精子畸形數(shù)增加，進(jìn)而引起畸形率的增加且和劑量無(wú)關(guān)。

靈菌紅素不僅對(duì)人肺癌細(xì)胞[20-21]，人肝癌細(xì)胞[22-23]和人乳腺癌細(xì)胞[24]等具有抑制作用，此外靈菌紅素衍生物對(duì)治療淋巴瘤[25]等也有治療功能，但商品化靈菌紅素及其衍生物產(chǎn)品還未有產(chǎn)品上市，因此，開(kāi)發(fā)靈菌紅素產(chǎn)品具有潛在的重大意義。粘質(zhì)沙雷氏菌是自然界廣泛存在的一種條件致病菌[26]，作為次生代謝產(chǎn)物的靈菌紅素隨粘質(zhì)沙雷氏菌在人的身體內(nèi)存在，但其對(duì)人身體的影響也鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。急性經(jīng)口毒性和遺傳毒性實(shí)驗(yàn)不僅是基于靈菌紅素的食品產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的重要依據(jù)，還有助于探究粘質(zhì)沙雷氏菌的致病機(jī)制。本研究進(jìn)行了細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)、哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)以及急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明靈菌紅素是安全的，研究結(jié)果將為基于靈菌紅素的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

粘質(zhì)沙雷氏菌在表達(dá)靈菌紅素過(guò)程中，發(fā)酵環(huán)境條件變化容易改變代謝路徑[27]，生成多種靈菌紅素衍生物[28-29]，因此，控制發(fā)酵條件是獲得確定發(fā)酵產(chǎn)物的必要條件[30]。本實(shí)驗(yàn)以大豆油為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵，過(guò)量的大豆油將粘質(zhì)沙雷氏菌包裹在油脂內(nèi)部，保證粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵環(huán)境穩(wěn)定，盡量保證靈菌紅素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基于大豆油為底物發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素的開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

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Experimental Study of Acute Oral Toxicity and Genetic Toxicity of Natural Red Pigment Prodigiosin

CHEN Xinyan, YANG Peizhou*, JIANG Shaotong, ZHENG Zhi, CAO Lili, CAO Xinmin, ZHU Xingxing, ZHANG Danfeng, LIU Guangqing
(Anhui Key Laboratory of Intensive Processing of Agricultural Products, College of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Prodigiosin is a natural pigment that has the capability of inhibiting tumor cell proliferation in vitro, microbial growth, and exhibits anti-malaria and immunosuppression properties, thereby having a huge application potential. The application of prodigiosin in the food industry is limited due to the lack of knowledge about its acute oral toxicity and genetic toxicity. In the present study, according to the food safety national standards, the acute oral toxicity test of prodigiosin was performed in mice, and the genetic toxicity was assessed by mammalian erythrocyte micronucleus test, sperm malformation test and bacterial reverse mutation test. The results showed that acute oral medial lethal dose (LD50) of prodigiosin was greater than 10 g/kg BW. All three genetic toxicity tests gave negative results. In acute oral toxicity test, prodigiosin was found to be non-toxic to mice. Prodigiosin had no toxicity to normal cells and the reproductive system of animals.

prodigiosin; acute oral toxicity; genetic toxicity; food safety

10.7506/spkx1002-6630-201713037

TS201.6

A

1002-6630（2017）13-0224-05

陳新顏, 楊培周, 姜紹通, 等. 天然紅色素靈菌紅素的急性經(jīng)口毒性和遺傳毒性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(13): 224-228. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713037. http://www.spkx.net.cn

CHEN Xinyan, YANG Peizhou, JIANG Shaotong, et al. Experimental study of acute oral toxicity and genetic toxicity of natural red pigment prodigiosin[J]. Food Science, 2017, 38(13): 224-228. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201713037. http://www.spkx.net.cn

2016-05-05

合肥工業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201510359056）；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1408085MC67）；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（1604a0702001）

陳新顏（1994—），男，本科，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：1172149534@qq.com

*通信作者：楊培周（1976—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锖桶l(fā)酵工程。E-mail：yangpeizhou@163.com