劉國艷，孫貝貝，張 潔，于蘇寧，蔣棟磊，方維明，徐 鑫*（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

Ang Ⅱ誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立高血壓損傷模型

劉國艷，孫貝貝，張 潔，于蘇寧，蔣棟磊，方維明，徐 鑫*
（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

目的：采用高血壓發(fā)病因子血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）建立高血壓損傷模型。方法：使用不同濃度（0.01、0.10、1.00 μmol/L和10.00 μmol/L）Ang Ⅱ誘導(dǎo)HUVECs不同時(shí)間（3、6、9、12 h和24 h），通過考察HUVECs形態(tài)、活性、功能、微觀結(jié)構(gòu)及凋亡程度來評價(jià)HUVECs損傷程度，同時(shí)采用交叉設(shè)計(jì)方差分析和多重比較方法得到Ang Ⅱ最適誘導(dǎo)濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間。結(jié)果：Ang Ⅱ呈濃度依賴式誘導(dǎo)HUVECs損傷，最佳誘導(dǎo)條件為1.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導(dǎo)12 h，此時(shí)HUVECs活性為44.85%、NO含量為43.57 μmol/L、總一氧化氮合酶活力為6.99 U/mg pro、內(nèi)皮型一氧化氮合酶活力為1.89 U/mg pro、丙二醛含量為7.46 nmol/mL、超氧化物歧化酶活力為27.29 U/mg pro、細(xì)胞凋亡率為41.5%，微觀結(jié)構(gòu)顯示核膜皺縮，核仁消失，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量空泡狀結(jié)構(gòu)，線粒體或細(xì)小或腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張數(shù)目較少，部分核糖體丟失，平面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，但細(xì)胞未解體，仍然保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)。結(jié)論：1.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導(dǎo)12 h可以成功誘導(dǎo)HUVECs建立高血壓損傷模型。

血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）；高血壓；細(xì)胞模型

血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是引起高血壓等心血管疾病的重要原因，其受損程度與高血壓的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[1]。細(xì)胞受損后會(huì)導(dǎo)致其分泌功能發(fā)生變化，如血管通透性增加、血管收縮因子增加舒張因子降低，導(dǎo)致血管壓力增加，形成高血壓。高血壓又進(jìn)一步引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，形成惡性循環(huán)[2]。目前治療高血壓的化學(xué)合成類藥物雖效果明顯，但存在諸多副作用，因此天然、安全、無副作用的食品功能因子用于干預(yù)血壓調(diào)節(jié)是未來發(fā)展趨勢。Jorge[3]、Jung[4]、Zhang Xiwen[5]和Mladěnka等[6]研究表明食品功能因子具有舒張血管、降低血壓的作用。現(xiàn)今食品功能因子干預(yù)血壓調(diào)節(jié)的研究手段主要有動(dòng)物模型[7-9]和細(xì)胞模型[10-11]，細(xì)胞模型因具有操作簡便、周期短、體系相對單純等優(yōu)點(diǎn)而成為研究各種疾病的首選。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）與血管內(nèi)皮細(xì)胞有相似的生物學(xué)特征，接近人體生理狀態(tài)，無種屬差異、取材容易、來源豐富且符合倫理性[12]，被國內(nèi)外研究者廣泛用于建立模擬高血壓損傷的細(xì)胞模型[13-15]。但有關(guān)HUVECs高血壓損傷模型尚鮮見系統(tǒng)性研究報(bào)道，在模型誘導(dǎo)劑的濃度、時(shí)間及模型評價(jià)指標(biāo)的選取上缺乏量化標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)依據(jù)。本研究根據(jù)存在的問題完善現(xiàn)有的模型，針對腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）引起的高血壓，選用血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，Ang Ⅱ）作為誘導(dǎo)劑，篩選誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間，從細(xì)胞數(shù)量、微觀結(jié)構(gòu)、凋亡程度及與高血壓相關(guān)的功能因子等方面多角度、多指標(biāo)的綜合評價(jià)HUVECs高血壓損傷模型，以期為食品功能因子干預(yù)血壓調(diào)節(jié)的評價(jià)及篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HUVECs 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清 美國Gibco公司；RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基 美國Sigma公司；胰蛋白酶 美國Amresco公司；Ang Ⅱ美國Anaspec Inc公司；NO、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）試劑盒南京建成生物工程研究所；總蛋白提取試劑盒、增強(qiáng)型BCA蛋白定量試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；cell counting kit（CCK）-8試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3111CO2培養(yǎng)箱、Multiskan FC酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司；BM-37XBC倒置顯微鏡 上海波愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CL-22M高速低溫離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；CM100透射電子顯微鏡 荷蘭Philips公司；FACSAria llu流式細(xì)胞儀 美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。細(xì)胞傳代采用胰蛋白酶消化法。細(xì)胞融合達(dá)到80%左右，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3 次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，置于CO2培養(yǎng)箱中2 min后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞收縮程度，當(dāng)細(xì)胞變圓，細(xì)胞間間隙變大時(shí)加入完全培養(yǎng)基終止消化。用移液管輕輕吹打細(xì)胞瓶壁使細(xì)胞脫落，形成細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞用于傳代。取前10 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞活力測定

將HUVECs懸液濃度調(diào)整至5×104個(gè)/mL，接種于96 孔板中，每孔200 μL。培養(yǎng)24 h后換無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h，使細(xì)胞同步化。將細(xì)胞分為空白組，只加完全培養(yǎng)基；損傷組，分別加入含0.01、0.10、1.00 μmol/L和10.00 μmol/L Ang Ⅱ的培養(yǎng)液組，培養(yǎng)時(shí)間為3、6、9、12 h和24 h。達(dá)到預(yù)定培養(yǎng)時(shí)間后，每孔加入10 μL CCK-8溶液， 37 ℃孵育1～4 h后，酶標(biāo)儀450 nm波長處測量吸光度，每個(gè)條件下重復(fù)3 個(gè)平行，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間后在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD活力、NOS活力測定

按細(xì)胞懸液濃度l×105個(gè)/mL接種于6 孔培養(yǎng)板，2 mL，按照1.3.2節(jié)的方法，將誘導(dǎo)后的細(xì)胞消化收集于離心管中，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌2 次。反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)容物。將細(xì)胞置于離心管中，加1 mL無菌水，放入液氮中3～5 s，立即轉(zhuǎn)移到冰上，放置30 s左右，室溫解凍，重復(fù)3 次。2 000～3 000 r/min離心10 min，收集上清液，即時(shí)根據(jù)試劑盒說明書分別測定532、450、530 nm波長處的吸光度，即分別代表細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD活力、NOS活力。1.3.5 培養(yǎng)液中NO含量測定

模型誘導(dǎo)完畢后，無菌離心管收集培養(yǎng)液。2 000～3 000 r/min離心10 min，分裝，即時(shí)根據(jù)測定試劑盒說明書操作，測定550 nm波長處吸光度。

1.3.6 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

將消化后的細(xì)胞用2.5%的戊二醛先固定2 h以上，樣品以1×107個(gè)細(xì)胞數(shù)為宜。PBS清洗3～4 次（15 min/次）；1%鋨酸再固定2 h后，用PBS清洗3～4 次（15 min/次）；用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度脫水，每梯度15 min；100%丙酮浸透15 min后，用加入無水硫酸鈉呈飽和狀態(tài)的100%丙酮浸透15 min；再分別用丙酮-樹脂混合液（體積比為2∶1）浸透5 h，丙酮-樹脂混合液（體積比為1∶1）浸透過夜，丙酮-樹脂混合液（體積比為2∶1）浸透5 h，純樹脂浸透過夜；最后包埋、磨樣、切片、透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)后拍照。

1.3.7 細(xì)胞凋亡程度測定

誘導(dǎo)結(jié)束后，收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒步驟加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，輕輕重懸細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻；加入10 μL的碘化丙啶，混勻；室溫條件下避光放置10～20 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 Ang Ⅱ?qū)UVECs活力的影響

細(xì)胞活力反映了細(xì)胞的損傷程度，是細(xì)胞損傷模型的基本考察指標(biāo)。通過檢測Ang Ⅱ?qū)UVECs的增殖抑制作用，確定Ang Ⅱ?qū)UVECs的損傷程度。從圖1可以看出，隨著Ang Ⅱ濃度的增加，細(xì)胞活力呈現(xiàn)降低趨勢。0.01 μmol/L Ang Ⅱ?qū)?xì)胞活力影響不顯著，而0.10 μmol/L Ang Ⅱ?qū)?xì)胞活力在誘導(dǎo)6 h時(shí)有顯著影響（P＜0.05）。1.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導(dǎo)3 h后，相對細(xì)胞數(shù)量為（58.16±5.90）%，表明HUVECs已經(jīng)發(fā)生極顯著損傷（P＜0.01）；作用6 h后，HUVECs活力極顯著下降（P＜0.01），相對細(xì)胞數(shù)量為（49.06±2.72）%；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，Ang Ⅱ?qū)UVECs的損傷進(jìn)一步加劇，細(xì)胞活力逐漸下降；12 h時(shí)相對細(xì)胞數(shù)量為（44.85±0.98）%，之后下降速率減小。10.00 μmol/L Ang Ⅱ組與1.00 μmol/L Ang Ⅱ組在影響細(xì)胞活力上類似。這與Zhang Hong等[16]用1 μmol/L Ang Ⅱ誘導(dǎo)細(xì)胞12 h時(shí)所得的細(xì)胞活力相似。

圖1 不同濃度AngⅡ誘導(dǎo)不同時(shí)間對HUVECs活力的影響Fig. 1 Viability of HUVECs induced by different concentration of Ang Ⅱ for different times

2.2 Ang Ⅱ?qū)UVECs形態(tài)變化的影響

圖2 HUVECs倒置顯微鏡圖（10×10）Fig. 2 Inverted phase contrast microscopic images of HUVECs (10 × 10)

Ang Ⅱ?qū)UVECs作用12h的形態(tài)變化如圖2所示，空白組（圖2a）HUVECs貼壁生長，形態(tài)為短梭狀或三角形，較為飽滿，大小均一，細(xì)胞間緊密連接，界限清晰，呈現(xiàn)出單層“鵝卵石”狀，與報(bào)道的健康HUVECs狀態(tài)相符合[17]。0.01 μmol/L Ang Ⅱ誘導(dǎo)組（圖2b）與空白組相似；0.10 μmol/L Ang Ⅱ誘導(dǎo)組（圖2c）部分細(xì)胞發(fā)生收縮、變圓，但數(shù)量變化不夠明顯；1.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導(dǎo)組（圖2d）細(xì)胞收縮、變圓的數(shù)量增多，有少量碎片，部分細(xì)胞出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象；10.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導(dǎo)組（圖2e）細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)不一，部分細(xì)胞細(xì)胞膜降解，細(xì)胞死亡嚴(yán)重，可能是由于Ang Ⅱ與其受體結(jié)合激活了細(xì)胞內(nèi)的Caspase通路導(dǎo)致細(xì)胞死亡，此時(shí)多數(shù)細(xì)胞已發(fā)生不可逆損傷[18-19]，不適合建立高血壓損傷模型，故1.00 μmol/L Ang Ⅱ?yàn)檩^為合適的建立模型濃度。

用倒置相差顯微鏡觀察到的細(xì)胞形態(tài)只是一個(gè)宏觀表現(xiàn)，若要進(jìn)一步判斷細(xì)胞的損傷程度，還需觀察細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)，測定相關(guān)功能因子的分泌及凋亡程度。

2.3 Ang Ⅱ?qū)UVECs內(nèi)MDA含量的影響

圖3 不同濃度AngⅡ誘導(dǎo)不同時(shí)間對MDA含量的影響Fig. 3 Effect of Ang Ⅱ concentration and induction time on MDA conte

Ang Ⅱ?qū)UVECs內(nèi)MDA的影響如圖3所示。整體來看，隨著誘導(dǎo)劑濃度增加和誘導(dǎo)時(shí)間的延長，MDA含量呈增加趨勢。在6～9 h之間，細(xì)胞MDA含量逐漸增加，在12 h時(shí)，1.00 μmol/L和10.00 μmol/L的Ang Ⅱ誘導(dǎo)后所產(chǎn)生的MDA含量上升速率較快，與空白組有顯著差異（P＜0.05）。細(xì)胞內(nèi)逐漸增加的MDA會(huì)破壞細(xì)胞膜及線粒體膜結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量的增加，加劇氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞分泌功能紊亂，進(jìn)一步引起細(xì)胞損傷[20]。結(jié)合前面所述，10.00 μmol/L Ang Ⅱ不適合建立高血壓損傷模型。根據(jù)交叉設(shè)計(jì)方差分析得出時(shí)間F值為99.726，Sig值為0.000；濃度F值為122.173，Sig值為0.000；時(shí)間×濃度F值為8.057，Sig值為0.000。主體間效應(yīng)：濃度＞時(shí)間＞時(shí)間×濃度。根據(jù)多重比較結(jié)果為3、6、9、12、24 h之間MDA含量均有顯著性差異。1.00 μmol/L與10.00 μmol/L Ang Ⅱ之間MDA含量沒有顯著性差異，其余濃度組間均有顯著差異（P＜0.05），故選取1.00 μmol/L為最佳誘導(dǎo)濃度，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為12 h。

2.4 Ang Ⅱ?qū)UVECs內(nèi)SOD活力的影響

Ang Ⅱ?qū)UVECs內(nèi)SOD活力的影響如圖4所示。隨著誘導(dǎo)劑濃度增加和誘導(dǎo)時(shí)間的延長，SOD活力呈下降趨勢。在12 h前的下降速率比12 h后要快，可能是由于后期誘導(dǎo)劑被細(xì)胞代謝且細(xì)胞本身發(fā)揮修復(fù)作用。SOD活力的下降導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化反應(yīng)失衡[21]，細(xì)胞無法及時(shí)清除產(chǎn)生的自由基和MDA，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA及細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重[22]。研究證明SOD活性與高血壓患者的血壓呈負(fù)相關(guān)[23]，SOD和MDA的聯(lián)合測定可以更好地評價(jià)細(xì)胞模型損傷程度。10.00 μmol/L Ang Ⅱ損傷組SOD活力下降最快，為了防止細(xì)胞過度損傷，造成不可逆修復(fù)，所以不可選擇10 μmol/L Ang Ⅱ進(jìn)行誘導(dǎo)。由交叉設(shè)計(jì)方差分析得時(shí)間F值為2.741，Sig值為0.039；濃度F值為10.490，Sig值為0.000；時(shí)間×濃度F值為0.338，Sig值為0.990。由多重比較分析得出同一濃度誘導(dǎo)3、6、9、12 h之間細(xì)胞中SOD活力均有顯著差異，但同一濃度的12 h與24 h無顯著性差異，說明12 h是細(xì)胞內(nèi)SOD變化減緩的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。在9～12 h之間，從圖4可以看出，濃度為1.00 μmol/L時(shí)SOD活力下降速率最大，故1.00 μmol/L為最佳誘導(dǎo)濃度，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為12 h。

Ⅱ誘導(dǎo)不同時(shí)間對HUVECs中SOD活力的影響Fig. 4 Effect of Ang Ⅱ concentrations and induction time on SOD activity圖4 不同濃度Ang

2.5 Ang Ⅱ?qū)UVECs內(nèi)NO含量的影響

圖5 不同濃度Ang Ⅱ誘導(dǎo)不同時(shí)間對HUVECs中NO生成的影響Fig. 5 Effect of Ang Ⅱ concentration and induction time on NO production

Ang Ⅱ?qū)UVECs內(nèi)NO含量的影響如圖5所示。Ang Ⅱ?qū)O的釋放具有抑制作用，隨著Ang Ⅱ濃度的增加和時(shí)間的延長，NO含量呈現(xiàn)下降趨勢。其中0.01 μmol/L和0.10 μmol/L損傷組NO含量下降較為緩慢，而1.00 μmol/L在6～12 h之間下降速率增大。細(xì)胞NO釋放量過少，會(huì)引起血管收縮，血壓增加，導(dǎo)致高血壓等心腦血管疾病的發(fā)生[24]。10.00 μmol/L與1.00 μmol/L損傷組之間NO含量無顯著差異（P＞0.05）。故選擇1.00 μmol/L Ang Ⅱ來建立高血壓損傷模型。NO是內(nèi)皮損傷模型中最重要的指標(biāo)，其釋放量還需結(jié)合NOS活性來闡明其釋放機(jī)理。進(jìn)行交叉設(shè)計(jì)方差分析得出時(shí)間F值為14.598，Sig值為0.000；濃度F值為68.740，Sig值為0.000；時(shí)間×濃度F值為3.392，Sig值為0.000。主體間效應(yīng)：濃度＞時(shí)間＞時(shí)間×濃度。進(jìn)行多重比較分析得3 h與6 h、9 h與12 h、9 h與24 h、12 h與24 h之間均無顯著差異（P＞0.05）。濃度1.00 μmol/L與10.00 μmol/L Ang Ⅱ損傷組之間NO含量沒有顯著差異，其余濃度組間均有顯著性差異，所以選取1.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導(dǎo)12 h為最佳誘導(dǎo)條件。

2.6 Ang Ⅱ?qū)UVECs內(nèi)NOS活力的影響

圖6 不同濃度Ang Ⅱ誘導(dǎo)不同時(shí)間對HUVECs中TNOS（A）和eNOS（B）活力的影響Fig. 6 Effect of Ang Ⅱ concentration and induction time on TNOS (A) and eNOS(B) activity

Ang Ⅱ?qū)UVECs內(nèi)NOS含量的影響如圖6所示。隨著Ang Ⅱ濃度增加和誘導(dǎo)時(shí)間延長，總一氧化氮合酶（total nitric oxide synthase ，TNOS）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase ，eNOS）活力均呈下降趨勢，且eNOS活力下降較快，高濃度Ang Ⅱ時(shí)eNOS活性幾乎喪失。TNOS在6～12 h時(shí)下降最快，12 h后下降變緩，且1.00 μmol/L誘導(dǎo)12 h 的TNOS活力與10.00 μmol/L 12 h時(shí)沒有顯著性差異（P＞0.05）。而eNOS活力變化與TNOS有相似的趨勢，且下降速率更快，說明高濃度的Ang Ⅱ?qū)е录?xì)胞損傷嚴(yán)重，對eNOS活力抑制更明顯，而eNOS活力下降直接影響到NO的生成[25]，這與前面NO的生成相互呼應(yīng)。結(jié)合TNOS活力來看，在Ang Ⅱ濃度為1.00 μmol/L誘導(dǎo)時(shí)間6～9 h之間時(shí)，TNOS活力下降速率最大。同理，對于eNOS的活力，在Ang Ⅱ?yàn)?.00 μmol/L誘導(dǎo)時(shí)間為9 h時(shí)，eNOS的活力下降速率最大。

對于TNOS活力，根據(jù)交叉設(shè)計(jì)方差分析得出時(shí)間F值為10.158，Sig值為0.000；濃度F值為24.958，Sig值為0.000；時(shí)間×濃度F值為1.926，Sig值為0.040。主體間效應(yīng)為濃度＞時(shí)間＞時(shí)間×濃度。進(jìn)一步進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)同一誘導(dǎo)濃度條件下，誘導(dǎo)3 h與6 h、9 h與12 h、9 h與24 h、12 h與24 h之間均無顯著差異，而6 h與9 h之間有顯著差異（P＜0.05）。

對于eNOS活力，交叉設(shè)計(jì)方差分析得時(shí)間F值為28.429，Sig值為0.000；濃度F值為60.934，Sig值為0.000；時(shí)間×濃度F值為2.308，Sig值為0.013。主體間效應(yīng)為濃度＞時(shí)間＞時(shí)間×濃度。多重比較發(fā)現(xiàn)同一誘導(dǎo)濃度條件下，12 h與24 h之間無顯著性差異，其余各誘導(dǎo)時(shí)間之間均有顯著性差異。在同一時(shí)間條件下，濃度1.00 μmol/L與10.00 μmol/L之間沒有顯著性差異，1.00 μmol/L與0.10、0.01 μmol/L之間均有顯著性差異，所以選取1.00 μmol/L、12 h為最佳誘導(dǎo)條件。

2.7 HUVECs微觀結(jié)構(gòu)的變化

圖7 HUVECs電子顯微鏡圖Fig. 7 Transmission electron microscopic images of HUVECs

空白組（圖7A1、B1）細(xì)胞核核膜清晰，核仁完整，細(xì)胞器豐富且分布均勻，胞漿內(nèi)空泡含量較少且小，各細(xì)胞器形態(tài)正常。而1.00 μmol/L Ang Ⅱ損傷組（圖7A2、B2）核膜皺縮，核仁消失，細(xì)胞核變長，邊緣凹陷、不規(guī)則，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量多篩孔樣空泡，線粒體或者細(xì)小或者腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張數(shù)目較少，部分核糖體丟失，平面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。當(dāng)Ang Ⅱ濃度上升到10.00 μmol/L時(shí)，由圖7A3、B3可以看到細(xì)胞核縮為一小塊，核仁消失，胞漿內(nèi)空泡嚴(yán)重，幾乎將細(xì)胞解體，線粒體或腫脹或細(xì)長，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量嚴(yán)重減少，核糖體嚴(yán)重?fù)p失，細(xì)胞骨架不完整。表明細(xì)胞在不同濃度Ang Ⅱ的誘導(dǎo)下出現(xiàn)了不同程度的損傷。

2.8 HUVECs凋亡程度

圖8 HUVECs凋亡圖Fig. 8 Early and late apoptotic cells

圖9 HUVECs流式細(xì)胞圖Fig. 9 Flow cytometry scatter plots of HUVECs

由圖8、9可以得出，HUVECs受到Ang Ⅱ刺激后，細(xì)胞總凋亡數(shù)量明顯增多，其中0.10 μmol/L損傷組凋亡早期細(xì)胞數(shù)量與空白組相比顯著增加（P＜0.05），1.00 μmol/L損傷組凋亡早期細(xì)胞數(shù)量與空白組相比極顯著增加（P＜0.01）。10.00 μmol/L損傷組凋亡晚期細(xì)胞數(shù)量與空白組相比極顯著性增加（P＜0.01）。空白組正常細(xì)胞占（81.3±2.0）%，經(jīng)過0.10、1.00、10.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導(dǎo)后，正常細(xì)胞數(shù)量下降到（72.4±1.1）%、（44.4±0.8）%、（26.9±0.5）%，與空白組均有顯著性差異（P＜0.05）。0.10、1.00、10.00 μmol/L Ang Ⅱ損傷組細(xì)胞總凋亡率分別為（14.7±1.2）%、（41.5±1.7）%、（68.6±3.5）%，顯著高于空白組（7.8±1.5）%（P＜0.05）。這直觀地說明Ang Ⅱ能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與楊慧宇等[2]的研究結(jié)果相似。

3 討 論

近年研究表明，血管內(nèi)皮功能障礙是高血壓病的重要病理變化，也是高血壓血管損害的始發(fā)因素[26]。而高血壓也可引起內(nèi)皮細(xì)胞功能損害，患高血壓時(shí)，由于血流切應(yīng)力及血流搏動(dòng)過強(qiáng)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變和功能的失調(diào)，生物活性物質(zhì)合成、分泌異常，致使內(nèi)皮依賴性舒張功能減弱和收縮功能增強(qiáng)[27]。該模型的損傷程度與高血壓的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[28]。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的很多活性物質(zhì)如凝血酶、ADP、ATP等舒血管作用變?yōu)榭s血管作用，從而影響Endothelin-1（ET-1）/NO的協(xié)調(diào)狀態(tài)，破壞了自身調(diào)節(jié)體系的平衡，使得ET合成增多，影響NO的合成和釋放，導(dǎo)致血管張力調(diào)節(jié)的紊亂，內(nèi)皮依賴性舒張功能下降、收縮功能增強(qiáng)，血管壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致血壓的升高[29]。而在進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常選用的細(xì)胞模型為HUVECs，而不是直接采用靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞或動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，原因是臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞具有干細(xì)胞的功能，理論上可以傳代50～60 次。而且HUVECs與血管內(nèi)皮細(xì)胞有相似的生物學(xué)特征，接近人體生理狀態(tài)，無種屬差異、取材容易、來源豐富且符合倫理性[30]，所以本實(shí)驗(yàn)選用HUVECs建立高血壓損傷體外模型。

迄今為止，HUVECs高血壓損傷模型還沒有一個(gè)統(tǒng)一的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。理想的HUVECs高血壓損傷模型應(yīng)該可靠、容易定量、操作簡便、符合人體生理環(huán)境。但是由于疾病本身具有復(fù)雜性，如高血壓可分為輕度、中度及重度，加之高血壓患者容易引起并發(fā)癥，故反映在單獨(dú)一種細(xì)胞模型上，很難滿足所有的條件，導(dǎo)致細(xì)胞損傷模型的標(biāo)準(zhǔn)很難判定。體外細(xì)胞模型能較好控制實(shí)驗(yàn)過程，且費(fèi)用低，但條件難以標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需進(jìn)一步的結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。由此可見，許多實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦€有待于日后進(jìn)一步研究和完善，只有借助趨于完善的模型，才能更好地篩選誘導(dǎo)劑的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，從而得到更真實(shí)、客觀、全面的信息。

綜合已有研究，HUVECs高血壓損傷模型以Ang Ⅱ作為誘導(dǎo)劑成功建立時(shí)，誘導(dǎo)劑濃度范圍在0.1～1.0 μmol/L之間，誘導(dǎo)時(shí)間在6～24 h之間。根據(jù)損傷組各濃度Ang Ⅱ?qū)?xì)胞的形態(tài)、活性、功能、微觀結(jié)構(gòu)及凋亡的影響結(jié)果，選取Ang Ⅱ 1.00 μmol/L誘導(dǎo)12 h為最佳誘導(dǎo)條件。本實(shí)驗(yàn)中 Ang Ⅱ?qū)?xì)胞的形態(tài)、活性及凋亡均有一定的影響，且隨著Ang Ⅱ濃度增加，誘導(dǎo)時(shí)間延長，HUVECs損傷程度增加，其中1.00 μmol/L Ang Ⅱ誘導(dǎo)HUVECs 12 h時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)與空白組相比均有顯著差異。本實(shí)驗(yàn)選擇1 μmol/L Ang Ⅱ誘導(dǎo)12 h作為成功建立HUVECs高血壓損傷模型的合適誘導(dǎo)劑濃度及時(shí)間，建立的HUVECs高血壓損傷模型可以為食品功能因子及藥物干預(yù)血壓調(diào)節(jié)提供方法學(xué)參考。

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Establishment of Angiotensin Ⅱ-Induced Model in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

LIU Guoyan, SUN Beibei, ZHANG Jie, YU Suning, JIANG Donglei, FANG Weiming, XU Xin*
(College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

Objective: This research was aimed to establish a hypertensive damage model in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by angiotensin (Ang) Ⅱ. Methods: HUVECs were induced with different concentrations (0.01, 0.10, 1.00 and 10.00 μmol/L) of Ang Ⅱ for different times (3, 6, 9, 12 and 24 h), respectively. The injury degree of HUVECs was evaluated by cellular morphology, viability, function, microstructure, and apoptosis. The optimal concentration and time were obtained by using variance analysis and multiple comparison tests. Results: Ang Ⅱ induced injury in HUVECs in a dose- and time-dependent manner. The optimal Ang Ⅱ concentration and induction time were respectively 1.00 μmol/L, and 12 h. After 12 h induction by 1 μmol/L Ang Ⅱ induced, the cell viability was 44.85%, nitric monoxide (NO) content was 43.57 μmol/L, total nitric oxide synthase (TNOS) activity was 6.99 U/mg pro, endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity was 1.89 U/mg pro, malonaldehyde (MDA) content was 7.46 nmol/mL, superoxide dismutase (SOD) activity was 27.29 U/mg pro, and apoptosis percentage was 41.5%. The microstructure showed that the nuclear membrane shrivel and nucleolus disappeared, and a large number of air bubbles appeared inside the cytoplasm. Small and swollen mitochondria, only a small number of expanded rough endoplasmic reticula, partial loss of ribosome, and endoplasmic reticulum expansion were observed, but the cells did not collapse, and still maintained their normal structure. Conclusion: Induction with 1.00 μmol/L Ang Ⅱ for 12 h allows successful establishment of a hypertensive damage model in HUVECs.

angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ); human umbilical vein endothelial cells (HUVECs); hypertension; cell model

10.7506/spkx1002-6630-201713029

TS201.4

A

1002-6630（2017）13-0174-08

2016-05-23

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471578）

劉國艷（1979—），女，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：liugy@yzu.edu.cn

*通信作者：徐鑫（1977—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：xuxin@yzu.edu.cn

劉國艷, 孫貝貝, 張潔, 等. Ang Ⅱ誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立高血壓損傷模型[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(13): 174-181.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713029. http://www.spkx.net.cn

LIU Guoyan, SUN Beibei, ZANG Jie, et al. Establishment of angiotensin Ⅱ-induced model in human umbilical vein endothelial cells[J]. Food Science, 2017, 38(13): 174-181. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713029. http://www.spkx.net.cn