徐春蘭,王凡,東紅升

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海201203;2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030)

音樂(lè)電針對(duì)急性腦出血大鼠灶周鐵離子、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡百分率和腦組織含水量的影響

徐春蘭1,王凡1,東紅升2

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海201203;2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030)

目的觀察音樂(lè)電針對(duì)急性腦出血大鼠腦內(nèi)灶周鐵離子變化、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和腦組織含水量變化的影響,探討音樂(lè)電針對(duì)急性腦出血的作用機(jī)制。方法將128只健康成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、電針組和音樂(lè)電針組,每組分為6h、24h、3d、7d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只。應(yīng)用膠原酶法制備急性腦出血大鼠模型。電針組和音樂(lè)電針組正極接百會(huì)穴,負(fù)極接太陽(yáng)穴,選擇參數(shù)為2 V,通電時(shí)間為30min。于造模后6h、24h、3d、7d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀測(cè)腦內(nèi)灶周鐵離子變化的水平、灶周神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及腦組織含水量的變化。結(jié)果造模后6h、24h、3d、7d,模型組、電針組、音樂(lè)電針組大鼠腦內(nèi)鐵離子含量、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡均高于正常組(P＜0.05),24h、3d、7d時(shí)電針組、音樂(lè)電針組均低于模型組(P＜0.05),3d、7d時(shí)音樂(lè)電針組低于電針組(P＜0.05)。造模后6h、24h、3d、7d,模型組、電針組、音樂(lè)電針組大鼠腦組織含水量均高于正常組(P＜0.05),3d時(shí)電針組、音樂(lè)電針組均低于模型組(P＜0.05),7d時(shí)音樂(lè)電針組低于電針組(P＜0.05)。結(jié)論音樂(lè)電針對(duì)急性腦出血大鼠腦內(nèi)灶周鐵離子有良性調(diào)節(jié)作用,抑制腦出血后早期血腫周?chē)课簧窠?jīng)元細(xì)胞凋亡的發(fā)生,減輕腦水腫,療效優(yōu)于電針組。

電針;腦出血;鐵離子;神經(jīng)元細(xì)胞;大鼠

腦出血是常見(jiàn)的腦血管疾病,占卒中的20%～30%,具有高發(fā)病率、高致殘率的特點(diǎn),給家庭和社會(huì)帶來(lái)重大負(fù)擔(dān)。近年研究發(fā)現(xiàn),腦出血后紅細(xì)胞裂解,釋放的血紅蛋白及其降解產(chǎn)物鐵離子,在介導(dǎo)腦出血后氧化損傷和細(xì)胞凋亡在繼發(fā)性腦損傷機(jī)制中起著重要的作用[1]。本研究以腦出血大鼠為模型,探討音樂(lè)電針對(duì)急性腦出血大鼠腦內(nèi)灶周鐵離子、神經(jīng)元細(xì)胞影響,具體方法如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

128只健康成年雄性Wistar大鼠,體重為250～300g,清潔級(jí)。由上海中國(guó)科技院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(合格證號(hào)SCXK滬2007-0002)。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心普通飼養(yǎng)室,人工光照,光暗各12h,45%左右相對(duì)濕度,自由飲食,飼料由上海必凱公司提供,適應(yīng)性飼養(yǎng)1星期。大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、電針組、音樂(lè)電針組,每組分為6h、24h、3d、7d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

膠原酶Ⅶ(Sigma America);肝素(江蘇江山生化制藥有限公司);水合氯醛(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)。

1.2.2 主要儀器

動(dòng)物頭顱立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司,單臂腦立體定位儀/8001);微量進(jìn)樣器(上海高欣玻璃儀器);牙科鉆頭(北京醫(yī)療設(shè)備廠);IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(上海申騰信息技術(shù)有限公司);顯微鏡(OLYMPUS BH2);數(shù)碼相機(jī)(NI KON儀器);切片機(jī)(RM2145,Lico,德國(guó));凝膠成像分析系統(tǒng)(Chemi Imager5500,Alpha Innotech,美國(guó));組織勻漿機(jī)(UP 200s,DR Hielscher,德國(guó));恒溫水浴箱(1070,FEL,德國(guó));LSRⅡ型流式細(xì)胞儀(BD公司);華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠);音樂(lè)電針儀2J-12H(哈爾濱福恩堂醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 造模方法

參照任澤光等[2]的方法,大鼠10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉后,俯臥位固定于腦立體定位儀,調(diào)節(jié)門(mén)齒托的高度,使動(dòng)物的前、后齒處于同一水平。頭頂備皮后,局部皮膚采用碘伏消毒,在頭頂部約前囟所在位置縱向剪一長(zhǎng)10mm的窗口,剝離骨膜,以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn),向前0.48mm,向右 3mm,確定注射點(diǎn)坐標(biāo),用牙科鉆鉆直徑約1.0mm圓孔直達(dá)骨膜,穿透顱骨但不傷及腦組織(按Pellegrio圖譜B坐標(biāo)系定位右尾核,A 0.48～0.5;R 2.6～3.4;H 5.0～7.0)。用微量注射器吸取含0.25u/μL膠原酶的生理鹽水和6.25u/μL肝素的生理鹽水各10μL,沿鉆孔處豎直、緩慢進(jìn)針6.0mm,緩慢勻速注射5min后,留針10min,緩慢退針2～3min,切口處撒少許青霉素粉防止局部感染,縫合皮膚,放回籠內(nèi)觀察、飼養(yǎng)。造模后的動(dòng)物在自然蘇醒后,參照Z(yǔ)ea-Longa的5級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3],對(duì)其神經(jīng)障礙進(jìn)行評(píng)分。0級(jí),無(wú)神經(jīng)功能喪失;1級(jí),右前肢不能充分伸展;2級(jí),向右環(huán)形運(yùn)動(dòng),輕度局灶神經(jīng)功能缺失;3級(jí),向右側(cè)倒,中度局灶神經(jīng)功能缺失;4級(jí),不能自然行走,重度局灶神經(jīng)功能缺失。只有神經(jīng)功能障礙在1級(jí)(含)以上的存活大鼠才能入組。

1.4 治療方法

參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4],大鼠百會(huì)穴定位于大鼠頭頂兩耳根連線與前后中線交點(diǎn)。太陽(yáng)定位于外眼角與耳之間的凹陷中。常規(guī)消毒,以0.25mm× 25mm毫針,分別刺入百會(huì)(向右前太陽(yáng)穴方向)和太陽(yáng)(右側(cè))穴。電針組將正極接百會(huì)穴毫針,負(fù)極接太陽(yáng)穴毫針,選擇參數(shù)為2 V、15 Hz,連續(xù)波,通電時(shí)間為30min。音樂(lè)電針組將2J-12H型音樂(lè)脈沖治療儀正極接百會(huì)穴,負(fù)極接太陽(yáng)穴,選擇參數(shù)為2V,選中風(fēng)治療單元樂(lè)曲聲波,通電時(shí)間為30min。6h組為造模后6h針刺1次后取材檢測(cè),24h為造模后24h針刺1次后取材檢測(cè),3d、7d為造模后每日針刺1次。

1.5 樣本取材處理

治療結(jié)束后,頸椎脫臼方法處死大鼠。然后用剪刀迅速沿著枕骨大孔處剪斷頸椎,用止血鉗迅速剝離顱骨,將大腦取出,取注射部位腦組織后部,平均分為兩份,放置在凍存管中,低溫保存。用于鐵離子含量測(cè)定和流式陽(yáng)性細(xì)胞百分率測(cè)定。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 鐵離子含量測(cè)定

取腦組織加入濃硝酸5mL(16mol/L)和高氯酸0.5mL(12mol/L),加熱消化至清亮,用原子吸收光譜法測(cè)定。

1.6.2 流式陽(yáng)性細(xì)胞百分率測(cè)定

AnnexinV檢測(cè)(磷脂酞絲氨酸外翻分析)。組織加入PBS勻漿,離心收集(1500r/min,5min)細(xì)胞;PBS洗兩遍;重懸于200μL Binding Buffer(結(jié)合液)中使細(xì)胞終濃度為2×105～1×105個(gè)/mL;加熒光標(biāo)記的AnnexinV-FITC10μL和5μL PI混勻,加入300μL Binding Buffer;流式細(xì)胞儀檢測(cè)觀測(cè)結(jié)果。采用488nm激發(fā),其檢測(cè)波長(zhǎng)分別是527nm和590nm。

1.6.3 腦組織含水量測(cè)定

大鼠麻醉下,斷頭處死,處死后迅速提取腦作冠狀全腦切片(定位切片發(fā)現(xiàn)注射部位在右側(cè)尾狀核),取含注射部位腦組織前部做腦含水量測(cè)定。立即用薄層刀片取血腫周?chē)M織,稱(chēng)濕重后將腦組織塊放入干燥箱中100℃烘烤24h后,再稱(chēng)干重。按干濕重法測(cè)定腦水含量,以腦水含量代表腦水腫的程度。

計(jì)算公式為腦組織水含量=[(濕重－干重)/濕重]×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦內(nèi)灶周鐵離子比較

造模后6h、24h、3d、7d,模型組、電針組、音樂(lè)電針組與正常組大鼠腦內(nèi)灶周鐵離子比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);電針組、音樂(lè)電針組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在造模后24h、3d、7d,電針組、音樂(lè)電針組大鼠腦內(nèi)灶周鐵離子含量均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。造模后 3d、7d,音樂(lè)電針組大鼠腦內(nèi)灶周鐵離子含量低于電針組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說(shuō)明針刺能降低腦出血大鼠腦內(nèi)灶周鐵離子含量,減輕水腫。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦內(nèi)灶周鐵離子比較 (±s,mg/kg)

表1 各組大鼠腦內(nèi)灶周鐵離子比較 (±s,mg/kg)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與電針組比較3)P＜0.05

?

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)觀察

造模后在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型組較正常組可見(jiàn)大量白細(xì)胞浸潤(rùn),有膠質(zhì)細(xì)胞聚集現(xiàn)象,而電針組、音樂(lè)電針組白細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞聚集較模型組少,音樂(lè)電針組較電針組更少。詳見(jiàn)圖1。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)各組急性腦出血大鼠TUNEL染色圖片(×200)

2.3 各組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡百分率比較

造模后6h、24h、3d、7d,模型組、電針組、音樂(lè)電針組與正常組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡百分率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);6h時(shí)電針組、音樂(lè)電針組與模型組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。24h、3d時(shí)電針組、音樂(lè)電針組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡百分率與模型組比較,均低于模型組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),電針組與音樂(lè)電針組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);7d時(shí)電針組、音樂(lè)電針組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡百分率與模型組比較,均低于模型組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),音樂(lè)電針組低于電針組,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡百分率比較 (±s,%)

表2 各組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡百分率比較 (±s,%)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與電針組比較3)P＜0.05

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2.4 各組大鼠腦組織含水量比較

造模后6h、24h、3d、7d,模型組、電針組、音樂(lè)電針組大鼠腦組織含水量與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);電針組、音樂(lè)電針組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。3d時(shí)電針組、音樂(lè)電針組大鼠腦組織含水量與模型組比較,均低于模型組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),電針組與音樂(lè)電針組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);7d時(shí)電針組、音樂(lè)電針組大鼠腦組織含水量與模型組比較,均低于模型組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),音樂(lè)電針組低于電針組,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腦組織含水量比較 (±s,%)

表3 各組大鼠腦組織含水量比較 (±s,%)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與電針組比較3)P＜0.05

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3 討論

腦出血后,血腫中心被血腫本身占位性損害,局部腦組織血液循環(huán)障礙,造成缺血缺氧。而隨著出血時(shí)間延長(zhǎng),出血增多,可能造成神經(jīng)元生存環(huán)境的破壞,血中神經(jīng)毒性物質(zhì)加劇了神經(jīng)元的損傷。有研究發(fā)現(xiàn),腦血腫中具有很高神經(jīng)毒性作用的血紅蛋白,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化作用反應(yīng)及自由基的形成[5]。在大鼠腦出血后,腦脊液內(nèi)的自由鐵濃度增加,至少 28d后過(guò)多的鐵才能被清除[6］。神經(jīng)元凋亡的重要觸發(fā)因素之一可能是血腫吸收過(guò)程中釋放的血紅素和鐵離子[7]。在腦出血過(guò)程中鐵總濃度的增加,會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞嚴(yán)重的毒性損傷。腦水腫是腦出血較早被發(fā)現(xiàn)的繼發(fā)性神經(jīng)損傷之一,腦水腫的程度及持續(xù)時(shí)間與腦出血的預(yù)后密切相關(guān)。大鼠腦出血后腦內(nèi)直接注射鐵離子可以直接引起腦水腫而鐵離子螯合劑能減輕水腫,說(shuō)明鐵離子在腦出血水腫的形成中具有重要的作用[8]。鐵離子螯合劑可以通過(guò)降低血紅蛋白誘導(dǎo)的組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的表達(dá),減少腦出血后腦細(xì)胞發(fā)生神經(jīng)退行性變[9]。

本研究結(jié)果顯示,腦出血后,針刺可降低腦內(nèi)鐵離子含量,降低腦組織水腫,減少腦神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,電針組、音樂(lè)電針組腦內(nèi)鐵離子含量、腦內(nèi)凋亡細(xì)胞百分率及腦組織含水量均顯著低于模型組(P＜0.05),說(shuō)明腦出血后早期鐵離子濃度升高導(dǎo)致血腫周?chē)课患?xì)胞凋亡發(fā)生,而電針能下調(diào)鐵離子含量,減輕腦水腫,減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果也表明,腦出血后,音樂(lè)電針組腦內(nèi)鐵離子含量、腦內(nèi)含水量及腦內(nèi)凋亡細(xì)胞百分率在7d均顯著低于電針組(P＜0.05),說(shuō)明音樂(lè)電針療效優(yōu)于普通電針。中國(guó)古代將聲音分為角、徵、宮、商、羽五個(gè)音階,以此為基礎(chǔ),音樂(lè)的調(diào)式分為五種,不同調(diào)式的音樂(lè)具有不同的感染力,產(chǎn)生不同的音樂(lè)效果。音樂(lè)電針療法是將音樂(lè)療法、音樂(lè)電流和電針療法結(jié)合起來(lái)治療疾病的方法[10],使患者在機(jī)體和心理上獲得雙重的治療效果[11]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》提出五音療疾的方法根據(jù)五種調(diào)式與五臟、五志的關(guān)系選曲編排治療[12]。據(jù)中國(guó)傳統(tǒng)五音療法理論,探索不同音樂(lè)元素、音樂(lè)電流與臟腑、經(jīng)絡(luò)、器官相關(guān)的現(xiàn)代理論依據(jù),從而擴(kuò)展音樂(lè)范圍和臨床應(yīng)用范圍,為患者提供更加有效的治療方法[13]。音樂(lè)電針結(jié)合音樂(lè)與針刺療法,其將特定的音頻信號(hào)同步轉(zhuǎn)化為頻率多變的脈沖電流,克服了傳統(tǒng)電針長(zhǎng)時(shí)間單一頻率刺激所致的腧穴耐受性及不敏感性的現(xiàn)象[14-17]。音樂(lè)電針還能維持神經(jīng)纖維的興奮性,易產(chǎn)生持久針感,以最大程度維持治療效果,減少治療周期[18-21]。

綜上所述,電針組和音樂(lè)電針組對(duì)急性腦出血大鼠腦內(nèi)鐵離子有調(diào)節(jié)作用,改善腦內(nèi)微環(huán)境的變化,減輕腦水腫,阻止神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響[22-25],本研究也表明,音樂(lè)電針療效優(yōu)于普通電針,原因可能是音樂(lè)電針克服了長(zhǎng)時(shí)間刺激后引起腧穴耐受性和不敏感性[26-29]。

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Effect of Music Electroacupuncture on Perifocal Ferric Ions and Neuronal Apoptosis Percentage and the Brain Water Content in Rats with Acute Cerebral Hemorrhage

XU C hun-lan1, WANG F an1, DONG Ho ng-sheng2.1.Shanghai University of T raditional Ch inese Med icine,Shanghai 201203,China;2.Shanghai Resea rch Institute of Acupuncture and Meridian,Shanghai 200030,China

ObjectiveTo investigate the effect of music electroacupuncture on perifocal ferric ions and neuronal apoptosis and the brain water content in rats with acute cerebral hemorrhage and explore the mechanism of its action on acute cerebral hemorrhage.MethodsOne hundred and twenty-eight healthy adult male Wister rats were randomized to normal, model, electroacupuncture and music electroacupuncture groups. In each group, four time points of 6 hrs,24 hrs,3 days and 7 days were set up, eight rats each time point. A rat model of acute cerebral hemorrhage was made using collagenase. In the electroacupuncture and music electroacupuncture groups, point Baihui was connected to the anode and point Taiyang to the cathode,2 voltage was used as a selection parameter and electroacupuncture lasted 30min. Intracerebral perifocal ferric ions and neuronal apoptosis and the brain water content were measured at four time points of 6 hrs,24 hrs,3 days and 7 days after model making.ResultsIntracerebral ferric ion content was higher in the model, electroacupuncture and music electroacupuncture groups of rats than in the normal group at 6 hrsafter model making (P＜0.05), lower in the electroacupuncture and music electroacupuncture groups than in the model group at 24 hrs,3 and 7 days after model making (P＜0.05) and lower in the music electroacupuncture group than in the electroacupuncture group at 3 and 7 days after model making (P＜0.05). Intracerebral neuronal apoptosis was higher in the model, electroacupuncture and music electroacupuncture groups of rats than in the normal group at 6 hrs after model making (P＜0.05) and lower in the music electroacupuncture group than in the electroacupuncture group at 7 days after model making (P＜0.05). The brain water content was higher in the model, electrocupuncture and music electroacupuncture groups of rats than in the normal group at 6 and 24 hrs after model making(P＜0.05), lower in the electroacupuncture and music electroacupuncture groups than in the model group at 3 days after model making (P＜0.05) and lower in the music electroacupuncture group than in the electroacupuncture group at 7 days after model making (P＜0.05).Conclusions Music electroacupuncture has a benign regulating effect on intracerebral perifocal ferric ions, inhibits neuronal apoptosis around hematoma in the early stage and reduces cerebral edema in rats with acute cerebral hemorrhage. Its therapeutic effect is superior to that of electroacupuncture.

Music electroacupuncture; Cerebral hemorrhage; Ferric ion; Neuron; Rat

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.07.0840

1005-0957(2017)07-0840-06

2016-10-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30500677)

徐春蘭(1989—),女,2013級(jí)碩士生,Email:xuchunlan23@126.com

東紅升(1971—),男,副研究員,博士,Email:dhsdoctor2005@126.com