楊彪，郭杰，肖純凌*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧沈陽110847；2.沈陽醫(yī)學院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室）

PM2.5暴露對CB17-SCID荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞活力的影響

楊彪1，郭杰2，肖純凌2*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧沈陽110847；2.沈陽醫(yī)學院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室）

目的：探討PM2.5暴露對CB17-SCID荷瘤小鼠肺泡巨噬細胞活力的影響。方法：制作CB17-SCID荷瘤小鼠模型；應用冷光源內(nèi)窺鏡和電泳點樣吸頭完成對CB17-SCID荷瘤小鼠的PM2.5暴露和生理鹽水暴露；采用BCA法檢測支氣管肺泡灌洗液中總蛋白水平，細胞活力實驗檢測肺泡巨噬細胞的增殖能力，中性紅實驗檢測肺泡巨噬細胞吞噬功能。結果：PM2.5暴露組支氣管肺泡灌洗液中總蛋白水平、肺泡巨噬細胞增殖能力及吞噬功能均明顯高于生理鹽水暴露組（P＜0.01）。結論：PM2.5暴露處理CB17-SCID荷瘤小鼠，激活肺泡巨噬細胞清除PM2.5的功能，同時刺激呼吸系統(tǒng)分泌機體蛋白。

空氣細顆粒物；支氣管肺泡灌洗液；肺泡巨噬細胞；細胞活力實驗；中性紅實驗；CB17-SCID荷瘤小鼠

近年，空氣污染物尤其是PM2.5暴露已經(jīng)成為危害人類健康的重要問題，PM2.5暴露會導致肺功能的降低及肺實質(zhì)的損傷。流行病學研究表明，環(huán)境中PM2.5的含量不斷提高，會增加肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病和心血管系統(tǒng)疾病的入院率和死亡率[1]。肺泡巨噬細胞（alveolar macrophages，AMs）廣泛分布于呼吸道肺泡表面，作為肺部主要的免疫防御細胞，當有刺激因子作用時，即在機體需要加強炎癥反應時，分泌促進炎癥或放大炎癥的介質(zhì)，而在炎癥反應過于強烈時，分泌抑制炎癥的介質(zhì)[2]。AMs在各個階段釋放的細胞因子水平與機體所處的狀態(tài)相協(xié)調(diào)，以便能發(fā)揮其免疫防御的功能。同時，AMs也具有很強的彈性蛋白酶分泌能力，這使得周圍組織更容易受到酶的作用，最終破壞肺組織結構[3]。通過支氣管肺泡灌洗液（BALF）采集支氣管及肺泡內(nèi)液的標本，能有效地反映肺內(nèi)病變指標及防御能力的改變情況。前期研究通過應用冷光源內(nèi)窺鏡和電泳點樣吸頭對小鼠進行氣管滴注完成對PM2.5暴露CB17-SCID荷瘤小鼠的研究[4]，綜合分析PM2.5暴露作為誘導因素處理對AMs及機體的影響。本研究擬通過體內(nèi)實驗進一步了解PM2.5暴露影響腫瘤細胞發(fā)展的相關機制，明確PM2.5調(diào)節(jié)肺癌發(fā)展的新方向。

1 材料與方法

1.1 材料實驗動物：20只清潔級雄性CB17-SCID小鼠（體重22～24 g，許可證號：SCXK（京）2012-0001）購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物房內(nèi)，12 h/12 h晝夜光照，溫度為22～24℃，濕度為70%。實驗用CB17-SCID小鼠使用符合動物福利和倫理要求，實驗方案獲學校倫理委員會批準。

主要材料與儀器：本研究PM2.5濃度的設計既考慮了人和動物種屬間的差異（約10倍），也考慮了動物實驗結果外推于人的安全性（約10倍），因此PM2.5暴露濃度相當于國家《環(huán)境空氣質(zhì)量標準》（GB3095-2012）二級日標準的100倍。應用于本研究的PM2.5懸液濃度20 mg/ml，PM2.5樣品為實驗室保存，主要成分及特點分析參考文獻[5]。CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit（美國Promega公司）；BCA protein assay kit（美國Thermo公司）；中性紅染料（美國Amresco公司）；臺盼藍染色液（0.4%，北京索萊寶科技有限公司）；冷光源硬性內(nèi)窺鏡（徐州科能光電設備有限公司）；A549細胞株（實驗室保存）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；RPMI-1640完全培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA消化液（美國Gibco公司）；青霉素-鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Hyclone公司）。96孔細胞培養(yǎng)板、100 mm細胞培養(yǎng)皿、15和50 ml離心管（美國康寧公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 荷瘤小鼠模型制作及分組將A549細胞株置于RPMI-1640完全培養(yǎng)基在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)。RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清，100 U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素。取對數(shù)增長期A549細胞，0.4%臺盼藍染液染色，顯微鏡下進行活細胞計數(shù)，確保細胞活性大于95%，用生理鹽水調(diào)整濃度至2.5×106個/ml，進行小鼠尾靜脈注射。每只小鼠尾靜脈注射A549細胞5×105個。采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為2組，PM2.5暴露組和生理鹽水暴露組，各10只。

1.2.2 氣管滴注處理CB17-SCID荷瘤小鼠模型制作完成6周后進行氣管滴注操作。實驗組氣管滴注PM2.5懸液（20 mg/ml），對照組氣管滴注生理鹽水，均20 μl/次，2次/周，共4周。

1.2.3 BALF收集及AMs分離、培養(yǎng)使用摘眼球法采集小鼠外周血后，將CB17-SCID荷瘤小鼠處死，固定后噴灑適量75%乙醇，在無菌條件下進行支氣管肺泡灌洗術：收集約5 ml肺泡灌洗液，并轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中；（2）4℃條件下以1 000 r/min，離心10 min，收集上清液備用。（3）用PBS緩沖液懸浮細胞后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基懸浮細胞。（4）經(jīng)過培養(yǎng)后，取貼壁生長的AMs進行下一步的實驗研究。

1.2.4 BALF中總蛋白含量檢測采用BCA法檢測BALF中總蛋白水平。將試劑盒的A溶液與B溶液按照50︰1的比例混合，混勻后，加入96孔板，每孔加入200 μl混合液，同時每孔加入PM2.5暴露組或生理鹽水暴露組的BALF待檢樣品20 μl。37℃孵育30 min后，在532 nm波長下檢測吸光度值。標準曲線按照試劑盒說明書完成。

1.2.5 細胞計數(shù)及圖像采集通過血細胞計數(shù)板對收集得到的灌洗細胞進行計數(shù)，同時使用Leica AM6000顯微鏡對接種在培養(yǎng)板中的細胞進行圖像采集。

1.2.6 細胞活力檢測將肺泡灌洗得到的細胞懸液直接加入到96孔板中，每孔100 μl，分別培養(yǎng)24 h和48 h，按照下述方法完成細胞活力檢測。讀取吸光度值前向待檢孔中加入20 μl的CellTiter 96?AQueous One Solution Reagent；置于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。在490 nm波長下檢測吸光度值。

1.2.7 中性紅實驗將肺泡灌洗得到的細胞懸液計數(shù)后，等量加入到96孔板中，培養(yǎng)12 h棄上清。每孔加入0.1%中性紅溶液100 μl，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育；3 h后取出細胞板，棄上清并用生理鹽水洗5遍；每孔加入細胞裂解液（醋酸與無水乙醇等體積混合）50 μl，振蕩10 min后；在520 nm波長下檢測吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學方法采用GraphPad PRISM 5.0 software進行統(tǒng)計學分析。所有實驗至少重復3次。結果比較采用非配對雙側t檢驗及ANOVA，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BALF中總蛋白水平比較BCA檢測結果顯示，PM2.5暴露組收集得到的BALF中總蛋白水平（0.4513± 0.0175）明顯高于生理鹽水暴露組（0.3809±0.0236）（P＜0.01）。

2.2 AMs數(shù)量比較及圖像采集通過血細胞計數(shù)板對BALF中收集得到的細胞進行計數(shù)發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露組細胞總數(shù)為（536 700±24 040）個，高于生理鹽水暴露組的（336 700±23 330）個（P＜0.01）。

通過Leica AM6000顯微鏡對接種培養(yǎng)板中的細胞進行圖像采集發(fā)現(xiàn)，貼壁生長的細胞形態(tài)規(guī)則統(tǒng)一，能夠確定從CB17-SCID荷瘤小鼠BALF中離心收集得到的細胞主要為AMs，見圖1。

圖1 AMs形態(tài)學觀察（×100）

2.3 AMs活力比較細胞活力檢測實驗發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露組收集到得AMs經(jīng)過24 h和48 h的增殖細胞數(shù)檢測證實增殖能力顯著提高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 AMs活力比較

2.4 AMs吞噬功能比較中性紅實驗結果發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露組AMs的吞噬能力（0.2547±0.0083）強于生理鹽水暴露組（0.1860±0.0112）（P＜0.01）。

3 討論

空氣顆粒物與肺實質(zhì)間的作用與顆粒物的特征有關，如顆粒物的表面積、組分和其吞噬作用等。流行病學調(diào)查和實驗研究已經(jīng)證實空氣污染會導致呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生率及肺功能損傷的增加，會增加當?shù)氐娜朐郝什⑶規(guī)碇T多對健康不利的后果，包括哮喘[6]、慢性阻塞性肺疾病[7]、呼吸系統(tǒng)感染[8]、肺癌[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露組能夠刺激AMs活力，包括增殖能力和吞噬功能的增強，同時顯著提高BALF中蛋白表達水平，說明機體啟動應激反應，PM2.5暴露組小鼠氣道阻力增加明顯，同時BALF中的蛋白水平可以直接反映炎癥效應，可以調(diào)節(jié)肺部的炎癥反應[10-11]，而這些機體生理功能的改變都為PM2.5暴露對CB17-SCID荷瘤小鼠AMs的研究產(chǎn)生重要意義，而且相對于體外暴露實驗[12-13]，本研究完成的體內(nèi)實驗更能說明AMs在體內(nèi)受到外界因子刺激后的生理特點。

AMs存在于肺泡和支氣管表面，既是防御外來有害因子的生物屏障，又是清除有害因子的靶細胞。BALF中炎癥細胞計數(shù)是反映氣道炎癥的一個重要指標，本研究發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露組小鼠BALF中AMs增加明顯，說明暴露可致肺局部炎癥細胞的聚集，而氣管滴注顆粒物能導致肺功能降低并產(chǎn)生炎癥反應，為了清除進入機體的PM2.5刺激因子，繼而活化釋放一系列炎癥因子、趨化因子、氧自由基與蛋白酶等，AMs參與一系列病理生理過程[14-15]。中性紅實驗同樣說明PM2.5的刺激作用使得一部分AMs的吞噬能力增強。PM2.5能夠影響AMs的氧化應激性，即能夠使細胞內(nèi)高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基產(chǎn)生過多，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導致組織損傷[16]。AMs活力增強，表達功能性蛋白的能力相應提高，刺激機體產(chǎn)生更為強烈的炎癥反應，為腫瘤轉(zhuǎn)移提供了適宜的微環(huán)境。

研究說明，當人體長時間暴露在PM2.5的環(huán)境下，AMs釋放大量細胞因子，顆粒物可以引發(fā)人類氣道的炎癥反應，從而引起或加重各種呼吸道疾病，嚴重影響呼吸系統(tǒng)功能，最終增加呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生率和死亡率。研究還需進行AMs和腫瘤細胞的共培養(yǎng)方法及PM2.5暴露處理實驗，進一步研究PM2.5對機體產(chǎn)生的影響。對空氣顆粒物的研究不僅可以為某些疾病的預防奠定基礎，并能為更好地闡述受到空氣污染后相關疾病的致病機制，為有可能通過發(fā)現(xiàn)新的分子作用通路，更加明確其細胞途徑和科學的解釋。

（致謝：感謝遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心在實驗動物飼養(yǎng)及實驗過程中給予的幫助。）

［1］AtkinsonRW，MillsIC，WaltonHA，etal.Fineparticlecomponents and health--a systematic review and meta-analysis of epidemio logicaltimeseriesstudiesofdailymortalityandhospital admissions［J］.J Expo Sci Environ Epidemiol，2015，25（2）: 208-214.

［2］Hodge S，Hodge G，Scicchitano R，et al.Alveolar macrophages from subjects with chronic obstructive pulmonary disease aredeficient in their ability to phagocytose apoptotic airway epithelial cell［J］.Immunol Cell Biol，2003，81（4）:289-296.

［3］Reddy AT，Lakshmi SP，Muchu marri RR，et al.Nitrated fatty acids reverse cigarette smoke-induced alveolar macrophage activa tion and inhibit protease activity via electrophilic S-alkylation［J］. PLoS One，2016，11（4）：e0153336.

［4］楊彪，李新鳴，嚴思遠，等.應用冷光源內(nèi)窺鏡和點樣吸頭完成的新型小鼠氣管滴注法［J］.中國藥理學通報，2016，32（4）：585-587.

［5］Ma M，Li S，Jin H，et al.Characteristics and oxidative stress on rats and traffic policemen of ambient fine particulate matter from Shenyang［J］.Sci Total Environ，2015，526：110-115.

［6］Ko FW，Tam W，Wong TW，et al.Effects of air pollution on asthma hospitalization rates in different age groups in Hong Kong［J］.Clin Exp Allergy，2007，37（9）:1312-1319.

［7］Ko FW，Tam W，Wong TW，et al.Temporal relationship between air pollutants and hospital admissions for chronic obstructive pulmonary disease in Hong Kong［J］.Thorax，2007，62（9）：780-785.

［8］Lin M，Stieb DM，Chen Y.Coarse particulate matter and hospitalization for respiratory infections in children younger than 15 years in Toronto:a case-crossover analysis［J］.Pediatrics，2005，116（2）：e235-e240.

［9］Pope CA，Burnett RT，Thun MJ，et al.Lung cancer， cardiopulmonary mortality，and long-term exposure to fine parti culate air pollution［J］.JAMA，2002，287（9）：1132-1141.

［10］周園，王任群，趙肅，等.大氣混合污染物對大鼠細胞因子水平及超微結構的影響［J］.沈陽醫(yī)學院學報，2009，11（1）：6-8，12.

［11］肖純凌，王任群，趙肅，等.大氣污染物對大鼠肺炎性細胞因子影響［J］.中國公共衛(wèi)生，2007，23（1）：83-84.

［12］張方，李子玲，施毅，等.LPS致大鼠肺泡巨噬細胞NF-KB促進TNF-α分泌［J］.中國病理生理雜志，2007，23（7）: 1412-1414.

［13］劉煥星，姜智，賈玉珍.脂多糖對衰老大鼠肺泡巨噬細胞凋亡的影響［J］.泰山醫(yī)學院學報，2007，28（2）：99-100.

［14］曹君，陳平，楊悅，等.煙霧暴露所致肺氣腫小鼠模型的建立與評價［J］.中國實驗動物學報，2010，18（4）：278-282.

［15］Mazzoli-Rocha F，F(xiàn)ernandes S，Einicker-Lamas M，et al. Roles of oxidative stress in signaling and inflammation induced by particulate matter［J］.Cell Biol Toxicol，2010，26（5）：481-498.

［16］熊琪，茹琴，陳琳，等.PM2.5對肺泡巨噬細胞功能影響的研究進展［J］.環(huán)境與健康雜志，2013，30（12）：1128-1131.

Effects of PM2.5Exposure on Viability of Alveolar Macrophages of Tumor-bearing CB17-SCID Mice

YANG Biao1，GUO Jie2，XIAO Chunling2*
（1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；2.Shenyang Medical College，Key Lab of Environmental Pollution and Microecology of Liaoning Province）

Objective：To investigate the effects of PM2.5exposure on viability of alveolar macrophages（AMs）of tumor-bearing CB17-SCID mice.Methods:The models of tumor-bearing CB17-SCID mice were made.The cold light source endoscope and micro pipette tips completed the PM2.5exposure and normal saline（NS）exposure.The levels of protein in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were determined by BCA assay.The proliferation of AMs was determined by viability assay.The phagocytosis ability of AMs was detected by neutral red assay.Results:Comparing NS exposure，PM2.5exposure could increase the levels of total protein in BALF，enhance the viability and phagocytosis of AMs（P＜0.01）.Conclusion：To adapt to the environment change（PM2.5exposure），AMs enhance the ability of removing PM2.5，and stimulate the secretion of proteins by respiratory system in tumorbearing CB17-SCID mice.

PM2.5；bronchoalveolar lavage fluid；alveolar macrophage；viability assay；neutral red assay；tumor-bearing CB17-SCID mice

R994.6

A

1008-2344（2017）02-0087-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.02.005

2016-12-01

（文敏編輯）

沈陽市環(huán)境污染與重點實驗室建設（No.F14-181-1-00）

楊彪（1984—），男（漢），2014級博士研究生，研究方向：環(huán)境污染物對呼吸系統(tǒng)影響研究.

肖純凌（1964—），女（漢），教授，博士生導師，研究方向：大氣污染對呼吸道的影響機制及微生態(tài)研究.E-mail: xiaochunling@symc.edu.cn