高中南，余磊磊，周京龍，周燚 (長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

白芨種子共生及非共生萌發(fā)的研究進展

高中南，余磊磊，周京龍，周燚 (長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

綜述了白芨(Bletillastriata)種子共生萌發(fā)的過程與機制、種子的采集與保存、種子的消毒與預(yù)處理、非共生萌發(fā)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及組培苗移栽技術(shù)等的研究進展，并對白芨種子萌發(fā)研究及白芨工業(yè)化生產(chǎn)進行了展望。

白芨(Bletillastriata)；共生萌發(fā)；非共生萌發(fā)

白芨(Bletillastriata)別名朱蘭，為蘭科(Orchidaceae)地生型多年生草本球莖植物?；ㄆ谥饕诖杭荆哂泻芨叩乃幱眉皥@林價值。主要用于收斂止血、消腫生肌，是我國民間傳統(tǒng)的珍貴中藥材之一[1]，市場需求量很大。近些年來，在我國白芨被過度采挖，且生長環(huán)境被嚴(yán)重破壞，野生白芨資源急聚下降，瀕臨滅絕，白芨已被我國列為重點保護生物類群。分株繁殖是白芨栽培常用的方法[2]，但分株繁殖周期長，效率低，繁殖力有限，滿足不了產(chǎn)業(yè)化栽培的需要。白芨亦可采用直播繁殖，但其種子細(xì)小如粉且無胚乳，一個果莢常含上萬粒種子，數(shù)量極多，野生條件下很難萌發(fā)，且萌發(fā)過程中通常需要共生真菌為其提供營養(yǎng)，種子萌發(fā)率非常低[3]。要滿足大量栽培的需要，種子萌發(fā)是關(guān)鍵所在。筆者對近年來白芨種子萌發(fā)相關(guān)研究進展進行綜述，以為加快白芨產(chǎn)業(yè)化步伐提供參考。

1 共生萌發(fā)的研究

共生萌發(fā)是指在共生菌侵染下種子萌發(fā)的過程。白芨種子細(xì)小如粉且無胚乳和子葉，其胚無法為種子萌發(fā)過程提供足夠養(yǎng)分，且種子必須從外界獲取萌發(fā)所需的營養(yǎng)元素和生長因子[4]。

1.1 真菌對白芨種子萌發(fā)的促進作用

19世紀(jì)人們證實了蘭科植物中存在著共生菌，并證實共生菌能促進蘭科種子萌發(fā)。同時表明，在野生環(huán)境下，白芨種子只有被其共生真菌侵染才能萌發(fā)。1992年郭順星等[5]研究白芨共生萌發(fā)特性，發(fā)現(xiàn)白芨在常規(guī)環(huán)境下能順利發(fā)芽，為蘭科植物中易萌發(fā)的種子類型。種子與真菌拌種播種，可明顯加快種子萌發(fā)過程中原球莖子葉分化及假根形成。真菌培養(yǎng)后的提取液能促進白芨萌發(fā)和生長，表明該菌代謝產(chǎn)物可能含有促進白芨生長的活性養(yǎng)料。真菌拌種和提取液播種效果相似。

1.2 染菌萌發(fā)過程中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

1990年徐錦堂等[6]研究了白芨共生萌發(fā)細(xì)胞中微小結(jié)構(gòu)的生長過程。該研究表明，白芨為蘭科植物中易萌發(fā)種類。胚的大型薄壁細(xì)胞中富含淀粉及脂類等貯藏物質(zhì)，是種子在常規(guī)條件下萌發(fā)的主要營養(yǎng)來源。種子與真菌拌種播種，被合適的真菌侵染，發(fā)芽勢會升高，能明顯促進原球莖的分化。觀察萌發(fā)過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，真菌首先穿過種皮細(xì)胞到達種胚，從胚柄處進入胚細(xì)胞，然后散布在胚柄端的幾層胚細(xì)胞中。胚細(xì)胞被真菌侵入后，細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)漸漸變沒，質(zhì)膜內(nèi)陷生成的囊狀體包裹并吸收菌絲中的養(yǎng)分。菌絲經(jīng)過白芨細(xì)胞壁過程中，尖端多半會膨漲變大，依賴其與細(xì)胞質(zhì)作用生成的壓力在白芨細(xì)胞中穿行。此外少量菌絲的細(xì)胞壁會在侵染后顯著變厚，用于加厚的營養(yǎng)元素來源于白芨種胚細(xì)胞質(zhì)，這些加厚的菌絲最后會被全部消解，為白芨種子萌發(fā)和生長提供養(yǎng)分。真菌即將侵入但還未侵入的白芨細(xì)胞顯示出很旺盛的代謝活力。

白芨種子染菌萌發(fā)中，種子對不同真菌侵入后的反應(yīng)并非完全一致，適宜的真菌在胚的一定范圍細(xì)胞中存在，形成彼此營養(yǎng)平衡的共生關(guān)系，有利于種子萌發(fā)及其后的生長。有些真菌或植物致病菌可使整個白芨種胚充滿菌絲，導(dǎo)致種子死亡。

1.3 真菌促進白芨種子萌發(fā)的機制

在白芨種子萌發(fā)的過程中，白芨種胚中養(yǎng)分往往不夠，侵入的真菌可為它提供養(yǎng)分和生長因子等。入侵的真菌不僅能為種子萌發(fā)提供所需的營養(yǎng)，而且共生真菌能產(chǎn)生抑制其他微生物生長的活性物質(zhì)，可大大減少種子被雜菌污染的幾率，進而為白芨種子萌發(fā)及生長提供良好的環(huán)境條件[7～9]。

2 非共生萌發(fā)的研究

白芨非共生萌發(fā)是指利用組織培養(yǎng)技術(shù)，在人工培養(yǎng)基上不外加真菌侵染使白芨種子萌發(fā)。非共生萌發(fā)能在短時間內(nèi)得到大批白芨幼苗，是目前成本低、既快速又有效的繁殖方法之一[10～13]。白芨在自然環(huán)境或人工培養(yǎng)條件下生長速度都非常慢，繁殖系數(shù)也很低。利用組織培養(yǎng)技術(shù)促進白芨種子的大量萌發(fā)，可以解決分株繁殖系數(shù)低、成本高的弊端，并且能在短期內(nèi)得到大批生長健全的小苗，是一種經(jīng)濟高效的繁殖方式。

2.1 白芨種子的采集與保存

白芨種胚的成熟度決定著非共生萌發(fā)的萌發(fā)率，種胚的年齡到20 周時開始采收最好，這時種子含胚的幾率最大，萌發(fā)率接近100%，萌發(fā)所需的時間為1 周[14]。最好在白芨種子成熟后但蒴果還未開裂之前進行采集[15]。

溫度和種子含水量是影響種子壽命的主要因素。白芨種子在5℃條件下保存為宜。新鮮白芨種子在5℃下儲藏最為合適，該溫度下存放60d后，種子才開始緩慢減少萌發(fā)率，即使150d后種子的萌發(fā)率仍接近50%。在5℃和-18℃條件下儲存干燥種子，3個月內(nèi)種子萌發(fā)率幾乎一樣，儲存在-18℃的種子的萌發(fā)率稍高一點，表明冷凍對干燥的種子的萌發(fā)率基本無影響[16]。

2.2 白芨種子的消毒與預(yù)處理

未開裂的白芨蒴果常用的消毒方法如下：先使用70%酒精消毒30s，再用0.1%升汞進行消毒15min，或根據(jù)實際試驗的情況確定消毒時間。也可用2.5%次氯酸鈉溶液代替升汞進行消毒。消毒完后再用無菌水沖洗3遍，并用無菌濾紙把水吸干[17]。然后在無菌條件下切開果莢，取出種子，將種子均勻接種到已滅菌的培養(yǎng)基上，實驗所用的刀和鑷子等都需要經(jīng)過消毒處理。陳超等[18]研究發(fā)現(xiàn)，接種到培養(yǎng)基中的種子數(shù)量越多，種子萌發(fā)會越迅速，這體現(xiàn)出群體效應(yīng)。但不宜過密，過密則會得到負(fù)面效果。

開裂的白芨蒴果宜用次氯酸鈉代替升汞消毒。因為次氯酸鈉對細(xì)小白芨種子傷害更小，且消毒效果也好。

2.3 非共生萌發(fā)的培養(yǎng)基

根據(jù)前人的研究，現(xiàn)收集整理部分白芨非共生萌發(fā)及生根壯苗培養(yǎng)基配方(表1)。目前比較常用的培養(yǎng)基有MS、改進的MS、KC、N6和RE等。這些培養(yǎng)基一般還加入2%～3%的蔗糖、0.8%左右的瓊脂固化，pH還不確定，大多研究認(rèn)為5.8～6.5較合適。培養(yǎng)基中一般還加入一定濃度的NAA，能提高種子萌發(fā)率和萌發(fā)速度；關(guān)于其中加入6-BA的作用，還存在一定的爭議。目前，關(guān)于白芨種子萌發(fā)最適培養(yǎng)基配方也沒有一致的結(jié)論。多數(shù)研究在培養(yǎng)基中加入了不同的添加劑，常用的添加劑有椰子汁、香蕉汁、菠蘿汁、土豆汁等[19]，它們是一類成分復(fù)雜的天然復(fù)合物，可有效促進種子萌發(fā)。一般培養(yǎng)基中還會加入一定量活性碳。一般認(rèn)為，活性炭能提供暗環(huán)境，促進不定根的誘導(dǎo)；還能吸附培養(yǎng)基中酚類等有毒有害物質(zhì)，有效地防止褐變；也能吸附培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)物[20,21]。

表1 白芨種子非共生萌發(fā)培養(yǎng)基配方

2.4 培養(yǎng)條件

蘭科植物種子萌發(fā)通常采用暗培養(yǎng)或光照強度為1200～2000lx的環(huán)境中培養(yǎng)[29,30]。但李雨晴等[31]通過研究發(fā)現(xiàn)，黑暗下培養(yǎng)會降低白芨種子的發(fā)芽率。培養(yǎng)的溫度通常為25℃左右。光照時間通常為12h左右。

2.5 組培苗的移栽

種子萌發(fā)后，待幼苗長至2cm左右時，將幼苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，待幼苗長至3～5cm時，打開培養(yǎng)瓶瓶蓋放在室內(nèi)自然光下煉苗3d左右[32]，然后取出幼苗，將根部附著的培養(yǎng)基清洗干凈，再移栽至育苗基質(zhì)中，基質(zhì)為腐質(zhì)土與蛭石按一定比例混合配制，使用前要先消毒。移栽后適度遮陰，并保持一定的濕潤。

3 問題與展望

白芨具有很高的藥用價值和經(jīng)濟價值，雖其種子屬于蘭科中易萌發(fā)的類型，但白芨的工業(yè)化生產(chǎn)問題仍未解決。

白芨種子共生萌發(fā)雖然行之有效，但白芨體內(nèi)分離的真菌不一定是其種子萌發(fā)的共生菌，且共生菌的篩選需要很長時間，共生萌發(fā)也較緩慢。不過一旦篩選出效果較好的共生菌，就可進行大規(guī)模育苗。通過共生萌發(fā)形成的幼苗，成活率也更高?，F(xiàn)階段有關(guān)白芨共生菌的研究文獻還不夠多，也沒有效果非常好的共生菌被篩選出來。因此，亟需研究人員篩選出效果較好的種子萌發(fā)共生菌。

現(xiàn)階段研究得較多的是白芨的非共生萌發(fā)，非共生萌發(fā)操作簡便，可在短時期內(nèi)生產(chǎn)出很多白芨幼苗，但非共生萌發(fā)的幼苗移栽的成活率相對較低，且白芨蒴果即使在5℃條件下存放一段時間后也會開裂，開裂后種子的消毒不易把握，消毒過長種子易死；消毒不完全，培養(yǎng)基和種子易被雜菌污染，污染不僅會浪費種子，還會降低白芨幼苗產(chǎn)量。李慧敏等[33]研究發(fā)現(xiàn)，含有假鱗莖的白芨組培苗存活率非常高，認(rèn)為假鱗莖的誘導(dǎo)形成是提高組培苗存活的關(guān)鍵。此外，非共生萌發(fā)的最適培養(yǎng)基也沒有統(tǒng)一的配方。如何改進培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件進一步提高萌發(fā)率、改進消毒方法減少污染率、改進移栽技術(shù)提高幼苗成活率仍需進一步研究。

2種萌發(fā)方法都有不足之處，基于此，有研究者提出了原地共生萌發(fā)法。白芨原地共生萌發(fā)法是指將白芨種子裝在特殊的袋子中，然后埋到白芨原來的野生生長環(huán)境中，一段時間后察看白芨種子萌發(fā)與否，并檢測細(xì)胞是否被真菌侵入[34]。該技術(shù)在國外已被用于蘭科植物種群保育，維持蘭科植物種群發(fā)展，但國內(nèi)還未廣泛運用。

[1]曹春林.中藥鑒定學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1986:139.

[2]盧思聰.中國蘭與洋蘭[M].北京:金盾出版社,1998.

[3]董芳.幾種蘭科植物菌根真菌的篩選及種子萌發(fā)條件的研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2008.

[4]何煒,楊曉紅,戴木蘭,等.蘭科菌根共生效應(yīng)研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(17): 7206～7207,7226.

[5]郭順星,徐錦堂.白芨種子萌發(fā)和幼苗生長與紫萁小菇等4種真菌的關(guān)系[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報,1992,14(1):51～54,79～80.

[6]Guo Shun-xing,Xu Jin-tang.Studies on the changes of cell ultrastructure in the course of seed germination ofBletillastriataunder fungus infection conditions[J].Journal of Integrative Plant Biology,1990,32(8):594～598,661～ 662.

[7]戍國標(biāo),王祖濤,楊柳,等.適應(yīng)于營養(yǎng)積累和防止真菌侵染的白芨塊莖結(jié)構(gòu)[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,(8):121～125.

[8]吳靜萍,錢吉,鄭師章.蘭花菌根菌分泌物成分的初步分析[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2002,13(7):845～848.

[9]陳瑞蕊,林先貴,施亞琴.蘭科菌根的研究進展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2003, 9(1):97～101.

[10]楊俊慧,孟慶軍,李建東,等.利用組織培養(yǎng)法繁殖白芨[J].山東科學(xué),2002,15(1):13～16.

[11]余朝秀,李枝林,王玉英.野生白芨組培快繁技術(shù)研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2005,27(5):36～39.

[12]付志惠,張建霞,李洪林,等.白及種子萌發(fā)與快速繁殖技術(shù)的研究[J].武漢植物學(xué)研究, 2006,24(1):80～82.

[13]石云平,李鋒,凌征柱.白芨組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,40 (11):1408～1410.

[14]張建霞,付志惠,李洪林,等.白芨胚發(fā)育與種子萌發(fā)的關(guān)系[J].亞熱帶植物科學(xué),2005, 34(4):32～35.

[15]袁寧,何俊蓉,何銳,等.白芨組培快繁育苗技術(shù)研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2009,22(3): 781～785.

[16]趙仁全,羅光瓊,張秀月,等.貯藏溫度對白芨種子壽命的影響[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2007, 35(4):104～105.

[17]田英翠,袁雄強.白芨組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,(4):75～77.

[18]陳超,王桂蘭,喬永旭,等.蝴蝶蘭無菌播種方法的比較研究[J].北方園藝,2006,(1): 35～36.

[19]趙漫麗,黃春球,李明靜,等.添加劑對白芨組培的影響[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,26(6):821～827.

[20]劉根林,梁珍海,朱軍.活性炭在植物組織培養(yǎng)中的作用概述[J].江蘇林業(yè)科技,2001, 28(5):46～48.

[21]Weatherhead M A,Burdon J,Henshaw G G.Some effects of activated charcoal as an additive to plant tissue culture media[J].Zeitschrift Für Pflanzen-physiologie,1978,89:141～147.

[22]葉靜,鄭曉君,管常東,等.白芨的無菌萌發(fā)與組織培養(yǎng)[J].云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2010,32(S1):422～425.

[23]余磊磊,周京龍,高中南,等.野生白芨再生體系的建立及抗性篩選[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017,45(1):43～46.

[24]王楷,李玥,張云峰,等.白芨種子的高效萌發(fā)及其無性繁殖體系的構(gòu)建[J].云南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2014,34(4):71～78.

[25]石云平,趙志國,唐鳳鸞,等.白芨愈傷組織誘導(dǎo)、增殖與分化研究[J].中草藥,2013, 44(3):349～353.

[26]張燕,黎斌,李汝娟,等.白芨種子的無菌萌發(fā)過程觀察和組培快繁研究[J].北方園藝, 2013,(3):158～160.

[27]魯光耀,楊仙,蔣瑞彬,等.白芨組培快速繁殖體系研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2015,39(5):383～390.

[28]張燕,黎斌,李思鋒.不同培養(yǎng)基上白芨的種子萌發(fā)與幼苗形態(tài)發(fā)生[J].西北植物學(xué)報, 2009,29(8):1584～1589.

[29]黃磊,賀筱蓉,鄭立明,等.春蘭種子非共生萌發(fā)的研究[J].種子,2003,(6):41～42.

[30]曾宋君,陳之林,段俊.帶葉兜蘭的無菌播種和離體快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊, 2006,42(2):247.

[31]李雨晴,楊嘉偉,王康才,等.白芨種子無菌萌發(fā)特性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(4): 253～255.

[32]汪計珠,丁家宜,邊可庚.白及的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊,1982,(2):37.

[33]李慧敏,楊冠海,李明靜,等.白芨瓶內(nèi)假鱗莖誘導(dǎo)研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2013,44(10): 1607～1612.

[34]柯海麗,宋希強,譚志瓊,等.蘭科植物種子原地共生萌發(fā)技術(shù)及其應(yīng)用前景[J].林業(yè)科學(xué),2007,43(5):125～129.

[編輯] 余文斌

2017-02-26

湖北省農(nóng)業(yè)創(chuàng)新基地項目(2010CBB03801)；湖北省科技廳重點基金項目(2015000384)。

高中南(1991-)，男，碩士生，研究方向為植物病害與生物防治。通信作者：周燚，zhouyi@yangtzeu.edu.cn。

Q949.71+8.43

A

1673-1409(2017)14-0058-04

[引著格式]高中南，余磊磊，周京龍，等.白芨種子共生及非共生萌發(fā)的研究進展[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版) ，2017，14(14)：58～61.