龔強，王國榮

李博，徐延浩 主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心(長江大學)，湖北 荊州 434025；

長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025

大麥皮殼率快速測定方法研究

龔強，王國榮

李博，徐延浩 主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心(長江大學)，湖北 荊州 434025；

長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025

大麥皮殼率測定主要有氨水浸泡法和千粒重量法，但均不適合進行快速、高通量樣品分析。纖維素是大麥皮殼的主要化學成分。采用新型纖維素溶解體系，探討了快速、穩(wěn)定和高通量測定大麥皮殼率的方法。結(jié)果表明，NaOH溶液、NaClO溶液、NaOH/尿素體系都能用于測定大麥皮殼率，但堿性次氯酸鈉法效率更高。通過比較NaOH濃度、NaClO濃度以及處理時間對大麥皮殼率測定的影響，得出4%NaOH配合20%的NaClO溶液，經(jīng)過2min的短沸是一個比較快速穩(wěn)定的方案。比較堿性次氯酸鈉法與氨水浸泡法、千粒重量法、NaOH/尿素法的準確性與重復性，發(fā)現(xiàn)堿性次氯酸鈉法準確度高、重復性好、效率高，最適合作為快速、穩(wěn)定、大批量測定大麥皮殼率的方法。

大麥；皮殼率；堿性次氯酸鈉法；纖維素溶解體系

大麥皮殼率是指皮大麥籽粒的皮殼重占籽?？傊亓康谋壤４篼湹钠ぢ首兓艽?，占粒重的10%～20%左右。釀造啤酒用大麥要求皮重不高于8%～9%[1]。皮殼率高，不僅降低粒重影響產(chǎn)量，在麥熟過程中遇陰雨易感染赤霉病,而且降低籽粒品質(zhì)與發(fā)芽勢和發(fā)芽率[2]。皮殼中含有硅酸、花色苷、單寧和苦味物質(zhì),部分可溶性物質(zhì)在糖化時溶解在麥芽汁中,氧化而成褐色,損害啤酒的色澤和風味，厚殼大麥制造的啤酒色澤深,風味不純,并且容易混濁[3]。前人對大麥皮殼的遺傳及其與其他農(nóng)藝性狀之間的相關(guān)性已有較多研究[1,4～7]，但關(guān)于皮殼率的分子遺傳機制還未見報道。

大麥皮殼率測定方法主要有氨水浸泡法(簡稱SAA法)和千粒重量法。SAA法不傷種子內(nèi)核，用種量少，但需要手工剝殼，費時、費工且難以完全去除種皮；千粒重量法使用的50%硫酸溶液消解種殼，去殼完全，但腐蝕性強，易導致皮殼率偏高，降低測定結(jié)果的準確性。這2種方法對大群體的皮殼率進行分析不適用，限制了皮殼率遺傳QTL定位等工作的開展，需要開發(fā)一種快速、穩(wěn)定且能大批量測定大麥皮殼率的方法。

大麥皮殼的化學組成主要為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，還有少量的無機鹽和花色苷、單寧等多酚物質(zhì)[8]。由此可知，大麥皮殼率測定主要涉及種皮和果皮中纖維素分子的溶解問題。近年來，新型的纖維素溶解體系不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)的磷酸溶解法得到改進，并發(fā)展出低溫NaOH(LiOH)/尿素體系[9]。應用新型的纖維素溶解體系去探索建立大麥皮殼率測定的方法是一個值得嘗試的領(lǐng)域。

隨著大麥分子遺傳育種水平的提高，通過千粒重來負向篩選低皮殼率的方法已不能滿足現(xiàn)代大麥育種的需求，迫切需要建立快速、穩(wěn)定和高通量的皮殼率測定方法，對皮殼率的分子遺傳機制進行解析，開發(fā)皮殼率相關(guān)的分子輔助選擇育種標記。本研究探討了堿性次氯酸鈉和NaOH尿素體系測定大麥皮殼率的方法，綜合比較氨水浸泡法、千粒重量法、堿性次氯酸鈉法和NaOH尿素法測定皮殼率的準確度和精確度，提出了一種快速、穩(wěn)定和高通量的皮殼率測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為大麥鄂啤2號，2015年5月收獲后晾曬、除雜后置實驗室保存待用。

1.2 實驗方法

分別采用氨水浸泡法、千粒重法、堿性次氯酸鈉法、NaOH尿素溶解法對大麥皮殼率進行測定，比較不同方法對大麥皮殼率測定結(jié)果的影響。對氨水浸泡法，比較不同濃度氨水和不同處理時間下皮殼率測定結(jié)果的差異；對堿性次氯酸鈉法，比較不同處理時間、不同NaClO濃度、不同NaOH用量下皮殼率測定結(jié)果的差異，探索最優(yōu)的皮殼率測定方案。

1)氨水浸泡法。參照文獻[8]介紹的方法，取100粒種子置于80℃水浴條件下浸泡，設置3個時間梯度(40、60、80min)和4個氨水濃度梯度(5%、8%、12%、15%)，比較手工去殼的難易程度及皮殼率的差異。

2)千粒重法。按標準程序[8]，取15g左右麥粒于室溫下在50%硫酸溶液中浸漬5h，并攪動，最后用水充分洗滌直至所有麥皮脫離，通過去皮前后的大麥千粒重量計算出皮殼率。

3)堿性次氯酸鈉法。將15g左右大麥種子置于NaOH和NaClO混合液中，慢慢加熱沸騰，攪拌直至皮殼完全去除，置于水中充分清洗，從而去殼。設置時間(2～6min)、NaClO濃度(10%、20%、30%、40%)、NaOH(2、3、4g)3個因素的梯度試驗，探索最優(yōu)的堿性次氯酸鈉處理方案。

4)NaOH/尿素溶解法。參照呂昂等[10]溶解天然纖維素的方法并略作修改。將15g左右種子置于7%氫氧化鈉和12%尿素水溶液中，在-10℃左右震蕩處理5h，再用50℃左右溫水充分沖洗，測定其皮殼率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，Duncan檢驗進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨水法測定條件對大麥皮殼率測定結(jié)果的影響

實驗結(jié)果表明，適當增加處理時間，基本不影響皮殼率測定結(jié)果；氨水濃度增加對皮殼率測定結(jié)果的影響也不大(表1)。方差分析結(jié)果(表2)表明不同處理時間和氨水濃度對皮殼率的影響均未達到顯著水平(α=0.05)。氨水浸泡使大麥種殼松動，但還必須加以手工去殼才能測定皮殼率，這是氨水法效率不高的關(guān)鍵點所在。盡管氨水濃度對皮殼率測定沒有影響，但實踐中發(fā)現(xiàn)，15%的氨水處理與5%的氨水處理相比，皮殼松動效果顯著提高，極大提高了手工去殼的速度，從而提高了氨水法的效率。

表1 不同氨水濃度和時間處理下測定的大麥皮殼率%

表2 不同氨水濃度和時間處理下大麥皮殼率的方差分析

注：顯著水平α=0.05；NS表示無顯著性差異。

2.2 堿性次氯酸鈉法測定條件對大麥皮殼率測定結(jié)果的影響2.2.1 NaOH、NaClO及其混合液對大麥皮殼率測定結(jié)果的影響

NaOH和NaClO溶液加熱沸騰處理都能去掉大麥的皮殼，NaOH溶液會使皮殼脫落，而NaClO溶液會使皮殼分解為絮狀物，逐漸溶解。20%NaClO和2%NaOH的時間(1～6min)梯度試驗表明，樣品皮殼率的測定結(jié)果隨著處理時間的增加而增加，1～4min皮殼率增加較快，之后皮殼率的增加較慢，但總的皮殼率水平高于氨水法(圖1)。20%NaClO處理，皮殼只是部分溶解，皮殼比較厚的腹溝處去殼效果較差(圖1a)；2%NaOH處理測定的皮殼率較20%NaClO高，去殼效果較好，但腹溝處仍有部分殘留(圖1b)。

圖1 NaClO、NaOH及其組合沸騰4min溶解大麥皮殼的去殼效果

次氯酸鈉在堿性條件下穩(wěn)定性最好,能充分發(fā)揮其對蛋白質(zhì)纖維的氧化降解作用[11]。因此，設計2%NaOH和20%、30%、40%NaClO配合測定的時間(1～6min)梯度試驗。結(jié)果表明，NaOH和NaClO配合使用，提高了對大麥皮殼溶解的速度，樣品的皮殼率在3～4min內(nèi)趨于恒定，隨后迅速上升，且高于正常的皮殼率水平(圖2)。堿性次氯酸鈉溶液去殼效果要優(yōu)于單獨使用NaOH或NaClO(圖1c)。

圖2 20%NaClO、2%NaOH和不同濃度NaClO配合2%NaOH處理測定的皮殼率

2.2.2 堿性次氯酸鈉法測定大麥皮殼率的條件優(yōu)化

圖3 NaClO、NaOH和沸騰時間3因素組合處理對大麥皮殼率測定結(jié)果的影響

從圖2可以看出，隨著濃度的提高和時間的延長，皮殼率總體呈現(xiàn)先升高，后趨于穩(wěn)定，最后又略微升高的趨勢。同時觀察發(fā)現(xiàn)大麥的去殼效果也越來越好，但高濃度和長時間的處理會導致大麥胚嚴重受損、脫落，降低實驗結(jié)果的準確性。為了進一步探討NaOH濃度、NaClO濃度和處理時間對大麥皮殼率測定結(jié)果的影響，從中選擇去殼效果好且經(jīng)濟高效的處理，設置了NaOH濃度(2%、3%、4%)、NaClO濃度(10%、20%、30%、40%)和沸騰時間(2、3、4、5、6min)3變量的60個組合進行處理，每個處理3次重復，試驗數(shù)據(jù)通過直方圖統(tǒng)計(圖3)。結(jié)果表明，不同的組合處理下，鄂啤2號的皮殼率分布在9.87%～16.75%的范圍內(nèi)，皮殼率主要集中在11.38%～14.39%的范圍內(nèi)，概率為80%。值得注意的是，皮殼率低于11.38%的樣本存在部分皮殼殘留，皮殼率高于14.39%的樣品存在明顯的籽粒糊粉層甚至是胚的受損。統(tǒng)計分析表明，10%～30%次氯酸鈉顯著影響皮殼率測定結(jié)果，而40%次氯酸溶液對皮殼率測定結(jié)果沒有顯著影響；NaOH濃度的變化對皮殼率測定結(jié)果的影響達到極顯著差異；2min處理對皮殼率測定結(jié)果沒有顯著影響，其他時間處理則對皮殼率測定結(jié)果的影響達到極顯著水平。

從上述試驗組合中選擇了20%NaClO+4%NaOH沸騰處理2min等6個去殼效果較好的皮殼率測定方案進行分析(表3)。結(jié)果表明，處理5和處理6與處理1和處理2的皮殼率相比較高，達到顯著水平，但6種處理的去殼效果差別不大，都能輕松完全地去除皮殼。綜合處理時間和相對標準偏差值(RSD)，得出4%NaOH配合20%的NaClO溶液，經(jīng)過2min的短沸，可以作為堿性次氯酸鈉法快速測定大麥皮殼率的一個通用方案。

表3 6種不同實驗處理測定的皮殼率

注：min即沸騰處理時間。

2.3 NaOH尿素處理對大麥皮殼率測定結(jié)果的影響

使用NaOH尿素低溫體系處理后，大麥的皮殼并不能完全自行脫落，必須使用50℃左右溫水充分沖洗，皮殼才能輕松脫落。實驗結(jié)果表明NaOH/尿素體系測定的皮殼率為(14.90±0.55)%。與氨水法和堿性次氯酸鈉法相比，NaOH/尿素法得到的皮殼率偏高，觀察發(fā)現(xiàn)處理后大麥的胚會受到損傷且部分溶解，這可能是測定的皮殼率較高的原因。縮短處理的時間，發(fā)現(xiàn)其脫殼效果較差，皮殼不能完全從籽粒上脫離。

2.4 氨水浸泡法、千粒重法、NaOH/尿素溶解法、堿性次氯酸鈉法處理測定皮殼率的差異

分別用千粒重法、氨水法、堿性次氯酸鈉法和NaOH/尿素溶解法對大麥皮殼率進行測定，結(jié)果表明，這4種方法測定的皮殼率大小表現(xiàn)為：NaOH/尿素溶解法>千粒重法>堿性次氯酸鈉法>氨水浸泡法，而相對標準偏差值最大的為氨水浸泡法，最小的為千粒重法，其次為堿性次氯酸鈉法。綜合比較來看，次氯酸鈉法最適合作為一種快速、穩(wěn)定、能大批量測定大麥皮殼率的方法。

表4 千粒重法、氨水法、NaOH/尿素溶解法和堿性次氯酸鈉皮殼率結(jié)果結(jié)果比較

3 討論

千粒重法測定的皮殼率偏高，這可能是因為50%的硫酸溶液腐蝕性強，能同時溶解纖維素和木質(zhì)素，長時間的處理在去除皮殼的同時會損失糊粉層和部分大麥仁。NaOH/尿素溶解法在去殼的同時對胚有損傷，這可能是測定的皮殼率偏高的原因。其次，NaOH/尿素溶解法需要在低溫長時間處理，對設備要求高，耗時長，不適合大批量皮殼率的測定。堿性次氯酸鈉法主要溶解纖維素，處理時間短，對大麥仁的損傷小，經(jīng)過處理后大麥仍然是堅硬完整的，只要控制好時間，不同批次之間測定值比較穩(wěn)定。氨水法處理過程會產(chǎn)生刺鼻氣味，處理后種子表面仍有一層內(nèi)種皮，而且腹溝的種皮不容易剝除，皮殼會有所損失，加上需要人為去殼，皮殼率精確度差，導致相對標準偏差值偏大，皮殼率也偏低。結(jié)果準確性不如千粒重法、NaClO堿液法。相對于千粒重法，堿性次氯酸鈉法更適合作為大批量處理的方法。

大麥皮殼率測定主要涉及大麥皮殼的溶解問題，皮殼經(jīng)氨水處理會增大皮殼的表面積和孔隙度，會部分溶解木質(zhì)素，表面堅硬性質(zhì)發(fā)生改變，從而可以脫殼[12]；纖維素在堿液中會生成堿性纖維素而溶解[13]。NaClO溶液中游離的Cl-與纖維素的OH-基中的H原子和O原子發(fā)生作用，分子間氫鍵斷裂，纖維素溶解。低溫下氫氧化鈉水合物與纖維素上羥基通過氫鍵驅(qū)動自組裝形成包合物，從而破壞纖維素原有的分子內(nèi)和分子間氫鍵，最終溶解纖維素[10]?？梢姡w維素溶解化學的發(fā)展是推動大麥皮殼率測定方法改進的基礎(chǔ)。

大麥皮殼作為大麥粒重的重要組成成分，占粒重的10～20%，皮殼富含纖維素、木質(zhì)素和很多微量礦物元素。Tae Hyun等[12]研究表明大麥皮殼的70%左右是可利用的糖類，可以發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇；Bledzki[14]將大麥皮殼融入聚丙烯材料中，形成的復合材料比軟木復合材料抗拉強度提高了10%，其他性能也有所提升。本研究還發(fā)現(xiàn)，2%的NaOH將皮大麥煮沸2min左右就能脫下大部分的皮殼而皮殼溶解較少，從而盡可能多地保留大麥皮殼，使其能在后續(xù)加工中得到充分利用。隨著生物能源利用和高分子材料的興起，大麥及其皮殼的應用將更加廣泛，未來若能開發(fā)出控制皮殼基因的分子標記來輔助選擇育種，將會推動大麥的飼用、啤用、食用、工業(yè)應用方向的專向育種，培育出皮殼率含量符合需要的品種。

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[編輯] 余文斌

2017-03-29

國家自然科學基金項目(31201212)；教育部高等學校博士學科點專項科研基金課題(20114220120003)。

龔強(1995-)，男，碩士生，研究方向為植物分子育種。通信作者：徐延浩，xyh09@yangtzeu.edu.cn。

S512.3

A

1673-1409(2017)14-0047-05

[引著格式]龔強，王國榮，李博，等.大麥皮殼率快速測定方法研究[J].長江大學學報(自科版) ，2017，14(14)：47～51.