廖啟元，王曉閣，劉東平，劉麗敏，經(jīng)嘉

（安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校，安徽蕪湖241000）

響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取貓爪草多糖的工藝研究

廖啟元，王曉閣，劉東平，劉麗敏，經(jīng)嘉

（安徽中醫(yī)藥高等專科學校，安徽蕪湖241000）

利用響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取貓爪草多糖的工藝，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以貓爪草多糖得率為考察指標，釆用三因素三水平響應(yīng)面法對酶用量、pH、酶解溫度三個因素進行優(yōu)化.最優(yōu)工藝為：酶用量0.57%、pH4.9、酶解溫度49.3℃、酶解時間120 min、料液比1：20，貓爪草多糖實際得率為5.86%.

貓爪草；多糖；纖維素酶；響應(yīng)面法

貓爪草（Radix Ranunculi Ternati）為毛莨科植物小毛莨（Ranunculus Ternatus Thunb）的塊根，1977年開始收載于《中華人民共和國藥典》.貓爪草甘、辛、溫，入肝、肺經(jīng)，有清熱解毒、散結(jié)消腫之功效[1].現(xiàn)代藥理與臨床研究證實，貓爪草具有抗腫瘤、抗菌、調(diào)免疫抗氧化等作用[2-5]，活性部位篩選試驗表明多糖是其最重要活性成分之一[6].目前，已有熱水浸提、超聲、微波輔助提取貓爪草多糖文獻報道，但此類方法均提取溫度高、能耗大，易導致多糖降解而改變其結(jié)構(gòu)與活性.酶法提取通過酶解作用破壞植物細胞壁，促使胞內(nèi)多糖等有效成分充分釋放，提取率高，且操作條件溫和、能耗低，利于工業(yè)化應(yīng)用[7].本研究利用纖維素酶提取貓爪草多糖，并通過單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝.

1 儀器與材料

1.1 儀器

Cary 60紫外可見分光光度計（美國安捷倫），DV215CD精密電子天平（美國Ohaus公司）；HH-4恒溫水浴鍋（金壇市晶玻實驗儀器廠）；101-1A鼓風干燥箱（金壇市天竟實驗儀器廠）；S400智能型酸度計（梅特勒-托利多）；1-14臺式離心機（德國Sigma公司）.

1.2 材料

貓爪草購于安徽亳州中藥材市場，經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校汪榮斌教授鑒定為毛莨科植物小毛莨的塊根，經(jīng)粉碎、脫脂和干燥處理后備用；葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院）；纖維素酶（無錫市雪梅酶制劑科技有限公司）；苯酚、硫酸等試劑均為國產(chǎn)分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 工藝流程

貓爪草→配液→酶解→離心→濃縮→醇沉→過濾→粗多糖→復溶.

2.2 貓爪草多糖含量測定采用苯酚-硫酸法測定貓爪草多糖含量[8-9].

式1中，M1為測得多糖質(zhì)量，M2為貓爪草藥材質(zhì)量.

2.3 酶解提取條件單因素考察

2.3.1 酶用量對貓爪草多糖得率的影響

準確稱取貓爪草脫脂粉末2.0 g，設(shè)置纖維素酶用量分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%，其他因素固定于緩沖液pH5.0、酶解溫度50℃、時間120 min、料液比1：30，進行酶解提取多糖.酶解后迅速加熱至90℃滅酶活10 min.按工藝流程測定貓爪草多糖含量，計算多糖得率，如圖1.

圖1 酶用量對貓爪草多糖得率的影響

由圖1可知，當纖維素酶用量從0.3%增加到0.6%時，多糖得率迅速從3.01%提高至5.60%，但此后基本保持不變.可能原因是當纖維素酶用量達到0.6%時，藥材中大部分細胞壁受到酶解破壞，多糖已充分釋放.此后雖繼續(xù)增加酶量，但多糖得率不會繼續(xù)提高.故選擇纖維素酶用量為0.6%.

2.3.2 pH對貓爪草多糖得率的影響

準確稱取貓爪草脫脂粉末2.0 g，設(shè)置酶解緩沖液pH分別為pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，其他因素固定于酶用量0.6%、酶解溫度50℃、時間120 min、料液比1：30，進行酶解提取多糖.酶解后迅速加熱至90℃滅酶活10 min.按工藝流程測定貓爪草多糖含量，計算多糖得率，如圖2.

圖2 pH對貓爪草多糖得率的影響

由圖2可知，當pH值從3.5升高到5.0時，多糖得率從3.93%逐漸提高到5.63%，此后隨pH的繼續(xù)升高而降低.酶是具有高度活性的生物催化劑，其活性與穩(wěn)定性均與溶液pH的密切相關(guān)，可能原因是pH影響酶的活性中心必須基團的解離狀態(tài)及酶的溶解程度.pH5. 0時纖維素酶的活性與穩(wěn)定性最優(yōu)，故選擇酶解pH值為5.0.

2.3.3 酶解溫度對貓爪草多糖得率的影響

準確稱取貓爪草脫脂粉末2.0 g，設(shè)置酶解溫度分別為35、40、45、50、55、60℃，其他因素與“2.3.2”方法相同.計算多糖得率，如圖3.

圖3 酶解溫度對貓爪草多糖得率的影響

由圖3可知，當溫度從35℃升高到50℃時，多糖得率從4.01%逐漸提高到5.65%，此后則隨溫度的繼續(xù)升高而降低.溫度對酶促反應(yīng)的影響存在兩面性，當初始溫度較低時，隨著溫度逐漸升高，活化分子數(shù)量亦逐漸增加，酶反應(yīng)速度加快，此時多糖得率提高；當溫度過度升高后，酶受高溫影響逐漸變形失活，酶反應(yīng)速度降低，多糖得率隨之降低.故選擇酶解溫度為50℃.

2.3.4 酶解時間對貓爪草多糖得率的影響

準確稱取貓爪草脫脂粉末2.0 g，設(shè)置酶解時間分別為30、60、90、120、150、180 min，其他因素與“2.3.2”方法相同.結(jié)果見圖4.

圖4 酶解時間對貓爪草多糖得率的影響

由圖4可知，隨著酶解時間的增加，多糖得率也逐漸增加.當酶解時間達120 min時，多糖得率已趨于穩(wěn)定，可見此時藥材細胞壁中的纖維素已酶解完全，多糖得到充分釋放.故選擇酶解時間為120 min.

2.3.5 料液比對貓爪草多糖得率的影響

準確稱取貓爪草脫脂粉末2.0 g，設(shè)置料液比分別為1：10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60，其他因素與“2.3.2”方法相同.結(jié)果見圖5.

圖5 料液比對貓爪草多糖得率的影響

由圖5可知，隨著料液比的增加，多糖得率也逐漸增加.當料液比達1：20時，多糖得率已趨于相對穩(wěn)定，料液比過高將導致底物濃度降低，酶反應(yīng)速速相應(yīng)減慢，使多糖得率稍有減少.故選擇料液比為1：20.

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取工藝

在上述單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇對多糖得率有較大影響的因素酶用量、緩沖液pH、酶解溫度為自變量，以多糖得率為響應(yīng)值（設(shè)置酶解時間120 min、料液比1：20），利用Minitab軟件進行Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝.因素與水平安排見表1，試驗結(jié)果與方差分析見表2與表3.

使用Minitab軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得回歸方程式2，方差分析與回歸方程及系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表3與表4.

Y＝5.78716+0.17103A-0.08514B-0.05701C

由表3可知，回歸方程極顯著（P<0.01），而失擬不顯著（P>0.05），表明該方程擬合度良好，無需調(diào)整，可以利用其對纖維素酶提取貓爪草多糖工藝進行分析.由表4可知，僅因素A、B2對酶解提取多糖有極顯著影響.由于因素已經(jīng)標準化編碼，故其數(shù)值的絕對值可反映影響大小，所以各因素對多糖提取率影響大小的順序為：酶用量>pH>酶解溫度.通過響應(yīng)面三維曲面圖6-8可直觀地反映各因素的交互作用對多糖得率的影響，Minitab軟件對回歸方程式2進行最優(yōu)值計算，確定最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶用量0.57%、緩沖液pH4.9、酶解溫度49.3℃，結(jié)合酶解提取時間120 min、料液比1：20，此條件下貓爪草多糖理論得率為5.86%.

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計方案與結(jié)果

圖6 酶用量與pH對多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖

表3 方差分析

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

圖7 酶用量與溫度對多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖

2.5 驗證試驗

準確稱取3份貓爪草脫脂粉末各2.0 g，設(shè)置酶解時間120 min、料液比1：20，按最優(yōu)工藝條件：酶用量0.57%、pH4.9、酶解溫度49.3℃進行纖維素酶解提取多糖，并與不加酶組進行對照，結(jié)果如表5所示.

圖8 pH與溫度對多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖

表5 驗證與對比試驗結(jié)果

由表5可知，三次最優(yōu)工藝提取貓爪草多糖得率的平均值與回歸方程的理論預測值基本一致，且明顯高于不加酶直接水提對照組的多糖得率.表明Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化得到的纖維素酶提取貓爪草多糖工藝條件準確可靠.

3 結(jié)論與討論

植物多糖的提取方法有傳統(tǒng)熱水浸提法、稀酸浸提法、超聲提取法、微波提取法等[10-11]，但均耗能大，且提取條件惡劣，極易影響目標物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與活性[12].酶法提取通過酶解作用破壞植物細胞而使胞內(nèi)物質(zhì)釋放，但也使得可溶性雜質(zhì)溶出增加，為后期分離精制帶來困難，且還需考慮酶的回收再利用.

實驗采用纖維素酶酶解提取貓爪草多糖，研究了酶用量、pH、提取溫度、時間、料液比對多糖得率的影響，并通過響應(yīng)面法試驗設(shè)計得到最優(yōu)提取工藝：酶用量0.57%、pH4.9、溫度49.3℃、酶解時間120 min、料液比1：20，貓爪草多糖實際得率為5.86%.此法條件溫和，能耗低，工藝穩(wěn)定，下一步可研究與其他提取法所得多糖的結(jié)構(gòu)及活性對比，進一步探討酶法提取多糖的特點.

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Optimization of Cellulase Extraction Process for Radix Ranunculi Ternati Polysaccharide by Response surface methodology

LIAO Qi-yuan，WANG Xiao-ge，LIU Dong-ping，LIU Li-min，JING Jia
（Anhui College of Traditional Chinese Medicine，Wuhu，Anhui 241000）

To optimize the cellulase extraction process for Radix Ranunculi Ternati polysaccharide by Response surface methodology（RSM）.With the extraction rate of polysaccharide as the index，RSM with three factors and three levels was used to optimize the extraction process based on the results of single factor tests.The optimum extraction conditions were as follows：the amount of cellulase was 0.57%，hydrolysis temperature was 49.3℃，solvent to solid ratio was 1：20，the extraction time was 120 min under pH 4.9，the polysaccharide yield was 5.86%.

Radix Ranunculi Ternati；polysaccharide；cellulase；response surface methodology

R91

A

1671－9743（2017）05－0067－04

2016-12-07

安徽省教育廳重點項目“貓爪草多糖的提取分離及抗炎作用研究”（KJ2016A420）.

廖啟元，1979年生，男，湖北武漢人，講師，研究方向：藥學.