張穩(wěn)，梁浩，譚倪，郁建生

（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州銅仁554300；2.南華大學(xué)，湖南衡陽421001）

芹菜甲素分子印跡聚合物的制備及其吸附性能研究

張穩(wěn)1，2，梁浩1，譚倪2，郁建生1

（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州銅仁554300；2.南華大學(xué)，湖南衡陽421001）

以芹菜甲素為模板分子，通過沉淀聚合法制備了芹菜甲素分子印跡聚合物（MIPs）和非分子印跡聚合物（NIPs），并通過動(dòng)態(tài)吸附、靜態(tài)吸附和選擇性吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)所制備的分子印跡聚合物的吸附性能進(jìn)行了表征.結(jié)果表明，當(dāng)芹菜甲素的濃度為0.1 mmol L-1，吸附時(shí)間為12 h時(shí)，MIPs達(dá)到吸附平衡且最大吸附量為3.561 mgg-1.Scatchard分析表明，在MIPs中存在高親和性和低親和性兩種結(jié)合位點(diǎn)，而在NIPs中只存在一種非特異性結(jié)合位點(diǎn).選擇吸附實(shí)驗(yàn)表明，MIPs對(duì)芹菜甲素具有高選擇性和良好的專一識(shí)別性能.該研究可為芹菜甲素分子印跡聚合物作為固相萃取材料分離提取中藥中有效成分芹菜甲素提供了理論基礎(chǔ).

分子印跡聚合物；芹菜甲素；沉淀聚合；吸附

分子印跡技術(shù)是將功能單體和模板分子在交聯(lián)劑和引發(fā)劑存在的條件下引發(fā)聚合，得到高度交聯(lián)的聚合物的技術(shù)，其中聚合物中的模板分子經(jīng)化學(xué)法或溶劑萃取法移除后得到具有一定空穴結(jié)構(gòu)和識(shí)別位點(diǎn)的分子印跡聚合物（MIPs）.MIPs對(duì)模板分子具有預(yù)先識(shí)別和專一選擇的特性且具有制備簡(jiǎn)單，性質(zhì)穩(wěn)定，可回收再利用及對(duì)環(huán)境有著較好耐受性的優(yōu)點(diǎn)[1-3].近年來，MIPs在中草藥有效成分的提取，酶催化模擬，固相萃取，傳感器等方面得到了廣泛的應(yīng)用.芹菜甲素是一種重要的具有生物活性的苯酞類衍生物，存在于能夠?yàn)樗幬镅邪l(fā)提供重要研發(fā)資源的中草藥中，尤其是人們?nèi)粘Ｉ钪惺褂玫漠?dāng)歸、川芎和芹菜等傘形科植物.芹菜甲素具有保護(hù)心肌細(xì)胞[4]，改善慢性腦缺血[5]和阿爾茨海默癥[6]等生物活性，在生物化學(xué)、臨床及制藥研究等方面受到越來越多的關(guān)注.

本文采用分子印跡技術(shù)，以芹菜甲素為模板分子通過沉淀聚合法制備了芹菜甲素分子印跡聚合物，并對(duì)聚合物吸附及識(shí)別性能進(jìn)行了探究，為從復(fù)雜的中草藥基質(zhì)中提取分離芹菜甲素提供了一種有效方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

DHT型恒溫?cái)嚢栊碗姛崽祝ㄉ綎|鄄城華魯儀器有限公司）；FA2204B電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；DZ系列真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；KaidaTD4低速臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；KS康氏調(diào)速備用振蕩器（長沙索拓科學(xué)儀器設(shè)備有限公司）；80 WBG-01超聲波清洗器（廣州邦潔電子產(chǎn)品有限公司）；UV-8500紫外可見分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）.

芹菜甲素（Butylphthalide，99.6%，中國藥品生物制品檢定所）；3-正丙基茚苯酞（3-n-Propylidenephthalide，96%，中國藥品生物制品檢定所）；丙烯酰胺（Acrylamide，分析純，廣東省汕頭市西隴化工廠有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（Etylene glycol dimethacrylate，99%，低溫保存，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司）；偶氮二異丁腈（2，2，-Azobisisobutyronitrile，化學(xué)純，上海山浦化工有限公司），使用前用乙醇進(jìn)行熱過濾，除去不溶物，取濾液進(jìn)行重結(jié)晶；其余試劑均為市售分析純.

1.2 MIPs的制備

稱取35.54 mg（0.5 mmol）的丙烯酰胺于25 mL的圓底燒瓶中，加入12.5 mL的丙酮及23.78 mg的芹菜甲素，室溫條件下超聲溶解5 min后靜置4 h，以形成穩(wěn)定的芹菜甲素-丙烯酰胺復(fù)合物，加入0.4956 g交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDTA，2.5 mmol）和20 mg的引發(fā)劑偶氮二異丁腈（AIBN），超聲振蕩脫氣5 min，通氮脫氧15 min，密封反應(yīng)體系，在N2保護(hù)下于60℃恒溫水浴中熱聚合24 h.反應(yīng)合成的聚合物用乙醇-乙酸（8：2，v/v）進(jìn)行多次振蕩洗脫，洗去模板分子及未聚合的功能單體和交聯(lián)劑，直至紫外檢測(cè)無以上物質(zhì)的吸收，再用乙醇洗去殘留的乙酸至中性，即得到芹菜甲素分子印跡聚合物（MIPs），60℃真空干燥24 h，置于干燥器中備用.非分子印跡聚合物（NIPs）的制備除不加模板分子外其余方法同上.圖1是芹菜甲素和其結(jié)構(gòu)相似物的分子結(jié)構(gòu)示意圖，圖2是上述MIPs的制備過程.

1.3 MIPs的吸附及識(shí)別性能

1.3.1 聚合物的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取7份10 mg的MIPs和NIPs，分別向其加入8 mL的濃度為0.01-0.14 mmol L-1的芹菜甲素標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于室溫下分別振蕩12 h[7，8]，取其上清液，測(cè)其吸光度，計(jì)算聚合物在不同濃度下的飽和吸附量Q（mg g-1），并做Scathard分析.相關(guān)公式如下[9]：

其中，C0為芹菜甲素的初始濃度（mmol L-1）；C是芹菜甲素經(jīng)聚合物吸附后的濃度（mmol L-1）；V是吸附時(shí)混合液的總體積（L）；m是加入的聚合物的質(zhì)量（g）；M是芹菜甲素的摩爾質(zhì)量（190.24 gmol-1）.

Scathard方程：

圖1 芹菜甲素和其結(jié)構(gòu)相似物的分子結(jié)構(gòu)式

圖2 MIPs合成過程圖

1.3.2 聚合物的動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取9份10 mg的MIPs和NIPs，分別加入8 mL濃度為0.1 mmol L-1的芹菜甲素標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于室溫下分別振蕩不同的時(shí)間，計(jì)算聚合物對(duì)芹菜甲素在不同吸附時(shí)間下的吸附量.

1.3.3 聚合物的選擇性吸附實(shí)驗(yàn)

選用與芹菜甲素結(jié)構(gòu)相似的3-正丙基茚苯酞分別作為底物，稱取10 mg的MIPs和NIPs，分別加入0.1 mmol L-1的各底物的乙醇溶液，按照上述方法，測(cè)定MIPs和NIPs對(duì)底物的吸附量.

靜態(tài)吸附分配系數(shù)（Kd），印跡因子（α）和選擇性系數(shù)（β）用來表征MIPs和NIPs對(duì)芹菜甲素及其相似結(jié)構(gòu)化合物的專一識(shí)別性能，公式如（3）-（5）所示[10]：

其中，Cp為吸附平衡時(shí)底物在聚合物中的濃度，即聚合物吸附底物的量（mgg-1）；Cs為吸附平衡時(shí)底物在溶液中的濃度（mmol L-1）.

其中，QMIPs和QNIPs分別是聚合物對(duì)模板分子的吸附量或相似結(jié)構(gòu)底物結(jié)合在聚合物上的量.

其中，α1和α2分別是模板分子以及相似結(jié)構(gòu)底物的印跡因子.

圖3 MIPs和NIPs的靜態(tài)吸附曲線

圖4 MIPs的Scatchard分析

圖5 NIPs的Scatchard分析

圖6 MIPs和NIPs的動(dòng)態(tài)吸附曲線

2 結(jié)果與討論

2.1 靜態(tài)吸附

從圖3可以看出，在吸附初始階段，MIPs對(duì)芹菜甲素的吸附量隨著芹菜甲素濃度的增加而增長；當(dāng)芹菜甲素的濃度增至0.1 mmol L-1時(shí)，MIPs對(duì)芹菜甲素的吸附達(dá)到飽和，且吸附量達(dá)到最大3.561 mg g-1，表明在印跡過程中生成了大量的芹菜甲素的特異結(jié)合位點(diǎn).相同吸附條件下，MIPs對(duì)芹菜甲素的結(jié)合量比NIPs高.

2.2 Scathard分析

圖4是MIPs的Scatchard分析圖，兩條直線的線性回歸方程分別是Q/Cs=470.471-129.195Q和Q/Cs= 288.618-11.118Q，這表示在MIPs中生成了兩類不同的結(jié)合位點(diǎn).對(duì)高親和性結(jié)合位點(diǎn)，其分布常數(shù)和最大表觀結(jié)合量分別是0.008 mgmL-1和3.642 mgg-1；對(duì)低親和性結(jié)合位點(diǎn)，其分布常數(shù)和最大表觀結(jié)合量分別是0.090 mgmL-1和25.960 mgg-1.

圖5中只有一條直線，表明在NIPs中只存在一種非特異性結(jié)合位點(diǎn)，其線性回歸方程是Q/Cs=431.985-227.415Q，得到相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)的分布常數(shù)和最大表觀結(jié)合量分別是0.004 mgmL-1和1.900 mgg-1.

2.3 動(dòng)態(tài)吸附

由圖6可以看出，吸附的初始階段（0-8 h），MIPs和NIPs對(duì)芹菜甲素都有著較高的吸附速率且Q也隨時(shí)間單調(diào)增長，8 h后二者對(duì)芹菜甲素的吸附速率變得平緩且在12 h達(dá)到了吸附平衡.相同吸附條件下，MIPs對(duì)芹菜甲素的吸附量高于NIPs對(duì)芹菜甲素的吸附量.實(shí)驗(yàn)表明MIPs對(duì)芹菜甲素的結(jié)合具有高選擇性和親和性的結(jié)合位點(diǎn).

2.4 選擇性吸附

從表1可以看出，芹菜甲素MIPs對(duì)3-正丙基茚苯酞的吸附量為1.238 mgg-1，而對(duì)模板分子芹菜甲素有更高的吸附量3.561 mgg-1.芹菜甲素MIPs對(duì)3-正丙基茚苯酞的吸附量非常接近NIPs的吸附量.此外，芹菜甲素MIPs對(duì)芹菜甲素的分布常數(shù)為0.243 Lg-1，高于其對(duì)3-正丙基茚苯酞的分布常數(shù)0.078 Lg-1，進(jìn)一步說明其對(duì)模板分子芹菜甲素的吸附有高選擇性.MIPs和NIPs對(duì)模板分子芹菜甲素的印跡因子大于另種吸附底物的印跡因子，同時(shí)，兩種聚合物對(duì)3-正丙基茚苯酞的選擇因子為2.034.結(jié)果表明MIPs對(duì)于目標(biāo)分子芹菜甲素有著良好的識(shí)別性能和分離吸附量.

表1 MIPs和NIPs的選擇性吸附

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，相同吸附條件下，芹菜甲素MIPs對(duì)芹菜甲素的結(jié)合量比NIPs高，且芹菜甲素分子印跡聚合物對(duì)芹菜甲素的識(shí)別具有良好的專一選擇性與親和性能，將其作為固相萃取吸附劑用于提取分離實(shí)際樣品如中草藥中的芹菜甲素具有很大應(yīng)用潛力.

[1]Sanagi MM，Salleh S，Ibrahim WAW，et al.Molecularly imprinted polymersolid-phaseextractionfortheanalysisof organophosphorus pesticides in fruit samples[J].Journal of Food Composition and Analysis，2013，32（2）：155-161.

[2]Yongfeng K，Wuping D，Yan L，et al.Molecularly imprinted polymers of allyl-β-cyclodextrin and methacrylic acid for the solid-phase extraction of phthalate[J].Carbohydrate Polymers，2012，88（2）：459-464.

[3]Martín-EstebanA.Molecularly-imprintedpolymersasa versatile，highly selective tool in sample preparation[J].TrAC Trends in Analytical Chemistry，2013，45：169-181.

[4]WangYG，Li Y，WangCY，et al.L-3-n-butylphthalide protects rats'cardiomyocytesfrom ischaemia/reperfusion-induced apoptosis by affecting the mitochondrial apoptosis pathway[J]. Acta Physiologica，2014，210（3）：524-533.

[5]Xu J，Wang Y，Li N，et al.l-3-n-butylphthalide improves cognitive deficits in rats with chronic cerebral ischemia[J]. Neuropharmacology，2012，62（7）：2424-2429.

[6]Peng Y，Hu Y，Xu S，et al.l-3-n-Butylphthalide regulates amyloid precursor protein processing by PKC and MAPK pathways in SK-N-SH cells over-expressing wild type human APP695[J].Neuroscience Letters，2011，487（2）：211-216.

[7]S.Zschocke.I.klaiber，R.Bauer，et al.HPLC-coupled spectroscopic techniques（UV，MS，NMR）for the structure elucidation of phthalides in Ligusticum chuanxiong[J].Molecular Diversity，2005，9：33-39.

[8]鄢學(xué)芬，詹瑾，黃葉寧，等.丁苯酞的藥理作用與臨床評(píng)價(jià)[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（17）：1498-1500.

[9]Sun X，Wang J，Li Y，et al.Highly selective dummy molecularly imprinted polymer as a solid-phase extraction sorbent for five bisphenols in tap and river water[J].Journal of Chromatography A，2014，1343（1）：33-41.

[10]She Y-x，Cao W-q，Shi X-m，et al.Class-specific molecularly imprintedpolymersfortheselectiveextractionand determination of sulfonylurea herbicides in maize samples by high-performanceliquidchromatography-tandemmass spectrometry[J].Journal of Chromatography B，2010，878（23）：2047-2053.

Synthesis and Adsorption Properties of l-3-n-butylphthalide Molecularly Imprinted Polymers

ZHANG Wen1，2，LIANG Hao1，TAN Ni2，YU Jian-sheng1
（1.Tongren Polytechnic College，Tongren，Guizhou 554300；2.University of South China，Hengyang，Hunan 421001）

In this thesis，l-3-n-butylphthalide molecularly imprinted polymers（MIPs）and non-molecularly imprinted polymers（NIPs）were synthesized through precipitation polymerization for the first time.Meanwhile the adsorption properties of the MIPs were studied by the static，dynamic and the selective adsorption experiments respectively.The results revealed that when the concentration of l-3-n-butylphthalide was 0.1mmol L-1and the adsorption was 12 h，the MIPs attained adsorption equilibrium and the mostadsorptioncapacity was 3.561 mg g-1.Scatchard analyses revealed that there were high and low affinity sites formed in the MIPs，however，there were only nonspecific sits in the NIPs.The selective adsorption experiments showed that MIPs have high selectivity and good specific recognition properties to l-3-n-butylphthalide.The present paper research provide theoretical basis for using l-3-nbutylphthalide MIPs as the solid phase extraction materials to separate and extract active ingredient l-3-n-butylphthalide in the traditional Chinese medicine.

molecularly imprinted polymers；l-3-n-butylphthalide；precipitation polymerization；adsorption

O63

A

1671－9743（2017）05－0058－04

2016-11-21

張穩(wěn)，1988年生，女，山東濟(jì)寧人，助教，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物的提取和分離.