郝文，李丹丹，楊超

(青島市疾病預(yù)防控制中心， 青島市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院，青島 266033)

反相液相色譜法測(cè)定苦參中苦參堿和氧化苦參堿

郝文，李丹丹，楊超

(青島市疾病預(yù)防控制中心， 青島市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院，青島 266033)

建立反相液相色譜法測(cè)定苦參中苦參堿和氧化苦參堿含量的方法。提取溶劑為乙醇，選擇C18色譜柱，以甲醇-水-三乙胺溶液(55∶45∶0.2)為流動(dòng)相，流量為0.8 mL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為210 nm?？鄥A和氧化苦參堿的質(zhì)量濃度在10～200 mg/L范圍內(nèi)均與其色譜峰面積呈良好的線(xiàn)性，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限分別為0.05， 0.1 mg/L?？鄥A和氧化苦參堿的加標(biāo)回收率分別為98.47%，97.89%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.32%，1.08%(n=6)。該方法操作簡(jiǎn)便，干擾少，靈敏度高。

反相液相色譜法；苦參；苦參堿；氧化苦參堿

AbstractA method for the determination of matrine and oxymatrine in sophora flavescens by reversed phase liquid chromatography was established. The extraction solvent was ethanol， C18column was selected， methanol-water-three ethylamine solution (55∶45∶0.2) was used as the mobile phase with the flow rate of 0.8 mL/min，and the UV detector wavelength was 210 nm. The concentration of matrine and oxymatrine was linear with its chromatographic peak area in the range of 10-200 mg/L，the linear correlation coef ficients were more than 0.999, and the detection limits were 0.05,0.1 mg/L, respectively. The recovery rates of matrine and oxymatrine were 98.47%, 97.89%，and the relative standard deviations of determination results were 1.32% and 1.08%(n=6), respectively. The method has the advantages of simple operation， less interference and high sensibility.

Keywordsreversed phase liquid chromatography; sophora flavescens; matrine; oxymatrine

苦參是豆科槐屬類(lèi)植物的根，其含有的活性成分主要是苦參堿和氧化苦參堿，是一種具有喹喏里西啶骨架的生物堿［1］。苦參堿和氧化苦參減具有抗病毒、消炎止痛和抗腫瘤的功效，它在人體內(nèi)作用機(jī)理是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)具有抗病毒、抗炎免疫、升高白細(xì)胞、激活細(xì)胞膜腺苷酸環(huán)化酶以及清除體內(nèi)自由基等作用，在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛［2］。

測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿常用分光光度法［3］、酸堿滴定法［4］、毛細(xì)管電泳法［5］，這些方法存在樣品前處理繁瑣、消耗時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。液相色譜法在這方面的研究近年來(lái)開(kāi)始報(bào)道，白小紅等采用液相微萃取/后萃取-高效液相色譜法測(cè)定氧化苦參堿和苦參堿，具有溶劑用量小、干擾少等優(yōu)點(diǎn)［6］；Fukuda等采用質(zhì)譜方法對(duì)不同苦參堿類(lèi)組分進(jìn)行了檢測(cè)和鑒別［7］。筆者采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)同時(shí)測(cè)定苦參粗提取液中的苦參堿和氧化苦參堿含量，該方法具有樣品前處理簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

DAD紫外檢測(cè)器：G1314A型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

電子分析天平：BSA224S型，德國(guó)賽多利斯公司；

超聲波脫氣機(jī)：KQ2200E型，昆山超聲儀器公司；

容積過(guò)濾器：T-50型，北京興延誠(chéng)博科技有限公司；

純水機(jī)：Ultra Clear TWF型，德國(guó)西門(mén)子公司；

甲醇：色譜純，德國(guó)Merck公司；

無(wú)水乙醇：分析純，國(guó)藥試劑化學(xué)試劑廠；

中性氧化鋁：粒徑為75 μm(200目)，Ⅳ級(jí)活度；

苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品研究所；

實(shí)驗(yàn)用水為純水機(jī)制得一級(jí)水。

1.2 樣品前處理

將待測(cè)樣品切成小塊（約1 g），切碎，置于150 mL燒杯中，加入50 mL乙醇，使得樣品分散均勻，使用組織搗碎機(jī)搗碎2 min，用快速濾紙過(guò)濾，收集濾液，再用50 mL濾液分多次洗滌濾紙上殘?jiān)?，收集合并濾液于旋蒸瓶中，于50℃蒸干。準(zhǔn)確加入10.00 mL流動(dòng)相溶解樣品，混勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，供檢測(cè)［8］。

1.3 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液制備

稱(chēng)取苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品各50.00 mg，置于5 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至標(biāo)線(xiàn)，搖勻，所制備的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液質(zhì)量濃度為 10.00 mg/mL，置于 4℃冰箱中備用［9］。

1.4 儀器工作條件

色 譜 柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水-三乙胺(55∶45∶0.2)，加入磷酸溶液調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值為2.0［10-11］，流量為 0.8 mL/min ；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：35℃，進(jìn)樣體積：10μL；外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑

分別采用乙醇、甲醇-水(1∶1)作為提取溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，用甲醇-水(1∶1)作為提取溶劑時(shí)，濾液渾濁，雜質(zhì)較多，需進(jìn)一步凈化處理，否則影響液相分析；用乙醇作為提取溶劑，濾液澄清，可濃縮蒸干定容后直接進(jìn)樣，因此實(shí)驗(yàn)選擇乙醇為樣品提取溶劑。

2.2 流動(dòng)相及其流速

分別采用不同比例的甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，以乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，加入基體改進(jìn)劑后峰型改善不明顯，分離效果不好；以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，發(fā)現(xiàn)色譜峰不對(duì)稱(chēng)，有較嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，加入0.2%的乙二胺后，峰型得到很好改善，苦參堿和氧化苦參堿能較好地分離，分離度在1.5以上。因此實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-水-三乙胺溶液(55∶45∶0.2)為流動(dòng)相。

考察了流動(dòng)相流量分別為 0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL/min時(shí)，苦參堿和氧化苦參堿的分離情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，流動(dòng)相流量過(guò)高色譜峰過(guò)于擁擠，分離效果差；而流動(dòng)相流量過(guò)低，分析時(shí)間延長(zhǎng)，色譜峰型也變差，最終選擇流動(dòng)相流量為0.8 mL/min。在此條件下，100 mg/L的苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品溶液的色譜峰見(jiàn)圖1。

圖1 苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品溶液色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)繪制

分別移取適量苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至標(biāo)線(xiàn)，分別配制苦參堿和氧化苦參堿的質(zhì)量濃度為10，20，50，100，200 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在1.4條件下分別進(jìn)樣分析。以待測(cè)物的質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，分別得到苦參堿的回歸方程為Y=29.210 2X-4.8763，r=0.999 8，線(xiàn)性范圍為 10～200 mg/L；氧化苦參堿的回歸方程為Y=22.660 7X-3.111 5，r=0.999 9，線(xiàn)性范圍為 10～200 mg/L。

2.4 檢出限和定量限

逐級(jí)稀釋苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，直至各自響應(yīng)信號(hào)為噪聲10倍和3倍，分別記下此時(shí)溶液濃度，即取S/N=3時(shí)響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，S/N=10時(shí)響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的濃度為定量限。最后得出苦參堿的檢出限為0.05 mg/L，定量限為0.2 mg/L；氧化苦參堿檢出限為0.1 mg/L，定量限為0.4 mg/L。

2.5 精密度試驗(yàn)

在1.4儀器工作條件下對(duì)50 mg/L的苦參堿和氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，苦參堿測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%，氧化苦參堿測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.08%。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取適量苦參樣品，按1.2方法進(jìn)行提取，在1.4條件下分別在 0，2，4，6，8，12，24 h 測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，苦參堿和氧化苦參堿含量在24 h內(nèi)變動(dòng)較小，7次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.16%，1.60%，可見(jiàn)穩(wěn)定性較好。

表2 不同時(shí)間苦參堿和氧化苦參堿檢測(cè)結(jié)果

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

對(duì)某苦參樣品按1.2方法提取后，在1.4儀器條下測(cè)定，然后分別加入一定量的對(duì)照品溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，苦參堿和氧化苦參堿的回收率分別見(jiàn)表 3、表 4。

表3 苦參堿回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表4 氧化苦參堿回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

由表3、表4可知，苦參堿和氧化苦參堿的平均加標(biāo)回收率分別為98.47%，97.89%，可見(jiàn)方法的準(zhǔn)確度較高，滿(mǎn)足方法學(xué)要求。

2.8 樣品檢測(cè)

從不同藥店購(gòu)到5份不同品牌的苦參藥材樣品，按1.2方法提取后進(jìn)行測(cè)定，苦參堿和氧化苦參堿含量見(jiàn)表5。由表5可以看出，不同地區(qū)生產(chǎn)的苦參藥材樣品中，苦參堿和氧化苦參堿含量不同，來(lái)自?？荡笏幏慨a(chǎn)自陜西咸陽(yáng)地區(qū)的苦參堿和氧化苦參堿含量最高。

表5 苦參樣品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了反相液相色譜法同時(shí)檢測(cè)苦參中苦參堿和氧化苦參堿的含量，以甲醇-水-三乙胺溶液(體積比55∶45∶0.2)為流動(dòng)相，分離度好。該方法操作簡(jiǎn)單，干擾少，檢出限低，測(cè)定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度較高，可以在中藥生產(chǎn)加工企業(yè)進(jìn)行應(yīng)用和推廣。

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Determination of Matrine and Oxymatrine in Sophora Flavescens by Reverse Phase Liquid Chromatography

Hao Wen， Li Dandan， Yang Chao
(Qingdao City Center for Disease Control and Prevention, Qingdao Institute of Preventive Medicine, Qingdao 266033, China)

O657.7

A

1008-6145(2017)04-0068-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2017.04.017

聯(lián)系人：郝文； E-mail: 645412635@qq.com

2017-04-12