周倩，張群，冷雪，俎廷建，秦靜，溫潔，吳訓(xùn)偉,2（通訊作者）

（1.山東大學(xué)口腔醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000；2. 山東大學(xué)蘇州研究院，江蘇 蘇州 215000）

體外擴(kuò)增源于成人頭皮組織的真皮細(xì)胞具有多向分化潛能

周倩1，張群1，冷雪1，俎廷建1，秦靜1，溫潔1，吳訓(xùn)偉1,2（通訊作者）

（1.山東大學(xué)口腔醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000；2. 山東大學(xué)蘇州研究院，江蘇 蘇州 215000）

目的 探討來(lái)源于成人頭皮組織的真皮細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后其向成脂、神經(jīng)、成骨及成肌方向分化的潛能，為皮膚創(chuàng)傷修復(fù)種子細(xì)胞的新來(lái)源提供依據(jù)。方法 取胚胎及成人頭皮組織分離真皮細(xì)胞。利用維持細(xì)胞多功能性的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，取第4代真皮細(xì)胞免疫熒光染色，通過(guò)檢測(cè) 波形蛋白和角蛋白的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。對(duì)真皮細(xì)胞進(jìn)行定向分化誘導(dǎo)并用免疫熒光染色檢測(cè)各方向分化指標(biāo)蛋白，通過(guò)和源于胚胎頭皮組織的真皮細(xì)胞比較，來(lái)分析其多向分化潛能。結(jié)果 原代細(xì)胞分離后24h貼壁，細(xì)胞形態(tài)多為梭形或多角形，可多次傳代且傳代后細(xì)胞形態(tài)均一穩(wěn)定。免疫熒光染色結(jié)果顯示該細(xì)胞僅表達(dá)波形蛋白（vimentin）不表達(dá)角質(zhì)蛋白（Pan-CK）；源于成人及胚胎頭皮的真皮細(xì)胞均能誘導(dǎo)向成脂、成骨、成神經(jīng)及成肌細(xì)胞方向分化，盡管與源于胚胎組織的細(xì)胞相比，成人真皮細(xì)胞分化效率相對(duì)較低。結(jié)論 源于頭皮分離的成人真皮細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增后能誘導(dǎo)分化成不同組織細(xì)胞，因而具有多向分化潛能。由于成人頭皮組織相對(duì)容易獲得，其來(lái)源廣泛，因而可成為皮膚組織工程研究以及臨床應(yīng)用的理想種子細(xì)胞。

成人皮膚組織；真皮細(xì)胞；波形蛋白；角蛋白；多向分化

0 引言

真皮細(xì)胞來(lái)源于胚胎中胚層間質(zhì)細(xì)胞，具有增殖能力強(qiáng)、體外培養(yǎng)不易老化、易于傳代的特點(diǎn)，是人體分布最廣，參與組織修復(fù)最重要的一類(lèi)細(xì)胞，被視為人體數(shù)量最大的“種子細(xì)胞庫(kù)”[1]。以往的研究認(rèn)為，真皮細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不具備繼續(xù)向其他細(xì)胞方向分化潛能，而且，體外培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞往往喪失其多功能性。但是，近期有報(bào)道稱真皮細(xì)胞在特定的誘導(dǎo)條件下，可以向成骨、成軟骨、成脂、成胰島方向分化[2-5]。能夠表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物CD71、CD73/SH3-SH4、CD90/Thy-1、CD105/SH2 和CD16/ALCAM[6-8]，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子到胚胎成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)其多功能性，成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)多功能性標(biāo)志蛋白SSEA1、SOX2和NANOG等[9]。值得一提的是，郭常敏[3]對(duì)人的包皮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)后，可向成脂、成骨及成軟骨方向分化，但未報(bào)道向成神經(jīng)及成肌方向的分化；Lee[10]等研究中，將神經(jīng)相關(guān)因子轉(zhuǎn)入人真皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)相關(guān)蛋白及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志，證實(shí)相關(guān)神經(jīng)因子的誘導(dǎo)分化功能，而真皮細(xì)胞自身分化潛能未知。這些報(bào)道主要是來(lái)自較年輕的包皮組織來(lái)源的真皮細(xì)胞的研究，而對(duì)成人組織真皮細(xì)胞研究較少。毛發(fā)組織一直被認(rèn)為是分離高潛能干細(xì)胞的來(lái)源，因?yàn)槊抑写嬖诟杉?xì)胞niche,另外毛乳頭細(xì)胞和毛囊真皮間鞘細(xì)胞具有多向分化潛能，然而毛囊來(lái)源的干細(xì)胞分離方法較繁瑣，而且得到細(xì)胞數(shù)也較少。本課題組已成功創(chuàng)建分離和培養(yǎng)皮膚多功能細(xì)胞體系，利用該體系培養(yǎng)的來(lái)源胚胎頭皮細(xì)胞移植到免疫鼠身上能再生帶有附屬器官的完整人類(lèi)皮膚，表明培養(yǎng)擴(kuò)增后細(xì)胞仍具有再生能力。為進(jìn)一步探討成人皮膚組織來(lái)源細(xì)胞的多功能性，本文以成人的頭皮組織來(lái)源的真皮細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用我們創(chuàng)建的簡(jiǎn)便分離方法分離并培養(yǎng)擴(kuò)增[11]，對(duì)傳代擴(kuò)增后的真皮細(xì)胞進(jìn)行多向誘導(dǎo)分化，并與胚胎細(xì)胞進(jìn)行比較，來(lái)鑒定成人真皮細(xì)胞成脂、成骨、成神經(jīng)及成肌多向分化潛能，為將來(lái)組織工程學(xué)種子細(xì)胞的來(lái)源提供依據(jù)。

1 真皮細(xì)胞的分離與傳代

取人頭皮組織，70%乙醇消毒1-3min ,浸泡于含2%雙抗的PBS液中，手術(shù)刀刮除脂肪及血漬，PBS沖洗皮膚2次?；旌戏╗11]分離細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。3天后換液，去除未貼壁細(xì)胞。每5天換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代。取第4代細(xì)胞用于研究。

2 真皮細(xì)胞的體外定向誘導(dǎo)分化

取兩種來(lái)源的第3代真皮細(xì)胞，0.05%胰酶消化，細(xì)胞重懸。每種誘導(dǎo)方式均同時(shí)將兩種來(lái)源細(xì)胞分別接種到含滅菌蓋玻片的24孔板中，制備細(xì)胞爬片。接種細(xì)胞數(shù)為5×104-8.0×104個(gè)/孔，每種細(xì)胞設(shè)8個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞完全融合，取其中兩個(gè)孔做陰性對(duì)照組，另外六孔作為實(shí)驗(yàn)組加入相應(yīng)的誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)（不同誘導(dǎo)液成分見(jiàn)表1）。均放置于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)。

2.1 成脂誘導(dǎo)及鑒定

細(xì)胞完全融合后，棄掉培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組用成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)兩周，每3天換一次液，37oC、5% CO2及飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)。兩周后進(jìn)行免疫熒光染色，標(biāo)記FABP-4蛋白的表達(dá)。

2.2 成骨誘導(dǎo)及鑒定

細(xì)胞完全融合后，棄掉培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組每孔加入500μL誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。此后，每隔3天更換成骨誘導(dǎo)液1次，分化誘導(dǎo)3周后，免疫熒光染色標(biāo)記骨橋蛋白（Osteopontin）的表達(dá)。

2.3 成肌分化誘導(dǎo)及鑒定

細(xì)胞完全融合后，棄掉培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組每孔加入500μL成肌誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)48h后換為普通培養(yǎng)基。每3-4天換1次液，分化誘導(dǎo)2周后，免疫熒光染色檢測(cè)鈣調(diào)蛋白（Calponin）的表達(dá)。

2.4 向神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)及鑒定

取第3代真皮細(xì)胞，胰酶消化后，將5×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，制備細(xì)胞爬片。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)加入誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，3周后分別檢測(cè)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)蛋白p75NTR和GFAP的表達(dá)。

表1 誘導(dǎo)液成分

3 免疫熒光染色檢測(cè)分化指標(biāo)

誘導(dǎo)分化后，棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15min , PBS沖洗3次，5%BSA封閉1h，取出爬片，滴加一抗（Anti-CalponinRabbitmAb，ab46794，abcam，1∶250；Anti-OsteopontinMouse mAb，ab69498，abcam；2 μg/ml；FABP4 (D25B3) XPRabbit mAb，#3544S，CST，1：200；GFAP (GA5) Mouse mAb，#3678S，CST，1：300；p75NTR (D4B3) XPRabbit mAb，#8238S，CST，1：1600；Pan-CK，Mouse mAb，BD Biosciences，Cat：550951，1：500）4℃孵育過(guò)夜，熒光二抗（Dylight 594 Goat Anti-Mouse IgG（H+L），GAM5942，聯(lián)科生物，1：1000; Dylight 488 Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），GAR4882，聯(lián)科生物，1：1000）室溫避光孵育1h，封片，鏡下觀察拍照。

4 結(jié)果

4.1 細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特點(diǎn)

具有多向分化潛能的原代真皮細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)的長(zhǎng)梭型細(xì)胞，分離后24h貼壁，呈多角形集落樣生長(zhǎng)，剛貼壁時(shí)體積小，類(lèi)似圓形，3天后，體積變大，呈多角形，胞質(zhì)豐富，胞核清晰。傳代后，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則均一，呈長(zhǎng)梭型，生長(zhǎng)密度達(dá)70%左右時(shí)增殖明顯（圖1）。

圖1 第4代真皮細(xì)胞（×100）

4.2 Vimentin及Pan-CK的表達(dá)

免疫熒光法檢測(cè)原代真皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物vimentin的表達(dá)為陽(yáng)性，Pan-CK為陰性（圖2）

圖2 第4代真皮細(xì)胞（×100）

4.3 分化誘導(dǎo)

源于胚胎及成人頭皮的真皮細(xì)胞向成骨方向誘導(dǎo)1周后開(kāi)始出現(xiàn)鈣鹽及鈣化結(jié)節(jié)，并隨誘導(dǎo)時(shí)間的加長(zhǎng)而增多，誘導(dǎo)3周左右，特異性標(biāo)志蛋白骨橋蛋白（Osteopontin）染色呈陽(yáng)性（圖3A，B），結(jié)果顯示胚胎組誘導(dǎo)效率高于成人組；在成脂誘導(dǎo)中，細(xì)胞體積隨誘導(dǎo)時(shí)間加長(zhǎng)逐漸變大，1周左右出現(xiàn)脂滴，并逐漸增多，誘導(dǎo)3周時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色，F(xiàn)ABP-4蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)（圖4A，B），結(jié)果顯示胚胎組FABP-4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于成人組；成神經(jīng)分化誘導(dǎo)3周后，用免疫熒光染色法分別標(biāo)記神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白p75NTR和GFAP，胚胎組p75NTR和GFAP分別呈陽(yáng)性，而成人組p75NTR表達(dá)不明顯，GFAP表達(dá)呈陽(yáng)性，且表達(dá)強(qiáng)度高于胚胎組（圖5A，B，C，D）；成肌誘導(dǎo)第3周后，兩組細(xì)胞鈣調(diào)蛋白（Calponin）均呈陽(yáng)性表達(dá)（圖6A，B）。

圖3 真皮細(xì)胞成骨誘導(dǎo)（免疫熒光染色，×100）

圖4 真皮細(xì)胞成脂誘導(dǎo)（免疫熒光染色，×100）

圖5 真皮細(xì)胞成神經(jīng)誘導(dǎo)（免疫熒光染色，×100）

圖6 真皮細(xì)胞成肌誘導(dǎo)分化（免疫熒光染色，×100）

5 討論

再生醫(yī)學(xué)是利用人體的潛能，給其創(chuàng)造一個(gè)再生生理環(huán)境和激活因素，而后利用自身?xiàng)l件啟動(dòng)再生程序。再生醫(yī)學(xué)涉及身體的各個(gè)器官的再生修復(fù)，皮膚再生是其中一種，對(duì)于大面積燒傷或者其他皮膚疾病需要皮膚移植治療的臨床疾病，提供種子細(xì)胞是組織再生的根本，通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增種子細(xì)胞，再生或重建組織來(lái)修復(fù)受損器官。作為種子細(xì)胞，至少具有以下兩個(gè)特性即容易獲得和培養(yǎng)擴(kuò)增后保持多向分化潛能。通常情況下，皮膚組織容易得到，但是經(jīng)體外培養(yǎng)的細(xì)胞往往喪失其多向分化能力而達(dá)不到再生相應(yīng)組織的能力，所以，體外培養(yǎng)細(xì)胞的干性維持在皮膚再生過(guò)程中極其關(guān)鍵。以往研究顯示皮膚來(lái)源的祖細(xì)胞（SKP）具有多向分化潛能，然而SKP分離培養(yǎng)方法比較復(fù)雜，需要一定時(shí)間來(lái)擴(kuò)增。毛囊組織周?chē)嬖诟杉?xì)胞群包括毛乳頭細(xì)胞，從毛囊組織分離的干細(xì)胞在體外具有很強(qiáng)的分化潛能，因而比來(lái)源于皮膚其他部分更具有優(yōu)越性。然而傳統(tǒng)的顯微解剖法分離毛囊來(lái)源的干細(xì)胞如毛乳頭，分離勞動(dòng)強(qiáng)度大而且得到細(xì)胞較少等缺陷。本團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建了分離皮膚組織的簡(jiǎn)單方法，分離的胚胎頭皮細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增后，移植到體內(nèi)能再生帶有毛發(fā)等附屬器官的完整皮膚[11]，建議我們體外培養(yǎng)擴(kuò)增的胚胎細(xì)胞具有多向分化潛能，然而胚胎組織在臨床上不可能來(lái)源于自體細(xì)胞，加上倫理問(wèn)題以及成瘤的可能性，而限制其應(yīng)用。本文選擇具有毛囊的成人頭皮組織作為研究對(duì)象，分離頭皮組織的真皮細(xì)胞，并經(jīng)傳代培養(yǎng)擴(kuò)增后來(lái)研究其是否和源于胚胎組織細(xì)胞一樣，具有多向分化潛能。

首先，利用本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞創(chuàng)建的分離培養(yǎng)體系[11，15]，分離后的真皮細(xì)胞24h貼壁，初期，細(xì)胞呈圓形，貼壁4到5天傳代后，細(xì)胞形態(tài)均勻穩(wěn)定，變大變飽滿，成偏長(zhǎng)的三角形。免疫熒光染色標(biāo)記間充質(zhì)細(xì)胞的特異性表達(dá)蛋白vimentin 呈陽(yáng)性，而表皮細(xì)胞特異表達(dá)標(biāo)志蛋白Pan-CK表達(dá)為陰性，說(shuō)明分離出的細(xì)胞為真皮細(xì)胞，未有表皮細(xì)胞污染。以往的分離方法大多數(shù)是利用兩步酶消化法[12，13]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合傳統(tǒng)的細(xì)胞分離方法，改良為一步法，能簡(jiǎn)單有效地從成人皮膚組織分離表皮和真皮細(xì)胞[15]。然后，分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增和傳代，取第4代的真皮細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，免疫染色分化指標(biāo)顯示來(lái)自成人頭皮組織真皮細(xì)胞不僅能向成脂、成肌、成骨方向分化，并且能分化成神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 與胚胎頭皮的真皮細(xì)胞相比，盡管誘導(dǎo)分化效率相對(duì)較低，但來(lái)源于成人組織的真皮細(xì)胞具有很強(qiáng)的多向分化潛能。比較不同發(fā)育時(shí)期真皮細(xì)胞分化潛能的差異性，顯示：這種培養(yǎng)體系下兩種來(lái)源的真皮細(xì)胞均具有多向分化潛能，Junker等人已經(jīng)證實(shí)，真皮成纖維細(xì)胞具有向成脂、成肌、成骨及成軟骨方向分化的潛能，但向神經(jīng)細(xì)胞的分化能力報(bào)道較少，而且成人組織來(lái)源的細(xì)胞也研究較少[2-3，6-9，14，16]。本研究比較全面的顯示來(lái)源成人頭皮組織真皮成纖維細(xì)胞能向不同胚層包括外胚層的神經(jīng)細(xì)胞分化。該結(jié)果我們分離培養(yǎng)體系能培養(yǎng)擴(kuò)增多向分化潛能的皮膚真皮細(xì)胞。 考慮到胚胎來(lái)源細(xì)胞的倫理性及成人來(lái)源皮膚的廣泛性，成人組織來(lái)源的皮膚細(xì)胞實(shí)用價(jià)值更高，可作為皮膚再生基礎(chǔ)研究和自體細(xì)胞移植治療皮膚創(chuàng)傷成為的種子細(xì)胞。

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Culture-expanded adult dermal cells derived from scalp tissue are multi- differentiation potential

ZHOU Qian1, ZHANG Qun1, LENG Xue1,ZU Ting-jian1,QING Jing1, WEN Jie1, WU Xun-wei1,2
(1.Stomatological Hospital of Shandong University, Jinan, 250000;2. Su Zhou research institute of Shandong University Suzhou, 215000)

Objective The study was to explore that he potential of culture-expanded dermal cells derivedfrom adult scalp tissue in vitro differentiating into adipoblasts, nerve, osteoblasts and myofibroblasts, and it would provide a basis for the new source of seed cells for skin wound repair. Methods The dermal cells derived from adult and embryonic scalp tissues were respectively isolated and cultured in the media that could maintain cell multipotential. After 4th passage, the dermal cells were identified by detecting the expression of vimentin and pan-CK b y immunofluorescence staining. Thedirectional differentiation of dermal cells was induced by different conditioned media and the difference of multi-differentiation potential between adult and embryonic dermal cells was analyzed with detecting the expression of differentiation markers by immunofluorescence staining. Results The primary cells completely attached to the culture-dish within 24h after isolation and the cell shapes were irregular, most of which were spindle or polygonal shape. The cellular morphology became uniform after passages. Theimmunofluorescent staining results showed that these cells expressed mensenchymal marker vimentin, but didn’t express epidermal cell marker pan-CK . After cultured in inducing differentiation medium, both adult and embryonic cells were able to differentiate into osteoblasts, adipoblasts, nerveand myofibroblasts, although that the differentiation efficiency of adult dermal cell wass relatively lower compared to that of embryonic cells. Conclusion The adult dermal cells after culture-expanded in vitro were able to differentiate into different cell types and could maintain multi-differential potential. The adult issues are easy to access and obtain, therefore our results suggest the adult dermal cells are the ideal source cells for both basic research and clinical application in the field of skin tissue engineering and regeneration.

Embryo Adult； Dermal cell； vimentin； keratin； Multi-directional differentiation

10.19335/j.cnki.2096-1219.2017.03.01

蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（ZXY201441），江蘇省科技計(jì)劃項(xiàng)目（BK20161241）

周倩，女，碩士研究生；山東大學(xué)口腔醫(yī)院，助理工程師。研究方向：毛發(fā)再生新技術(shù)。吳訓(xùn)偉，男，研究員，博導(dǎo)；山東大學(xué)口腔醫(yī)院；研究方向：皮膚和毛發(fā)再生新技術(shù)及其應(yīng)用研究。