徐櫻溪，趙 晴，孫 燦，車千紅，付 瑜，丁 丁，孔 娟

·論著·

維生素D受體對(duì)內(nèi)毒素感染小鼠肺組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)的影響

徐櫻溪，趙 晴，孫 燦，車千紅，付 瑜，丁 丁，孔 娟*

目的 研究維生素D受體(Vitamin D receptor,VDR)對(duì)內(nèi)毒素感染小鼠肺組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)的影響。方法 隨機(jī)選取15只C57BL/6源性的野生小鼠(WT組)和15只VDR敲除小鼠(KO組),予LPS腹腔注射并分別于注射前及注射后8、16 h各組隨機(jī)選取5只小鼠,比較兩組小鼠一般狀態(tài)的變化;實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定兩組小鼠肺組織中血管緊張素原(AGT)、腎素(Renin)、腎素受體(ReninR)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、血管緊張素Ⅱ-1型受體(AT1R)mRNA的表達(dá)水平及支氣管肺泡灌洗液中AngⅡ水平及Renin活性變化情況。結(jié)果 一般狀態(tài)比較,注射LPS后，兩組小鼠均出現(xiàn)不良反應(yīng),KO組較WT組不良反應(yīng)癥狀明顯。LPS注射前,KO組肺組織中ACE、AngⅡ的mRNA表達(dá)水平較WT組升高(P<0.05),LPS注射后8、16 h時(shí),KO組肺組織中Renin、ACE、AngⅡ、AT1R水平及肺泡灌洗液中AngⅡ水平、Renin活性均明顯高于WT組(P<0.01),LPS注射16 h時(shí),KO組AGT水平明顯高于WT組(P<0.01)。結(jié)論 維生素D受體在內(nèi)毒素感染時(shí)抑制肺組織中腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活,進(jìn)而對(duì)肺組織起到保護(hù)作用。

維生素D受體;內(nèi)毒素;腎素-血管緊張素系統(tǒng)

0 引言

維生素D受體(Vitamin D receptor,VDR)屬于核受體超家族成員之一,主要參與機(jī)體鈣磷代謝平衡的調(diào)節(jié),也通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，影響相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成發(fā)揮其重要作用。VDR廣泛存在于各種組織和器官中,與活化的1,25(OH)維生素D結(jié)合,調(diào)節(jié)下游信號(hào)系統(tǒng),從而在抑制炎性反應(yīng)、免疫調(diào)控、抗纖維化、抑制腫瘤等多個(gè)方面發(fā)揮積極的作用[1-5]。目前相關(guān)研究表明,維生素D與COPD[6-7]、哮喘[8]、結(jié)核病[9]、急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)[10-13]等許多肺部疾病相關(guān),然而其相關(guān)機(jī)制仍不清楚。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)是由血管緊張素原(Angiotensinogen,AGT)、血管緊張素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ,AngⅠ)、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)、腎素(Renin)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-converting enzyme,ACE)等一系列成分構(gòu)成,其中AGT與Renin結(jié)合轉(zhuǎn)化為AngⅠ,ACE將AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ,AngⅡ是RAS的主要效應(yīng)蛋白,與受體結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)作用。這個(gè)系統(tǒng)的經(jīng)典功能是通過AngⅡ與受體結(jié)合調(diào)節(jié)血壓和水鈉平衡,近年來發(fā)現(xiàn)，RAS參與調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥、免疫、凋亡、組織修復(fù)、生殖發(fā)育、神經(jīng)傳導(dǎo)等多種生理活動(dòng)[14-17],也參與了肺動(dòng)脈高壓、肺纖維化、肺血栓栓塞,特別是ALI/ARDS等肺部疾病的發(fā)生和發(fā)展[18],因此，RAS是機(jī)體的重要調(diào)節(jié)系統(tǒng)。有研究也已經(jīng)關(guān)注到VDR對(duì)RAS中的腎素和AngⅡ在肺損傷時(shí)變化的影響[19],但VDR信號(hào)系統(tǒng)在內(nèi)毒素對(duì)肺組織誘發(fā)炎癥反應(yīng)時(shí)RAS中的各個(gè)成分的變化情況,目前還沒有系統(tǒng)的研究報(bào)道。

本研究將內(nèi)毒素感染VDR受體敲除鼠和野生鼠的RAS各個(gè)成分的變化情況進(jìn)行對(duì)比,以探討內(nèi)毒素感染時(shí)VDR對(duì)肺組織RAS的影響,為進(jìn)一步研究維生素D及其信號(hào)系統(tǒng)對(duì)肺組織的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理方法 隨機(jī)選取15只C57BL/6源性的野生小鼠(WT組)和15只VDR敲除小鼠(KO組),體重20～25 g,性別不限,室溫飼養(yǎng)。WT組飼料為普通動(dòng)物飼料,自由飲水進(jìn)食,KO組為了防止低血鈣發(fā)生,給予高鈣飲食(Harlan Teklad TD96348:20%乳糖,2%鈣,1.25%磷),2～3月齡時(shí)予LPS以15 mg/kg腹腔注射并各組隨機(jī)選取5只小鼠,分別于注射前及注射后8、16 h處死取材。

1.2 各組小鼠肺組織RAS成分測(cè)定 應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定兩組小鼠LPS注射前及注射后8、16 h肺組織中AGT、Renin、ReninR、ACE、AngⅡ、AT1R mRNA的表達(dá)水平。將小鼠肺組織提出后,用TRizol法按照試劑說明書提取總RNA,用美國(guó)Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Primer 3.0設(shè)計(jì)合成特異性引物(表1)。

表1 RAS引物序列

1.3 支氣管肺泡灌洗液中AngⅡ測(cè)定 將小鼠頸椎脫臼致死,切開頸部暴露氣管,置管,以PBS液0.8 mL/只進(jìn)行支氣管肺泡灌洗2次,回收灌洗液1.4 mL,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定灌洗液,使用Human/Mouse/Rat Angiotensin Ⅱ Enzyme Immunoassay Kit (Ray Biotech,Inc),按照試劑說明測(cè)定支氣管肺泡灌洗液中血管緊張素Ⅱ的濃度。

1.4 支氣管肺泡灌洗液中腎素活性測(cè)定 將小鼠頸椎脫臼致死,切開頸部暴露氣管,置管,以PBS緩沖液0.8 mL/只進(jìn)行支氣管肺泡灌洗2次,回收灌洗液1.4 mL,應(yīng)用熒光法Sensolyte 520 Mouse Renin Assay Kit (AnaSpec,Inc),按照試劑說明測(cè)定支氣管肺泡灌洗液中腎素活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組之間均數(shù)的比較符合正態(tài)分布具有方差齊性選用方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)比較 WT組小鼠注射LPS 4 h后，10只小鼠開始逐漸出現(xiàn)皮膚潮濕,倦怠,活動(dòng)能力下降,進(jìn)食及進(jìn)水量進(jìn)行性下降,呼吸深大。KO組小鼠注射LPS 2 h后，10只小鼠開始逐漸出現(xiàn)皮膚潮濕,倦怠,活動(dòng)能力明顯下降,不能正常行走,進(jìn)食及進(jìn)水量進(jìn)行性下降,腹瀉明顯,呼吸深大；14 h后出現(xiàn)呼吸困難。注射16 h內(nèi)WT組及KO組小鼠均無死亡發(fā)生。

2.2 各組小鼠肺組織中RAS各成分比較 LPS注射前，KO組肺組織中ACE、AngⅡ的mRNA表達(dá)水平較WT組升高(P<0.05);LPS注射后8、16 h,KO組肺組織中Renin、ACE、AngⅡ、AT1R水平均明顯高于WT組(P<0.01)。LPS注射后8 h,KO組肺組織中AGT與WT組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而16 h時(shí)KO組肺組織中AGT水平明顯高于WT組(P<0.01)。LPS注射前及注射后8、16 h時(shí)，WT組與KO組肺組織中ReninR水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.3 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中AngⅡ比較 處理前兩組小鼠支氣管肺泡灌洗液中AngⅡ含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),注射LPS 8、16 h后,KO組小鼠肺泡灌洗液AngⅡ含量較WT組明顯升高(P<0.01)。見圖2。

2.4 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中腎素活性比較 處理前兩組小鼠支氣管肺泡灌洗液中腎素活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),注射LPS 8、16 h后,KO組小鼠支氣管肺泡灌洗液中腎素活性較WT組明顯升高(P<0.01)。見圖3。

3 討論

RAS是機(jī)體重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對(duì)肺組織細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用,其在內(nèi)毒素所致肺組織感染中的作用也日益受到關(guān)注。內(nèi)毒素感染時(shí)，各種損傷刺激因素可直接或間接地通過其他細(xì)胞因子改變肺組織RAS各成分活性,同時(shí)RAS各成分的變化情況又可反作用于肺組織,進(jìn)一步影響炎癥感染的轉(zhuǎn)歸[20-21],因此，肺組織中RAS各成分的變化情況對(duì)肺組織的影響尤為重要。

圖1 各組小鼠肺組織中RAS比較

圖2 各組小鼠肺泡灌洗液中AngⅡ比較

圖3 各組小鼠肺泡灌洗液中腎素活性比較

本研究中,基礎(chǔ)狀態(tài)下測(cè)定KO組及WT組小鼠肺組織RAS各成分的情況發(fā)現(xiàn)，VDR敲除小鼠肺組織ACE及AngⅡ水平高于野生小鼠。AngⅡ能夠通過AT1R直接作用或通過TGF-β通路激活結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)等促炎因子[22]誘發(fā)炎癥反應(yīng)。ACE及AngⅡ生產(chǎn)增多也能刺激血管組織膠原生成及基質(zhì)重構(gòu)，減少?gòu)椓Φ鞍缀铣?，抑制血管?nèi)部一氧化氮(NO)信號(hào)通路傳導(dǎo),對(duì)血管產(chǎn)生進(jìn)一步損傷[23]。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，RAS中ACE及AngⅡ的升高可能提示VDR敲除小鼠較普通野生小鼠更易發(fā)生肺部炎癥感染及肺組織內(nèi)皮血管的損傷。

針對(duì)兩組小鼠一般狀態(tài)的比較我們發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素感染后KO組小鼠深大呼吸的出現(xiàn)較WT組更早,且KO組小鼠出現(xiàn)了明顯的呼吸困難。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素感染后VDR敲除鼠72 h后全部出現(xiàn)死亡,而正常對(duì)照組在96 h仍有60%存活[19]。本研究中VDR敲除小鼠沒有出現(xiàn)死亡,可能與本研究觀察時(shí)間較短有關(guān)。兩組小鼠一般狀態(tài)的改變提示內(nèi)毒素感染對(duì)VDR敲除鼠的不良影響更為嚴(yán)重。

本研究結(jié)果顯示，在內(nèi)毒素感染前、感染后8 h，VDR敲除鼠肺組織中AGT含量與正常野生鼠之間并無明顯差異,感染后16 h，兩組小鼠肺組織AGT含量出現(xiàn)顯著差異。AGT的啟動(dòng)子區(qū)含有NF-κB結(jié)合序列,故其轉(zhuǎn)錄受到NF-κB的調(diào)控,VDR信號(hào)傳導(dǎo)可通過阻斷NF-κB活化從而使AGT的表達(dá)減弱[24]。VDR敲除小鼠NF-κB活化增強(qiáng),但在早期并未明顯影響AGT的變化,隨著感染進(jìn)一步加重，AngⅡ迅速升高，進(jìn)一步激活NF-κB,對(duì)AGT形成正反饋,使VDR敲除鼠肺組織AGT表達(dá)較野生小鼠明顯增加。內(nèi)毒素感染后8、16 h,肺組織中Renin含量出現(xiàn)明顯上升,且KO組較WT組上升更為顯著。由于肺組織中ACE含量較多,AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ速度非?？?肺組織AngⅠ含量非常少而難以測(cè)定,所以本研究中未對(duì)AngⅠ進(jìn)行監(jiān)測(cè)。Renin與ReninR結(jié)合后可誘導(dǎo)其自身活化,并促使AGT向AngⅠ、Ⅱ轉(zhuǎn)化,即AngⅡ依賴性信號(hào)途徑,而ReninR本身不發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。但隨著研究的深入，有報(bào)道，ReninR還能激活細(xì)胞內(nèi)非AngⅡ依賴性信號(hào)途徑,其本身在介導(dǎo)病理損傷也中發(fā)揮重要作用[25],而本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素感染后，肺組織ReninR未見明顯上升,且KO組與WT組小鼠肺組織含量也無顯著差異,考慮可能由于觀察時(shí)間較短，ReninR尚未激活,或者與VDR對(duì)其影響較小有關(guān)。對(duì)于VDR敲除小鼠，ReninR在內(nèi)毒素感染后肺組織的變化情況還需要更多的研究進(jìn)一步探討，以明確其變化及機(jī)制。肺組織毛細(xì)血管是合成釋放ACE的主要部位,ACE的檢測(cè)可作為肺組織內(nèi)皮損傷的早期指標(biāo),本研究發(fā)現(xiàn)，雖然在基礎(chǔ)狀態(tài)下兩組小鼠肺組織中ACE、AngⅡ水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但內(nèi)毒素感染后兩組小鼠肺組織中ACE、AngⅡ含量差異進(jìn)一步增加，而且，在內(nèi)毒素感染16 h時(shí)，KO組小鼠肺組織中ACE含量與8 h比較明顯上升；而WT組隨時(shí)間變化，小鼠肺組織中ACE含量無明顯變化?？紤]ACE的顯著增加提示VDR敲除小鼠在內(nèi)毒素感染早期內(nèi)皮細(xì)胞受損更為嚴(yán)重,且隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，ACE正反饋調(diào)節(jié)對(duì)肺組織損傷持續(xù)加重。平滑肌細(xì)胞內(nèi)多種與炎癥密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活,可使多種細(xì)胞間黏附分子、炎性細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)顯著增高,提示AngⅡ可能在炎癥反應(yīng)的機(jī)制中起著重要的作用,ALI時(shí)肺組織和血漿中AngⅡ的濃度表達(dá)水平與肺損傷程度呈正相關(guān)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)毒素感染后8、16 h,KO組AT1R較WT組出現(xiàn)明顯上升。AngⅡ主要通過與組織細(xì)胞特異性受體結(jié)合而發(fā)揮作用,在肺組織中，AngⅡ的作用主要是由AT1R介導(dǎo),而VDR的缺失使肺組織AT1R含量增加，進(jìn)一步加重了肺損傷的程度。內(nèi)毒素感染后，VDR的缺失導(dǎo)致RAS各成分表達(dá)升高,Renin-ACE-AngⅡ-AT1R軸通過多種途徑促進(jìn)肺組織炎癥反應(yīng)。組織水腫和纖維化的發(fā)生,形成了正向調(diào)節(jié)，使RAS進(jìn)一步活化,對(duì)肺損傷起促進(jìn)作用,使肺損傷癥狀加重,從而進(jìn)一步證實(shí)VDR在內(nèi)毒素感染后抑制了RAS發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng),從而起到對(duì)肺組織的保護(hù)作用。

本研究中，LPS腹腔注射8、16 h時(shí)，KO組支氣管肺泡灌洗液中RAS主要的效應(yīng)成分AngⅡ和腎素活性較WT組明顯升高(P<0.01)。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)，VDR敲除小鼠炎癥細(xì)胞因子及趨化因子水平增高,肺泡上皮緊密連接受到破壞,閉合蛋白及緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)下降,可使其表現(xiàn)出更嚴(yán)重的肺部炎性損傷[27]。也有研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)血管生成素-2(Ang-2)表達(dá)，從而激活A(yù)ng-2-Tie-2信號(hào)通路,而VDR信號(hào)系統(tǒng)可以通過靶向調(diào)節(jié)Ang-2-Tie-2-MLCK通路保護(hù)肺血管屏障的完整性。VDR敲除小鼠內(nèi)毒素感染后，支氣管肺泡灌洗液中腎素活性明顯增加[19]，與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述,維生素D受體在內(nèi)毒素感染小鼠肺組織中抑制了RAS的激活,進(jìn)一步證明了維生素受體及其信號(hào)系統(tǒng)在內(nèi)毒素感染時(shí)對(duì)肺組織的保護(hù)作用。

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Effects of vitamin D receptor on renin-angiotensin system in lung tissue of mice infected by LPS

XU Ying-xi,ZHAO Qing,SUN Can,CHE Qian-hong,FU Yu,DING Ding,KONG Juan*

(Department of Clinical Nutrition,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To study the effects of vitamin D receptor on the renin-angiotensin system in lung tissue of mice infected by LPS.Methods Fifteen C57BL/6 wild-type mice (WT group) and fifteen VDR-knockout mice (KO group) were randomly selected to receive intraperitoneal injection of LPS.Five mice were randomly selected from each group before and at 8,16 hours after injection respectively.The state of mice in two groups were evaluated and recorded.The levels of angiotensin (AGT),renin (Renin),renin receptor (ReninR),angiotensin converting enzyme (ACE),angiotensin Ⅱ (AngⅡ),and angiotensin Ⅱ-type 1 receptor (AT1R) mRNA expression level of the lung tissue,the AngⅡ levels and renin activity of bronchoalveolar lavage fluid were measured.All the experimental data of the two groups were compared.Results With regard to the general state after injection of LPS,both two groups had adverse reactions and adverse reactions of symptom in KO group were more obvious.Before the injection of LPS,the levels of ACE and AngⅡ of the lung tissue in KO group were higher than those of WT group (P<0.05).At 8 h and 16 h after injection of LPS,the levels of renin,ACE,AngⅡ and AT1R of the lung tissue and the AngⅡ levels,Renin activity of bronchoalveolar lavage fluid in KO group were significantly higher than those of WT group (P<0.01).The level of AGT in KO group was significantly higher than that of WT group at 16 h after injection (P<0.01).Conclusion Vitamin D receptors may inhibit the activation of the renin-angiotensin system in lung tissue infected by LPS and protect the lung tissue.

Vitamin D receptor;LPS;Renin-angiotensin system

2016-12-15

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科,沈陽 110004

國(guó)家自然科學(xué)基金(81570811);遼寧省攀登學(xué)者計(jì)劃;遼寧省十百千計(jì)劃

10.14053/j.cnki.ppcr.201705001

*通信作者