劉春平，王 韋，程 卓，趙 琳，黃 雪，盧延斌

(浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，杭州310012)

超高效液相色譜法測定羊棲菜中巖藻甾醇的含量

劉春平，王 韋，程 卓，趙 琳，黃 雪，盧延斌*

(浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，杭州310012)

采用超高效液相色譜法測定羊棲菜中巖藻甾醇的含量。羊棲菜試樣(2.000 0 g)經(jīng)甲醇-二氯甲烷(1+1)混合液提取，所得提取液以YMC-Pack ODS-A色譜柱為分離柱，以甲醇-乙腈(3 +7)混合液為流動(dòng)相，在檢測波長210 nm處進(jìn)行測定。巖藻甾醇的質(zhì)量濃度在0.5～400 mg· L－1內(nèi)與其對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，檢出限(3S/N)為0.16 mg·L－1。在25，50，100 mg·L－1等3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率在91.2%～96.8%之間。測定值的日內(nèi)及日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)分別在1.1%～5.4%，2.8%～7.0%之間。

超高效液相色譜法;羊棲菜;巖藻甾醇

羊棲菜隸屬褐藻門馬尾藻科，是一種暖溫帶-亞熱帶性海藻，適宜生長在海水透明度較高、營養(yǎng)鹽量豐富的海域。在日本，羊棲菜被冠以“海上參”及“長壽菜”的稱號，身價(jià)為海帶的數(shù)倍。除了作為食材，羊棲菜已被《中國藥典》收藏為藥用［1］，并且成功地應(yīng)用到調(diào)味品、休閑食品、保健食品以及相關(guān)的藥品等產(chǎn)業(yè)［2-3］。目前伴隨著海洋生物資源的開發(fā)熱潮，羊棲菜憑借營養(yǎng)價(jià)值高以及富含生物活性物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)必將引起研究人員的高度重視。

巖藻甾醇是一種重要的生物活性物質(zhì)，在羊棲菜中含量較低。有報(bào)道以80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液對羊棲菜進(jìn)行回流浸提后，用分光光度法測得巖藻甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.34%［4］。研究表明，羊棲菜中的微量巖藻甾醇具有保持生物內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)節(jié)膽固醇、降低血糖含量及抗氧化等多種生理功能［5-7］。羊棲菜中植物甾醇可以作為肝臟X受體(LXR)激動(dòng)劑，明顯降低膽固醇［8］。因此，對巖藻甾醇進(jìn)行相應(yīng)的定性及定量分析不可或缺。已知的植物甾醇測定方法有很多，其中傳統(tǒng)的測定方法有分光光度法［9］、薄層層析法［9-10］、紅外光譜法［10］以及重量法［11］等，上述方法僅適用于測定植物甾醇的總量，很難特異性地針對某一種植物甾醇進(jìn)行測定。

本工作通過優(yōu)化流動(dòng)相流量和檢測波長等色譜分離條件，提出了超高效液相色譜法(UHPLC)測定羊棲菜中巖藻甾醇的含量，并進(jìn)行了有效性驗(yàn)證。

圖1 色譜圖Fig.1 Chromatograms

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITYTMUPLC型超高效液相色譜儀，配自動(dòng)進(jìn)樣器;Milli-Q型凈水系統(tǒng)。

巖藻甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:500 mg·L－1，稱取巖藻甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于93%)10.0 mg，用甲醇20 mL溶解配制。密封儲(chǔ)存于4℃冰箱中，使用時(shí)稀釋至所需質(zhì)量濃度。

流動(dòng)相用的甲醇、乙腈均為色譜純，提取用的甲醇和二氯甲烷為分析純，試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

YMC-Pack ODS-A色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為室溫;流動(dòng)相為甲醇-乙腈(30+70)混合液，等度洗脫;流量0.8 mL·min－1;進(jìn)樣量10 μL;檢測波長210 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

將采購的羊棲菜濕樣經(jīng)水洗、切碎等處理后置于55℃真空烘箱中恒溫烘干至恒重，研制成粉末狀，用樣品袋密封，在避光低溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取羊棲菜干粉試樣2.000 0 g于250 mL圓底燒瓶中，按料液比1 g/22 mL加入甲醇-二氯甲烷(1 +1)混合液，于70℃恒溫水浴鍋中加熱回流提取90 min，所得溶液在4℃溫度下，以5 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，用甲醇溶解，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾后，按儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按儀器工作條件分別對巖藻甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液及羊棲菜粗提物進(jìn)行測定，其色譜圖見圖1。

由圖1可知:巖藻甾醇與其他組分得到了較好的分離，即試驗(yàn)建立的高效液相色譜方法適用于巖藻甾醇的檢測。

2.2 巖藻甾醇提取條件的選擇

試驗(yàn)考察了乙醇、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷以及丙酮等5種提取劑的提取效率，并綜合溶劑毒性等因素，選擇甲醇-二氯甲烷(1+1)混合液作為羊棲菜中巖藻甾醇的提取劑。

試驗(yàn)進(jìn)一步對提取次數(shù)、溫度、時(shí)間、料液比分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究各因素對巖藻甾醇提取率的影響。在確定提取次數(shù)為2次的前提下，以料液比、提取時(shí)間、提取溫度作為試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，通過回歸方程及Design-Expert軟件分析得到巖藻甾醇回流提取的最優(yōu)工藝條件為:料液比1 g/21.89 mL，提取時(shí)間89.58 min，提取溫度69.28℃。考慮到可操作性，試驗(yàn)將料液比調(diào)整為1 g/22 mL，提取時(shí)間90 min，提取溫度為70℃，并在此提取條件下進(jìn)行3次平行提取試驗(yàn)，其偏差為2.1%，從而驗(yàn)證該響應(yīng)面模型及其所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 儀器工作條件的選擇

2.3.1 流動(dòng)相及洗脫方式

流動(dòng)相的選擇將直接影響到目標(biāo)化合物的峰形及分離效果，是液相色譜分離技術(shù)中最重要的參數(shù)之一。羊棲菜中巖藻甾醇的含量相對較低，而且所含雜質(zhì)種類繁雜，同時(shí)巖藻甾醇自身有多種同分異構(gòu)體存在，這些因素都對色譜分離造成了一定困難。此外，為了減少試劑對儀器的損壞，應(yīng)避免使用二氯甲烷、異丙醇等試劑，而改用甲醇、乙腈及水等試劑。優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，有水相參與或梯度洗脫時(shí)巖藻甾醇分離效果不太理想，而單一的有機(jī)溶劑經(jīng)等度洗脫所產(chǎn)生的分離效果較好。試驗(yàn)選擇以甲醇-乙腈(3+ 7)混合液作為流動(dòng)相并等度洗脫進(jìn)行羊棲菜中巖藻甾醇的測定。

2.3.2 檢測波長

由試驗(yàn)可知:在210～400 nm的二極管陣列檢測器檢測波長內(nèi)，巖藻甾醇在波長210 nm處有最大吸收［12］，試驗(yàn)選擇檢測波長為210 nm。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按儀器工作條件對0.5，1，10，50，100，200，400 mg·L－1的巖藻甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以巖藻甾醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:巖藻甾醇的質(zhì)量濃度在0.5～400 mg·L－1內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=1.161×104x+7.621×103，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

以3倍的信噪比所對應(yīng)的質(zhì)量濃度計(jì)算方法的檢出限(3S/N)為0.16 mg·L－1，以10倍的信噪比所對應(yīng)的質(zhì)量濃度計(jì)算方法的測定下限(10S/N)為0.53 mg·L－1。

2.5 回收試驗(yàn)

向羊棲菜粗提物中添加25，50，100 mg·L－1的巖藻甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按儀器工作條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of test for recovery(n=6)

由表1可知:樣品的回收率在91.2%～96.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.2%～6.3%之間。

2.6 精密度試驗(yàn)

在1 d內(nèi)對樣品及各加標(biāo)溶液分別按試驗(yàn)方法連續(xù)測定6次，計(jì)算RSD可得日內(nèi)精密度;對樣品及各加標(biāo)溶液分別按試驗(yàn)方法連續(xù)測定6 d，計(jì)算RSD即得出日間精密度，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of test for precision(n=6)

由表2可知:樣品及不同加標(biāo)溶液的日內(nèi)及日間精密度范圍分別為1.1%～5.4%，2.8%～7.0%。說明方法用于檢測羊棲菜中巖藻甾醇的含量時(shí)，其日內(nèi)及日間精密度均良好。

2.7 樣品分析

按試驗(yàn)方法對羊棲菜樣品進(jìn)行分析，測得巖藻甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為610μg·g－1。

本工作建立了超高效液相色譜法測定羊棲菜中巖藻甾醇含量的分析方法，并驗(yàn)證了方法的有效性。研究表明，羊棲菜中巖藻甾醇含量較低，但巖藻甾醇的分離效果良好，且方法回收率高，重復(fù)性好，具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，適用于羊棲菜中巖藻甾醇的檢測。另外，該方法很好地彌補(bǔ)了重量法等傳統(tǒng)方法只能對總甾醇含量進(jìn)行測定的不足，能有效地檢測單一植物甾醇的含量。

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UHPLC Determination of Fucosterol in Sargassum Fusiforme

LIU Chunping，WANG Wei，CHENG Zhuo，ZHAO Lin，HUANG Xue，LU Yanbin*
(Marine Food Research Institute，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310012，China)

UHPLC was applied to the determination of fucosterol in Sargassum fusiforme.The Sargassum fusiforme sample(2.000 0 g)was extracted with mixed solution of methanol and dichloromethane(1+1).In the HPLC separation YMC-Pack ODS-A chromatographic column was used as stationary phase，and a mixture of methanol and acetonitrile(3+ 7)was used as mobile phase.UV-detection at 210 nm was adopted in the determination.Linear relationship between values of peak area and mass concentration of fucosterol was kept in the range of 0.5－400 mg·L－1with detection limit (3S/N)of 0.16 mg·L－1.Tests for recovery were made by standard addition method at the concentration levels of 25，50，100 mg·L－1，giving values of recovery in the range of91.2%－96.8%.Values of intra-day an inter-day RSD's(n =6)found were in the ranges of 1.1%－5.4%，and 2.8%－7.0%respectively.

UHPLC;sargassum fusiforme;fucosterol

O652.63

A

1001-4020(2017)05-0548-04

10.11973/lhjy-hx201705011

2016-05-13

浙江自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY15C200004)

劉春平(1991－)，女，浙江溫州人，碩士研究生，主要從事海洋食品活性成分研究

*通信聯(lián)系人。luyanbin@mail.zjgsu.edu.cn