徐麗晶, 孫 暢, 陸濤峰, 陳洪巖, 趙麗麗

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室/黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室, 實驗動物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊,哈爾濱 150069; 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030)

應(yīng)用PCR方法快速鑒定SPF金定鴨性別

徐麗晶1,2, 孫 暢1, 陸濤峰1, 陳洪巖1, 趙麗麗1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室/黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室, 實驗動物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊,哈爾濱 150069; 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030)

目的 利用PCR方法鑒定SPF金定鴨的性別。方法 根據(jù)已有報道合成一對禽類性染色體上的染色質(zhì)解螺旋蛋白DNA結(jié)合蛋白1(CHD1)基因的通用引物gCHD。采集培育中的85只SPF金定鴨血液樣品, 提取血液基因組DNA, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳后的條帶數(shù)判定禽類性別。結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分析后, 雌性鴨樣品擴(kuò)增出CHD1-Z和CHD1-W, 而雄性鴨樣品只出現(xiàn)CHD1-Z 。結(jié)論 本文建立的方法可作為禽類性別的有效鑒定方法。

SPF金定鴨; 性別鑒定; PCR

SPF金定鴨飼養(yǎng)繁育過程中，根據(jù)不同的生產(chǎn)需求，需要對金定鴨的性別進(jìn)行鑒定。提前鑒定SPF金定鴨性別，不僅能夠為飼養(yǎng)提供合理指導(dǎo)，也能滿足科研領(lǐng)域區(qū)分禽類性別的需求。目前鑒定禽類性別的分子生物學(xué)方法有很多，如外觀鑒定方法、鳴管鑒定方法、肛門揉捏鑒定方法和肛門反轉(zhuǎn)鑒定方法等。其中外觀及鳴管鑒定法得到的結(jié)果準(zhǔn)確率較低，在禽類性別鑒定中應(yīng)用較少。肛門反轉(zhuǎn)鑒定方法常被用于禽類性別鑒定，但由于肛門反轉(zhuǎn)鑒定方法操作規(guī)范較復(fù)雜，對個體的應(yīng)激較大且鑒定錯誤率較高[1,2]。PCR技術(shù)因其操作簡便、靈敏度高，只需從羽毛、血液和胚胎中提取微量DNA樣品即可完成性別鑒定而被廣泛應(yīng)用于遺傳育種的實驗研究中[3-5]。

家禽的性別由W和Z染色體決定。雌性和雄性基因型分別為ZW和ZZ類型。而傳播給子代的Z和W的概率相同，都是50%[2,6,7]。本研究根據(jù)劉宏祥等[8]對禽類性染色體上的CHD1基因，設(shè)計了一對引物并通過擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳后的條帶數(shù)目和大小來快速、準(zhǔn)確地鑒定禽類的性別。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF金定鴨血液樣本由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心[SCXK(黑)2011-007]提供,其中F0代金定鴨27羽, 年齡98周, 體質(zhì)量3 kg。F1代金定鴨58羽, 年齡45周, 體質(zhì)量2.0～2.5 kg。每個樣品由鴨翅靜脈分別取1～2 mL抗凝血，存于-20℃冰箱備用。

1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker購自寶生生物工程(大連)有限公司；血液基因組DNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司(D3392-01)，其它常規(guī)分子試劑購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

參照文獻(xiàn)合成禽類的通用引物gCHD[8]，由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成，CHD1-Z: 5'-TGCAGAAGCAATATTACAAGT-3', 467 bp CHD1-W: 5'-AATTCATTATCATCTGGTGG-3', 326 bp

1.4 血液基因組的提取

用血液基因組DNA提取試劑盒提取血液DNA樣本。

1.5 PCR擴(kuò)增及檢測

PCR 反應(yīng)體系：共25 mL，2×Premix Taq 12.5 mL，ddH2O 8.5 mL, 上下游引物(10 pmol/L)各1 mL, 提取的DNA 模板 2 mL。PCR反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性 30 s, 51 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 30 s，35個循環(huán); 72 ℃延伸 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.6 性別鑒定

將PCR產(chǎn)物經(jīng)過質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，根據(jù)條帶數(shù)目及分子量，判定個體的性別，并與通過翻肛法及常規(guī)方法鑒定的性別進(jìn)行對照，比較兩種方法的優(yōu)劣。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測

將PCR產(chǎn)物經(jīng)過質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果以1-10號鴨為例(圖1)。

2.2 性別鑒定結(jié)果

通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠電泳對85只SPF金定鴨進(jìn)行性別鑒定，以翻肛法及常規(guī)方法對相同SPF金定鴨個體進(jìn)行性別鑒定，將兩種方法得到的結(jié)果進(jìn)行對照。結(jié)果顯示，PCR鑒定與翻肛法及常規(guī)方法相比一致(符合率達(dá)100%)(表1)。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

表1 翻肛法及常規(guī)方法與PCR鑒定法對金定鴨性別判定結(jié)果比較

3 討論

本實驗根據(jù)已有文獻(xiàn)報道[8]，合成一對禽類的通用引物gCHD，選取F0和F1代共85只SPF金定鴨，運(yùn)用PCR方法對其進(jìn)行性別鑒定，并將翻肛法及性狀觀察法所獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明兩者符合率100%。說明PCR方法可以用于SPF金定鴨的性別，且靈敏度準(zhǔn)確率均較高。王利紅等[9]根據(jù)已報道的位于家禽W染色體上保守的特異性基因片段對番鴨進(jìn)行了性別鑒定，得到的結(jié)果也充分證明了PCR方法準(zhǔn)確度高，可以用于番鴨性別鑒定。胡艷等[10]也利用CHD1基因序列的DNA擴(kuò)增片段長度多態(tài)性特點(diǎn)，成功獲得引物，并通過實例驗證了PCR方法在家鴨性別鑒定中的有效性和準(zhǔn)確性。綜合以上的實驗結(jié)果和文獻(xiàn)報道，可以認(rèn)為PCR方法是一種可靠的鑒定方法，能夠用于SPF金定鴨的性別鑒定。

劉鑄等[13]和李明等[14]曾利用朱鹮的近緣種東方白鸛W性染色體上的性別相關(guān)基因設(shè)計引物，用PCR方法成功擴(kuò)增出朱鹮的性別相關(guān)基因, 對朱鹮性別進(jìn)行了鑒定。同時他們還將其序列與其他5種遠(yuǎn)源鳥類相應(yīng)序列進(jìn)行分析, 證實了PCR方法在鳥類性別鑒定中的科學(xué)性和可信性。一些學(xué)者[11,15,16],同樣應(yīng)用PCR方法對國家一級保護(hù)鳥類進(jìn)行了性別鑒定，其準(zhǔn)確率高達(dá) 99%～100%。Grifiths等[17]描述了利用PCR技術(shù)鑒定雞胚性別的方法，證實了PCR方法能夠用于雞胚性別鑒定。這些報道都充分說明了，PCR方法不僅可用于家禽及水禽的性別鑒定，還可用于國家保護(hù)鳥類的性別鑒定。

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Application of PCR Method for Rapid Sex Determination in SPF Jinding Duck

XU Li-jing1,2, SUN Chang1, LU Tao-feng1, CHEN Hong-yan1, ZHAO Li-li1
(1. Division of Laboratory Animal and Comparative Medicine, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comparative Medicine, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China;
2. College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

ObjectiveTo determine the sex of SPF Jinding Duck, the universal primer gCHD of avian chromosomal DNA-binding protein 1 (CHD1) gene on avian chromosomes were synthesized .MethodsBlood of 85 SPF Jinding Duck were collected and genomic DNA was extracted for PCR amplification. The sex of the birds were determined by analyzing the number of bands after gel electrophoresis .ResultsThe CHD1-Z and CHD1-W were found in the PCR products of agarose gel electrophoresis from females and CHD1-Z was from males .ConclusionsThe PCR can be used as an effective method for sex identification in birds.

SPF Jinding ducks; Sex identification; PCR

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0249-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.016

2017-04-06

國家科技支撐計劃(2015BAI07B02-02); 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(Y2016PT41); 黑龍江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目(ZD2016006)

徐麗晶(1990-), 女, 碩士研究生。研究方向: 動物學(xué)。E-mail: 602943167@qq.com

趙麗麗(1983-), 女, 博士, 助理研究員。研究方向:獸醫(yī)微生物和免疫學(xué)。E-mail: zhaolili213@163.com