郝 鳳，劉曉靜，范俊俊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 甘肅 蘭州 730070)

NO3--N/NH4+-N不同配比下紫花苜蓿氮代謝關(guān)鍵酶及鉬、鐵元素含量研究

郝 鳳，劉曉靜，范俊俊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 甘肅 蘭州 730070)

以西北地區(qū)廣泛種植的優(yōu)質(zhì)植物性蛋白飼料紫花苜?！案兽r(nóng)3號”為試驗材料，在室外防雨網(wǎng)室內(nèi)，采用盆栽營養(yǎng)液沙培法，在適宜氮素供應(yīng)水平210 mg·L-1基礎(chǔ)上，研究NO3--N和NH4+-N混合的7種配比(NO3--N/NH4+-N分別為12.5/87.5、25/75、37.5/62.5、50/50、62.5/37.5、75/25、87.5/12.5，依次標(biāo)為1/7、1/3、3/5、5/5、5/3、3/1、7/1)對紫花苜蓿全生育期各部位硝酸還原酶(NR)、固氮酶活性及鉬(Mo)、鐵(Fe)營養(yǎng)吸收的影響。結(jié)果表明：(1) 從部位來看，紫花苜蓿NR活性、Mo含量趨勢一致，均表現(xiàn)為：葉>根>莖，而Fe含量則表現(xiàn)為根>葉>莖；不同配比下各部位NR活性均表現(xiàn)為配比中NO3--N比例大時，其活性較高，尤其是生長前期當(dāng)NO3--N/NH4+-N為7/1時，各部位NR活性均最高；不同配比對根中Mo含量的影響在苗期與NR趨勢相近，在NO3--N比例大時達最高?，F(xiàn)蕾期與固氮酶活性相同，1/7時最高。成熟期同固氮酶與NR活性，均為5/3時最高；不同配比對根中Fe含量的影響與固氮酶活性變化趨勢相一致，苗期均為1/7處理最高，盛花期至成熟期均為5/3處理最高。(2) 從生育期來看，紫花苜蓿全生育期NR和固氮酶活性變化趨勢均呈單峰曲線；NR活性在盛花期最高，即盛花期氮代謝能力最強，且各生育期均為配比中NO3--N比例大時NR活性高，氮代謝能力較強；固氮酶活性在結(jié)莢期最高，即結(jié)莢期根瘤固氮能力最強，且苗期和現(xiàn)蕾期均表現(xiàn)為1/7處理其活性最高，盛花期至成熟期5/3處理活性最高；不同配比對莖和葉中Mo、Fe含量的影響基本相同，現(xiàn)蕾期至盛花期在配比中NH4+-N比例大時含量最高，結(jié)莢期至成熟期在配比中NO3--N比例大時含量最高。(3) NR和固氮酶活性相互關(guān)系在整個生育期表現(xiàn)不同：在紫花苜蓿生長前期(苗期至現(xiàn)蕾期)，NO3--N/NH4+-N=7/1時NR活性最大，1/7處理NR活性最小，而固氮酶活性則相反，二者表現(xiàn)出拮抗關(guān)系；在紫花苜蓿生長中、后期(盛花期至成熟期)NR活性與固氮酶活性均在NO3--N/NH4+-N=5/3時達最大值，二者又相互促進。

NO3--N/NH4+-N配比；紫花苜蓿；氮代謝；酶；鉬；鐵

紫花苜蓿(Medicagosativa)是西北干旱半干旱地區(qū)人工種植面積最大的優(yōu)質(zhì)多年生豆科牧草[1]，由于其獨特的氮利用方式成為畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的植物蛋白資源[2]，尤其對西北生態(tài)脆弱區(qū)的生態(tài)修復(fù)和草食畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義[3]。紫花苜蓿雖可通過共生固氮利用分子態(tài)氮，但根瘤固定的氮素僅占其一生需氮量的50%～60%[4]，并不能滿足其生長所需，在土壤氮貧瘠的西北地區(qū)，尤其在干旱荒漠化地區(qū)[5]，補充外源氮是生產(chǎn)的必要保證。在以高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)為目的的生產(chǎn)中，要求外源氮既要滿足生產(chǎn)需要又不對共生固氮產(chǎn)生抑制，因此加強自身的氮代謝能力是提高氮素利用效率的重要途徑。

紫花苜蓿的氮素同化途徑有兩種：一是固氮酶把大氣中N2還原為氨。固氮酶是固氮生物體內(nèi)能將空氣中的氮還原成氨的生物催化劑，固氮酶活性是衡量固氮效能的重要指標(biāo)。二是硝酸還原酶(Nitrate reductase,NR)把硝態(tài)氮還原為亞硝酸，再由亞硝酸還原為氨。NR是植物體內(nèi)NO3--N同化步驟中的第一個酶，也是整個同化過程的限速酶，在植物氮代謝中起關(guān)鍵作用[6]。對大部分植物來說，此反應(yīng)在根、莖和葉中都可進行，通常綠色組織更為活躍[7]。而微量元素鉬(Mo)、鐵(Fe)是氮代謝關(guān)鍵酶的活化劑，在植物固氮和硝酸還原過程中二者缺一不可，對氮的吸收利用有促進作用[8]。Mo是NR和固氮酶的組成因子，對豆科植物的氮代謝有重要的促進作用，且Mo可以明顯提高NR活性，加強氮代謝[9]。Fe直接參與豆科作物共生固氮，是固氮酶、NR、鐵氧還原蛋白等含鐵蛋白的重要金屬組分[10]。對于豆科植物來說，F(xiàn)e可促進根瘤形成，提高固氮能力，且缺Fe時植物體內(nèi)NR降低，NO3--N同化受阻[11]。因此，Mo、Fe以及固氮酶和NR是反映植物氮代謝能力的重要指標(biāo)。

土壤中可供植物直接利用的氮素形態(tài)主要是硝態(tài)氮(NO3--N)和銨態(tài)氮(NH4+-N)，其對植物生理代謝過程的影響不同[12]。生長在不同土壤環(huán)境中的植物通過長期進化，形成了各自特有的對NO3--N和NH4+-N的喜好，如水田作物水稻喜NH4+-N，而玉米、小麥、白菜等旱地作物則偏好NO3--N，且同一作物在不同的生長階段對NO3--N和NH4+-N的喜好亦有變化[13]。有研究表明，大多數(shù)作物NO3--N與NH4+-N配合施用較單獨施用效果好，其最佳配比隨作物生育期不同而不同[14]。同是旱地植物的紫花苜蓿，已有研究證實，NO3--N和NH4+-N混合施用較單一NO3--N或NH4+-N更能促進紫花苜蓿的根系生長[15]，并促進其氮代謝[16]。另一方面西北地區(qū)氣候較為干燥，土壤偏堿性的條件下[17]，土壤硝化作用強烈而反硝化作用較弱，土壤中易于積累硝態(tài)氮[18]。Britto等[19]研究表明，NO3--N和NH4+-N聯(lián)合供應(yīng)時，植物吸收NH4+-N產(chǎn)生的根際酸化又可以抵消吸收NO3--N引起的根際堿化。因此，了解NO3--N/NH4+-N配比對紫花苜蓿氮代謝酶及Mo、Fe的影響對加強其自身的氮代謝能力，提高外源氮利用效率有重要作用。為此，本研究采用砂培法以避免土壤氮的干擾，并利用營養(yǎng)液，模擬土壤中可供植物直接吸收利用的兩種氮素形態(tài)的多種比例，研究不同NO3--N/NH4+-N配比對紫花苜蓿硝酸還原酶(NR)、固氮酶活性及Mo、Fe營養(yǎng)吸收的影響，以期為西北干旱區(qū)有效調(diào)節(jié)紫花苜蓿營養(yǎng)狀況及調(diào)控其土壤氮營養(yǎng)高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘農(nóng)3號紫花苜蓿和中華根瘤菌(12531)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.2 土壤中氮素形態(tài)比例的模擬

根據(jù)前期試驗結(jié)果設(shè)氮素水平為210 mg·L-1(以純氮計)[20]，將NO3--N和NH4+-N按不同比例混合，以NO3--N所占比例由小到大，NO3--N/NH4+-N分別為12.5/87.5；25/75；37.5/62.5；50/50；62.5/37.5；75/25；87.5/12.5，依次標(biāo)為1/7、1/3、3/5、5/5、5/3、3/1、7/1，共模擬出土壤中的可供植物直接吸收利用的兩種氮素形態(tài)(NO3--N和NH4+-N)的7種比例，共7個處理，每處理重復(fù)15次，完全隨機排列。

1.3 砂培試驗

為了更接近田間環(huán)境條件，且避免土壤氮的干擾，本試驗設(shè)在室外防雨網(wǎng)室內(nèi)，并采用營養(yǎng)液砂培法。營養(yǎng)液以Hoagland無氮植物營養(yǎng)液為基礎(chǔ)，利用Ca(NO3)2和(NH4)2SO4配制所需氮素濃度，調(diào)節(jié)pH值為7。

2014年4月10日，選取顆粒飽滿、均一的種子，經(jīng)95%乙醇滅菌30 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒5 min，后用無菌水洗5～6次，最后拿無菌濾紙吸干。選用直徑32 cm、高20 cm的花盆，裝入經(jīng)自來水沖洗再用蒸餾水清洗并經(jīng)過高溫(121℃)滅菌的粗砂10 kg。每盆播種100粒，播種初期每日噴澆3次蒸餾水，每次100 mL，直至對生真葉完全展開，每盆保留健壯植株50株。長至3片復(fù)葉時，每盆接種根瘤菌液50 mL。為防止鹽分積累，每7 d用蒸餾水充分淋洗，再重新加入營養(yǎng)液500 mL，直至取樣。

1.4 采樣時期的劃分

苗期(5月15日)：有80%的植株開始分枝時；

現(xiàn)蕾期(6月5日)：有15%以上的植株在葉腋間已形成花蕾時；

盛花期(6月25日)：有75%左右的分枝開始開花；

結(jié)莢期(7月15日)：有10%以上的分枝花序已結(jié)莢；

成熟期(8月5日)：有80%以上的果實成熟。

1.5 指標(biāo)測定

硝酸還原酶(NR)活性：采用離體法測定[21]，稱取0.5 g葉片，加4 mL緩沖提取液，冰浴研磨成勻漿。4℃下4 000 r·min-1離心15 min，上清液即酶的粗提液用于NR活性的測定。

固氮酶活性：采用乙炔還原法[22]測定。測定儀器為GC-7890F氣相色譜儀，柱溫170℃，進樣器140℃，F(xiàn)ID檢測器150℃。氣體壓力：N2為0.3 MPa，H2為0.08 MPa，空氣為0.15 MPa。

C2H4水平(μmol·g-1·h-1)=hx(樣品峰面積)×C(標(biāo)準(zhǔn)C2H4水平，μmol·mL-1)/hs(標(biāo)準(zhǔn)C2H4峰面積)×V(反應(yīng)氣體體積)×t(C2H2反應(yīng)時間，h)×m(瘤重，g)。

鉬(Mo)、鐵(Fe)含量的測定：選擇晴天上午9∶00—10∶00。將紫花苜蓿植株地上部取下，莖葉分開并放入烘箱105℃殺青15 min，65℃～75℃下烘干至恒重后粉碎。稱量草粉1 g，用1 mol·L-1鹽酸浸提，提取液用原子吸收光譜法測定Mo、Fe元素的含量[23]。

1.6 統(tǒng)計分析

用Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，并用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件Duncan法對數(shù)據(jù)進行多重比較。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿不同生育期硝酸還原酶(NR)活性

氮素水平210 mg·L-1下，NR活性受氮素形態(tài)配比的影響很大(圖1)。整個生育期NR活性表現(xiàn)為：葉>根>莖。全生育期各配比下NR活性變化趨勢均呈單峰曲線，在盛花期時最大，而后迅速下降，成熟期時NR活性均最低，且各部位具有一致的變化趨勢。從生育期來看，各生育期NO3--N所占比例大時，NR活性均較高，苗期、現(xiàn)蕾期、盛花期和結(jié)莢期處理間差異達顯著水平(P<0.05)。苗期NO3--N/NH4+-N為7/1時，NR活性顯著高于其它處理(P<0.05)；現(xiàn)蕾期NO3--N/NH4+-N為7/1，NR活性最高，但與5/3處理差異不顯著(P>0.05)；盛花期至成熟期NO3--N/NH4+-N為5/3時，各部位NR活性均最大，但成熟期各處理間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 紫花苜蓿不同生育期固氮酶活性

整個生育期，各處理下紫花苜蓿的固氮酶活性均隨著生育期的推進呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(表1)。氮素水平210 mg·L-1下，氮素形態(tài)配比對紫花苜蓿不同生育期固氮酶活性的影響較大。苗期和現(xiàn)蕾期紫花苜蓿的固氮酶活性表現(xiàn)為：NO3--N/NH4+-N<5/5時，固氮酶活性較高，且最高值出現(xiàn)在1/7處理；盛花期至成熟期NO3--N/NH4+-N配比為5/3時，固氮酶活性最大，在盛花期5/3處理顯著高于其它處理(P<0.05) ，結(jié)莢期和成熟期5/3和7/1處理差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于其它處理(P<0.05)。由此可見，紫花苜蓿中后期NO3--N/NH4+-N為5/3時，自身固氮能力較強。

圖1 NO3--N/NH4+-N配比對紫花苜蓿不同生育期各部位NR的影響

表1 NO3--N/NH4+-N配比對紫花苜蓿不同生育期固氮酶活性的影響/(μmol·g-1·h-1)

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column mean significant difference at the 0.05 level.

2.3 紫花苜蓿不同生育期鉬(Mo)含量

氮素形態(tài)配比對紫花苜蓿各部位中Mo含量的變化影響較大(圖2)。不同NO3--N/NH4+-N配比下，紫花苜蓿各部位中Mo含量整體表現(xiàn)為葉>根>莖，三者中Mo含量隨著生育期的推進均呈先增加后減小的趨勢，均在苗期最低，葉中Mo含量在結(jié)莢期最高，莖和根中則在盛花期達到峰值。

苗期，紫花苜蓿各部位中Mo含量均表現(xiàn)為：NO3--N/NH4+-N配比為3/1時顯著高于其它處理(P<0.05)；現(xiàn)蕾期，NO3--N/NH4+-N<5/5時各部位中Mo含量均較高，且1/7處理顯著高于其它處理(P<0.05)；盛花期至結(jié)莢期，隨NO3--N/NH4+-N比例的上升，各部位中Mo含量也發(fā)生變化。盛花期，根、莖和葉中Mo含量均在3/5處理下最大，且顯著高于其它處理(P<0.05)；結(jié)莢期，葉和莖中NO3--N/NH4+-N為5/3時Mo含量最高，而根中則3/1處理顯著高于其它處理(P<0.05)；至成熟期，紫花苜蓿葉、莖中Mo含量減少較多，根中Mo含量仍保持較高水平，且葉和莖中Mo含量在3/1處理時，顯著高于其它處理(P<0.05)，根中在5/3處理下含量最高。由此可見，在不同氮素形態(tài)下，紫花苜蓿前中期NH4+-N更有利于其對Mo營養(yǎng)的吸收，而到后期則相反。

2.4 紫花苜蓿不同生育期鐵(Fe)含量

從紫花苜蓿不同生育期對各部位Fe的吸收來看(圖3)，F(xiàn)e含量均表現(xiàn)為根>葉>莖。由圖3所示，苗期至結(jié)莢期葉片中的鐵含量整體呈緩慢上升趨勢，結(jié)莢期至成熟期略有下降。莖中Fe的含量比較穩(wěn)定，但在結(jié)莢期時有所下降。而根部Fe含量在苗期至盛花期快速升高，結(jié)莢期有所下降，成熟期時達到峰值。

苗期，葉和莖中Fe含量在NO3--N/NH4+-N為3/1時均顯著高于其它處理(P<0.05)，根中則為NO3--N/NH4+-N為1/7時最高；現(xiàn)蕾期各部位中Fe含量均在1/3處理達最大值，且顯著高于其它處理(P<0.05)；盛花期葉和莖中Fe含量在NO3--N/NH4+-N為1/3時最高，而根則在5/3時最高；結(jié)莢期葉中Fe含量在NO3--N/NH4+-N為5/5時最高，根和莖中在5/3處理達最大值，且顯著高于其它處理(P<0.05)；成熟期葉中Fe含量最大值出現(xiàn)在3/1處理，莖中Fe含量在7/1處理下顯著高于其它處理(P<0.05)，而根中Fe含量則表現(xiàn)為：NO3--N/NH4+-N配比中NO3--N所占比例大的處理積累的Fe含量較多，且在NO3--N/NH4+-N為5/3時最大。

3 討論與結(jié)論

3.1 NO3--N/NH4+-N配比對紫花苜蓿各部位氮代謝的影響

本研究中，不同NO3--N/NH4+-N配比下，紫花苜蓿5個生育期的NR活性均表現(xiàn)為：葉>根>莖，說明葉是紫花苜蓿同化NO3--N的最主要部位，在其它作物的研究中已證實[24]。在不同NO3--N和NH4+-N配比處理下，紫花苜蓿根、莖、葉中NR活性均表現(xiàn)為：配比中NO3--N所占比例大時，其活性較高，尤其是苗期至現(xiàn)蕾期當(dāng)NO3--N/NH4+-N為7/1時，NR活性最高。黃俊[25]等對白菜的研究也發(fā)現(xiàn)NO3--N/NH4+-N不同，葉片內(nèi)的NR活性差異顯著，并在比例為75/25時，NR活性最強。主要是因為NR不僅是氮代謝過程中的限速酶，同時還是一種誘導(dǎo)酶[5]，NR可被介質(zhì)中的NO3-所誘導(dǎo)，其活性取決于介質(zhì)中NO3-的濃度，且與之呈正相關(guān)[26]，因此，環(huán)境中NO3-的增加可誘導(dǎo)其體內(nèi)NR活性的提高。

圖2 NO3--N/NH4+-N配比對紫花苜蓿不同生育期各部位鉬含量的影響

圖3 NO3--N/NH4+-N配比對紫花苜蓿不同生育期不同部位鐵含量的影響

本研究中紫花苜蓿各部位Mo含量表現(xiàn)為：葉>根>莖，且各部位Mo含量均在苗期最低，吳明才等[27]研究發(fā)現(xiàn)大豆各部位Mo含量也均在苗期最低。根中Mo含量的最大值隨著生育期的推進出現(xiàn)在不同的NO3--N/NH4+-N配比下，苗期為3/1時最大，現(xiàn)蕾期為1/7時最大，而至成熟期又在5/3處理達最大值，分析認(rèn)為紫花苜蓿生長初期根瘤尚未形成，根瘤固氮能力較低，對Mo的需求還未與NR形成競爭，因此在苗期NO3--N/NH4+-N配比對根中Mo含量的影響與NR趨勢相近，在NO3--N所占比例大時Mo含量達最高。隨著生育期的推進，大量根瘤形成，根瘤固氮能力大幅度提高，對Mo的需求量大于NR對其的競爭，因此現(xiàn)蕾期NO3--N/NH4+-N配比對根中Mo含量的影響與固氮酶活性趨勢相近，在NH4+-N所占比例大時Mo含量達最高。至生育后期，根瘤老化，根瘤固氮能力開始下降并與NR對Mo的競爭協(xié)同共進，因此成熟期NO3--N/NH4+-N配比對根中Mo含量的影響同固氮酶活性與NR，均在NO3--N所占比例大時Mo含量達最高。

Fe是植物體內(nèi)鐵氧還原蛋白的重要組分，直接影響NR活性并參與豆科作物共生固氮。本研究中紫花苜蓿植株Fe含量表現(xiàn)為：根>葉>莖，喬鮮花等[28]研究發(fā)現(xiàn)，小麥各器官Fe含量也表現(xiàn)出類似的趨勢：根系>葉片>穗軸、穎殼>莖>子粒。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同NO3--N/NH4+-N配比對紫花苜蓿根中Fe含量的影響與固氮酶活性變化趨勢相一致，苗期、盛花期、結(jié)莢期和成熟期的最大值均出現(xiàn)在同一NO3--N/NH4+-N配比處理下，表明Fe可影響固氮酶活性大小，Dakora等[29]關(guān)于豇豆和大豆的研究也證實，固氮酶活性不僅受外源氮素的影響，而且也受金屬元素Mo、Fe的制約。而苗期后根部Fe含量急劇增加，遠遠大于葉和莖中的含量，可能是由于隨著生育期的推進，根系逐漸衰老，活力下降，氧化能力減弱，使得根系周圍大量的Fe以Fe3+沉積在根系表面而造成的[30]。

由此，從部位來看，紫花苜蓿NR活性、Mo含量趨勢一致，均表現(xiàn)為：葉>根>莖，而Fe含量則表現(xiàn)為根>葉>莖；不同配比下各部位NR活性均表現(xiàn)為配比中NO3--N所占比例大時，其活性較高，尤其是生長前期當(dāng)NO3--N/NH4+-N為7/1時，各部位NR活性均最高；不同配比對根中Mo含量的影響在苗期與NR趨勢相近，在NO3--N所占比例大時達最高?，F(xiàn)蕾期與固氮酶活性相同，1/7時最高。成熟期同固氮酶與NR活性，均在5/3時最高；不同配比對根中Fe含量的影響與固氮酶活性變化趨勢相一致，苗期均在1/7處理最高，盛花期至成熟期均在5/3處理最高。

3.2 NO3--N/NH4+-N配比對紫花苜蓿各生育期氮代謝的影響

本研究中，紫花苜蓿全生育期各配比下NR活性變化趨勢均呈單峰曲線，盛花期活性最高，成熟期最低，且各部位具有一致的變化趨勢，說明在紫花苜蓿的5個生育期中，盛花期氮代謝能力最強。劉鵬等[31]研究也發(fā)現(xiàn)大豆葉片各生育期NO3--N與NR活性的動態(tài)變化相似，以開花期最高、成熟期最低。不同NO3--N/NH4+-N配比處理下，紫花苜蓿NR活性在整個生育期均表現(xiàn)為NO3--N/NH4+-N配比中NO3--N比例高時NR活性較高，這是由于NR作為一種誘導(dǎo)酶，其活性大小與底物(NO3-)的濃度呈正相關(guān)，而氮代謝過程中同化的產(chǎn)物NH4+、谷氨酸、谷氨酰胺等則抑制其活性[32]。所以，配比中NO3--N比例大時，促進其NR活性增加，反之，當(dāng)NH4+-N比例大時，因NH4+也是NO3-還原反應(yīng)的產(chǎn)物，即氮代謝的同化產(chǎn)物，其反饋抑制作用致使NR活性降低。

本研究中，紫花苜蓿全生育期各配比下固氮酶活性變化趨勢均呈單峰曲線，結(jié)莢期達最大值，說明在紫花苜蓿的5個生育期中，結(jié)莢期根瘤固氮能力最強。且不同NO3--N/NH4+-N配比下，紫花苜蓿的固氮酶活性在苗期和現(xiàn)蕾期均表現(xiàn)為1/7處理最好，說明NH4+-N更有利于根瘤的生長，分析原因是供給NO3--N時主要影響根瘤呼吸速率使根瘤皮層內(nèi)O2擴散阻抗力增大，根瘤侵染區(qū)細胞O2濃度降低，類菌體呼吸和固氮所需氧供應(yīng)不足，因而導(dǎo)致根瘤活性受到抑制[33]。紫花苜蓿生長至中、后期(盛花期至成熟期)，NH4+-N比例較大的處理紫花苜蓿固氮酶活性下降，而5/3處理下表現(xiàn)最好，分析原因可能是大量的NH4+-N來不及利用和轉(zhuǎn)移，NH4+濃度過高導(dǎo)致NH4+鹽毒害，不能形成根瘤進而限制固氮酶的合成。本研究采用營養(yǎng)液培養(yǎng)，可提供充足的Mo供紫花苜蓿生長，而Mo可促進植物對NO3--N的吸收與同化，因此，Mo的存在能緩解NO3--N對固氮酶的抑制作用，提高根瘤固氮能力[34]。

在本研究中整個生育期不同配比對莖和葉中Mo、Fe含量的影響基本相同，現(xiàn)蕾期至盛花期表現(xiàn)為：NO3--N/NH4+-N配比中NH4+-N比例大時，Mo和Fe含量達最高；而結(jié)莢期至成熟期則表現(xiàn)為：NO3--N/NH4+-N配比中NO3--N比例大時，Mo和Fe含量達最高。分析原因是氮素形態(tài)對它們根際pH的影響不同造成的[35]，前中期NH4+-N能較快地釋放出H+，陰陽離子結(jié)合使得Mo和Fe吸收較快，積累量多。結(jié)莢期后，大量NO3--N經(jīng)NR還原成NH4+-N，使得植株中NH4+-N大量積累，故結(jié)莢期后表現(xiàn)為NO3--N含量高時Mo和Fe含量反而高。

由此，從生育期來看，紫花苜蓿全生育期NR活性和固氮酶活性變化趨勢均呈單峰曲線；NR活性在盛花期最高，即盛花期氮代謝能力最強，且各生育期均為NO3--N/NH4+-N配比中NO3--N比例大時NR活性高，氮代謝能力較強；固氮酶活性在結(jié)莢期達最大值，即結(jié)莢期根瘤固氮能力最強，且苗期和現(xiàn)蕾期均表現(xiàn)為1/7處理其活性最高，盛花期至成熟期則在5/3處理下活性最高；不同配比對莖和葉中Mo、Fe含量的影響基本相同，現(xiàn)蕾期至盛花期在配比中NH4+-N所占比例大時含量達最高，結(jié)莢期至成熟期在配比中NO3--N所占比例大時含量達最高。

3.3 NO3--N/NH4+-N配比下紫花苜蓿NR活性與固氮酶活性的關(guān)系

有觀點認(rèn)為NR和固氮酶是一對拮抗酶，它們不僅含有共同的鉬輔因子，產(chǎn)生對這種共同因子的競爭，而且對氮素形態(tài)的響應(yīng)不同，前者受NO3--N的誘導(dǎo)和促進，后者受NO3--N的鈍化和抑制[36]。但在本研究中，在紫花苜蓿生長前期(苗期至現(xiàn)蕾期)，NO3--N/NH4+-N=7/1處理NR活性最大，1/7處理NR活性最小，而固氮酶活性則相反，二者表現(xiàn)出拮抗關(guān)系；在紫花苜蓿生長中、后期(盛花期至成熟期)NR活性與固氮酶活性均在NO3--N/NH4+-N=5/3處理達最大值，二者又相互促進。所以，固氮酶與NR之間不都是拮抗關(guān)系，在固氮酶活性被外源氮抑制時，與NR之間存在拮抗關(guān)系，而固氮酶未受抑制或抑制較輕時，固氮酶與NR之間又可以相互促進、協(xié)調(diào)氮素營養(yǎng)。

[1] 金風(fēng)霞,麻冬梅,劉昊焱,等.不同種植年限苜蓿地土壤環(huán)境效應(yīng)的研究[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2014,32(2):73-77.

[2] 劉曉靜,張進霞,李文卿,等.施肥及刈割對干旱地區(qū)紫花苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].中國沙漠,2014,34(6):1516-1526.

[3] 南麗麗,郁繼華,郭全恩.荒漠灌區(qū)不同種植年限苜蓿地土壤酶活性的變化研究[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2015,33(6):71-76.

[4] 曾昭海,胡躍高,陳文新,等.共生固氮在農(nóng)牧業(yè)上的作用及影響因素研究進展[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報,2006,14(4):21-24.

[5] 俞 玲,馬暉玲.甘肅幾種早熟禾內(nèi)源激素水平及干旱適應(yīng)性[J].中國沙漠,2015, 35(1):182-188.

[6] 李從峰,王空軍,劉 鵬,等.供氮水平對雄性不育玉米物質(zhì)生產(chǎn)和氮代謝的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報,2009,15(1):99-104.

[7] 張華珍,徐恒玉.植物氮素同化過程中相關(guān)酶的研究進展[J].北方園藝,2011,(20):180-183.

[8] 王改玲,郝明德,黨廷輝,等.黃土高原旱地長期施用微肥對冬小麥產(chǎn)量及氮磷養(yǎng)分吸收的影響[J].西北植物學(xué)報,2003,23(8):1402-1405.

[9] 杜應(yīng)瓊,廖新榮,黃志堯,等.硼、鉬對花生氮代謝的影響[J].作物學(xué)報,2001,27(5):612-616.

[10] Dakora D F. A functional relationship between leghaemogbin and nitrogenase based on novel measurements of the proteins in legume root nodules[J]. Annals of Botany, 1995,75(1):49-54.

[11] 申紅蕓,熊宏春,郭笑彤,等.植物吸收和轉(zhuǎn)運鐵的分子生理機制研究進展[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報,2011,17(6):1522-1530.

[12] Masclaux-Daubresse C, Daniel-Vedele F, Dechorgnat J, et al. Nitrogen uptake,assimilation and remobilization in plants: challenges for sustainable and productive agriculture[J]. Annals of Botany, 2010,105(7):1141-1157.

[13] 李 凱,郭宇琦,劉楚楠,等.銨硝配比對大豆生長及結(jié)瘤固氮的影響[J].中國油料,2014,36(3):349-356.

[14] 劉趙帆,張國斌,郁繼華,等.氮肥形態(tài)及配比對花椰菜產(chǎn)量、品質(zhì)和養(yǎng)分吸收的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2013,24(7):1923-1930.

[15] 劉曉靜,葉 芳,張曉玲.外源氮素形態(tài)對紫花苜蓿不同生育期根系特性的影響[J].草業(yè)學(xué)報,2015,24(6):53-63.

[16] 葉 芳,劉曉靜,張進霞.氮素形態(tài)對‘甘農(nóng)3號’苜蓿不同生育期氮代謝的影響[J].草地學(xué)報,2015,23(2):285-293.

[17] 郝 鳳,劉曉靜,張曉磊,等.混合鹽堿脅迫對紫花苜蓿苗期氮磷吸收及生理特性的影響[J].中國沙漠,2015,35(5):1268-1274.

[18] Ju X, Lu X, Gao Z, et al. Processes and factors controlling N2O production in an intensively managed low carbon calcareous soil under sub-humid monsoon conditions[J]. Environmental Pollution, 2011,159(4):1007-1016.

[19] Britto DT, Kronzucker HJ. NH4+toxicity in higher plants: Acritical review[J]. Journal of Plant Physiology, 2002,159(6):567-584.

[20] 蒯佳林,劉曉靜,李文卿.不同氮素水平對接種根瘤菌紫花苜蓿生長特性的影響[J].草原與草坪,2011,31(3):56-63.

[21] 鄒 琦.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000.

[22] Hafeez F Y, Malik K A. Manual on Biofertilizer Technology[M]. Pakistan:NIBGE, 2000.

[23] 常新耀,林紫玉,謝紅兵,等.原子吸收光譜法測定新鄉(xiāng)野生苜蓿中微量元素的含量[J].光譜實驗室,2009,26(4):952-954.

[24] Silveira J A G, Matos J C S, Cecatto V M, et al. Nitrate reductase activity, distribution, and response to nitrate in two contrasting Phaseolus species inoculated with Rhizobium spp.[J]. Environmental & Experimental Botany, 2001,46(1):37-46.

[25] 黃 俊,周旭燕,劉 莉.不同銨硝配比對弱光下白菜氮素吸收及相關(guān)酶的影響[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,19(4):783-787.

[26] 陳 煜,朱保葛,張 敬,等.不同氮源對大豆硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性及蛋白質(zhì)含量的影響[J].大豆科學(xué),2004,23(2):143-146.

[27] 吳明才,肖昌珍.大豆鉬素研究[J].大豆科學(xué),1994,13(3):245-251.

[28] 喬鮮花,汪娟梅,董明蕾,等.噴施鐵肥對不同基因型小麥產(chǎn)量和鐵吸收的影響[J].麥類作物學(xué)報,2012,31(5):959-964.

[29] Dakora D F. A functional relationship between leghaemogbin and nitrogenase based on novel measurements of the proteins in legume root nodules[J]. Annals of Botany, 1995,15:49-54.

[30] 胡 瑩,黃益宗,黃艷超,等.不同生育期水稻根表鐵膜的形成及其對水稻吸收和轉(zhuǎn)運Cd的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2013,3(3):432-437.

[31] 劉 鵬,楊玉愛.硼鉬脅迫對大豆葉片硝酸還原酶與硝態(tài)氮的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2000,26(2):151-154.

[32] 王 平.不同氮效率類型小麥氮代謝差異及其機理分析[D].山東:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[33] Denison R F, Layzell D B. Measurement of Iegume nodule respiration and O2 Permeability by noninvasive spectrophotometry of leghemoglobin[J]. Plant Physiology, 1991,96:137-143.

[34] 李文學(xué),韓曉日.低溫對缺鉬冬小麥幼苗生長的影響Ⅱ．對氮代謝的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報,2001,7(1):88-92.

[35] 崔駝勇,曹一平,張福鎖.氮素形態(tài)及HCO3-土對豌豆鐵素營養(yǎng)的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報,2000,6(1):84-90.

[36] 黃志宏,黃維南.楊梅硝酸還原酶活性與根瘤固氮活性的研究[J].熱帶作物學(xué)報,2002,23(1):35-39.

StudyonkeyenzymeactivityinnitrogenmetabolismandthecontentofmolybdenumandironinalfalfaunderdifferentNO3--N/NH4+-Nratio

HAO Feng, LIU Xiao-jing, FAN Jun-jun

(CollegeofGrasslandScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofPrataculturalEcosystem,MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-USCenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou，Gansu730070,China)

By solution culture method, ‘Gannong No.3’ alfalfa was chosen as the experimental material to explore the effects of NO3--N/NH4+-N ratios(1/7、1/3、3/5、5/5、5/3、3/1、7/1) based on nitrogen supply of 210 mg·L-1on the activity of nitrate reductase(NR) and nitrogenase, and the content of molybdenum(Mo) and iron(Fe) in organs of alfafa during the whole growth period. The results showed that: (1) NR activity and Mo content was consistent:leaf>root>stem, while Fe content was root>leaf>stem. With the proportion of NO3--N increasing, NR activity in each organ became higher. In the early stage, when NO3--N/NH4+-N equaled to 7/1, NR activity was the highest. The influence of different ratio on Mo content in root during seedling stage was similar to NR activity, that is to say, in large proportion of NO3--N it was the highest. During budding stage, the same as nitrogenase activity, in 1/7 it was highest. During mature stage, same as nitrogenase and NR activity, in 5/3 it was highest. The influence of different ratio on Fe content in root was similar to nitrogenase activity, that is to say, it was highest at 1/7 in seedling and 5/3 from full-bloom to mature. (2) NR and nitrogenase activity showed a single-peak curve during the whole growth period, that is to say, NR activity was the highest during full-bloom stage and nitrogenase activity was the highest during podding stage. NR activity was higher under larger proportion of NO3--N in different ratios during the whole growth period. Nitrogenase activity was the highest in 1/7 at seedling and budding, and from full-bloom to mature it was the highest in 5/3. Mo and Fe content in the stem and leaf was consistent, they were the highest for larger proportion of NH4+-N from budding to full-bloom and highest for larger proportion of NO3--N from podding to maturity. (3) Relationship between NR and nitrogenase activity differed in the whole growth period. At the early growth stage (from seeding to budding), NR activity was highest in 7/1 and lowest in 1/7. Nitrogenase activity was in the opposite situation, suggesting that there was an antagonistical relationship between NR and nitrogenase activity. From full-bloom to mature, both NR and nitrogenase activity was highest in 5/3, they accelerated each other.

NO3--N/NH4+-N ratio; alfalfa; nitrogen metabolism; enzyme; molybdenum; iron

1000-7601(2017)03-0190-08doi:10.7606/j.issn.1000-7601.2017.03.30

2016-04-29

：2017-03-15

：國家自然科學(xué)基金項目(31460622)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201403048-8)；甘肅省科技支撐項目(1504NKCA003)

郝 鳳(1985—)，女，黑龍江鶴崗人，博士研究生，研究方向為牧草及草坪草營養(yǎng)生理。 E-mail：haofeng1026@163.com。

劉曉靜，E-mail：liuxj@gsau.edu.cn。

N143.1

： A