張世超， 歐陽(yáng)燕， 劉善輝， 朱 莉

(蘭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州730000)

冷凍電鏡單顆粒技術(shù)解析生物大分子結(jié)構(gòu)綜述

張世超， 歐陽(yáng)燕， 劉善輝， 朱 莉

(蘭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州730000)

冷凍電鏡單顆粒技術(shù)是從20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)新技術(shù)，特別是最近幾年，由于高分辨成像設(shè)備的應(yīng)用以及圖像處理方法的改進(jìn)，該領(lǐng)域取得了革命性的技術(shù)突破，分辨率達(dá)到原子水平，迅速發(fā)展成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)新的主流研究技術(shù)，尤其適合于研究生物大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。簡(jiǎn)述了冷凍電鏡單顆粒技術(shù)解析生物大分子結(jié)構(gòu)的技術(shù)流程、最新技術(shù)進(jìn)步以及未來(lái)發(fā)展方向。

冷凍電鏡；單顆粒；三維重構(gòu)；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

結(jié)構(gòu)生物學(xué)通過(guò)解析生物大分子的結(jié)構(gòu)來(lái)研究其發(fā)揮功能的分子機(jī)制，從而揭示細(xì)胞生命活動(dòng)的分子基礎(chǔ)。冷凍電鏡單顆粒技術(shù)，發(fā)端于20世紀(jì)80年代[1-2]，是將生物大分子速凍后，在低溫下利用透射電子顯微鏡對(duì)結(jié)構(gòu)均一、分散的全同樣品顆粒進(jìn)行成像，再經(jīng)圖像處理及重構(gòu)計(jì)算獲得樣品的三維結(jié)構(gòu)?？裳芯可锎蠓肿釉谌芤褐械慕Y(jié)構(gòu)及構(gòu)象變化、無(wú)需結(jié)晶、所需樣品量相對(duì)較少(通常<0.1～1mg)、研究對(duì)象廣泛，適合于研究>80 ku的蛋白質(zhì)、病毒等生物大分子及其復(fù)合物，且樣品分子量越大、對(duì)稱(chēng)性越高，越容易重構(gòu)得到高分辨結(jié)構(gòu)，目前分辨率已達(dá)到原子/近原子水平。在2013年以前，只有具備高度對(duì)稱(chēng)性的病毒大分子顆?？芍貥?gòu)得到近原子分辨率結(jié)構(gòu)，如周正洪研究組于2010年發(fā)表的第一個(gè)冷凍電鏡原子分辨率結(jié)構(gòu)——3.3?人腺病毒結(jié)構(gòu)[3]。直到2013年，程亦凡小組解析了約300 ku膜蛋白TRVP1的3.4高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)[4]，標(biāo)志著冷凍電鏡單顆粒結(jié)構(gòu)解析進(jìn)入原子分辨率時(shí)代。其后，一系列樣品通過(guò)這一技術(shù)重構(gòu)得到原子分辨水平密度圖，過(guò)去結(jié)構(gòu)研究困難的一些生物大分子復(fù)合體以及低對(duì)稱(chēng)性、低分子量的蛋白質(zhì)也紛紛解析得到原子/近原子分辨率結(jié)構(gòu)，如膜蛋白γ-分泌酶(170 ku，4.5 ?)[5]、乳酸脫氫酶(145 ku，2.8 ?)[6]、核糖體(2.8 ?)[7]、剪切體(< 4 ?)[8]等。目前冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析的最高分辨率是1.8 ?(谷氨酸脫氫酶，334 ku)，實(shí)現(xiàn)高分辨結(jié)構(gòu)解析的最小分子是異檸檬酸脫氫酶(93 ku，3.8 ?)[6]。由于其在生物大分子結(jié)構(gòu)研究中無(wú)可比擬的優(yōu)越性，冷凍電鏡單顆粒技術(shù)正受到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，越來(lái)越多的生物大分子結(jié)構(gòu)通過(guò)這一技術(shù)獲得解析。

1 冷凍電鏡單顆粒技術(shù)流程

1.1 樣品提取純化

對(duì)于分子量較小、內(nèi)源豐度低的蛋白，可通過(guò)外源重組過(guò)量表達(dá)提取純化；而對(duì)于外源表達(dá)純化困難的大分子復(fù)合物，如核糖體，則一般通過(guò)組織提取方式獲得。樣品純度要盡量高，一般應(yīng)達(dá)到90%～95%以上，若進(jìn)一步純化很困難，后面的數(shù)據(jù)處理過(guò)程中可進(jìn)行計(jì)算機(jī)純化，即通過(guò)計(jì)算分類(lèi)區(qū)分樣品的不同狀態(tài)。

1.2 冷凍電鏡樣品制備

冷凍電鏡制樣的目的是要獲得分散性、均一性較好的樣品以進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。冷凍制樣，是將生物含水樣品(如蛋白質(zhì)溶液)用液氮/液氦冷卻的液態(tài)乙烷速凍，使水分子形成非晶體玻璃態(tài)冰，樣品顆粒懸浮于玻璃態(tài)冰中，以保持生物分子近天然態(tài)高分辨結(jié)構(gòu)，減少電子束對(duì)樣品的輻照損傷。

1.3 數(shù)據(jù)收集

生物分子，主要由C、H、O、N等元素組成，電子散射能力弱，成像襯度低。為減少輻照損傷，生物樣品使用低電子劑量(通常約20 e/?2) 成像，導(dǎo)致信噪比和襯度更低，成像時(shí)需要增加欠焦值以提高圖像襯度。一般需要采集大量粒子，目標(biāo)分辨率越高，需要粒子數(shù)越多，尤其是無(wú)對(duì)稱(chēng)性樣品以及均一性較差的樣品則需要收集更多粒子。收集數(shù)據(jù)量的大小取決于樣品對(duì)稱(chēng)性、均一性、成像質(zhì)量以及目標(biāo)分辨率等因素。目前，對(duì)于非對(duì)稱(chēng)性分子，通過(guò)電子直接探測(cè)相機(jī)成像，達(dá)到近原子分辨率一般需要大約5～15萬(wàn)個(gè)粒子。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 粒子參數(shù)的確定與二維分類(lèi)

每一個(gè)粒子的電鏡圖像有5個(gè)參數(shù)需要確定：兩個(gè)平面內(nèi)的平移自由度X、Y，一個(gè)平面內(nèi)的旋轉(zhuǎn)自由度γ，兩個(gè)離開(kāi)平面的旋轉(zhuǎn)自由度α、β。平面內(nèi)自由度可以通過(guò)對(duì)位加以消除，每個(gè)粒子離開(kāi)平面的旋轉(zhuǎn)自由度提供了粒子的三維信息。單顆粒圖像處理的目的就是通過(guò)電鏡重構(gòu)軟件計(jì)算確立每一個(gè)粒子的這些參數(shù)，常用的重構(gòu)軟件有EMAN2[9]、SPIDER[10]、XMIPP[11]、IMAGIC[12]等。

二維分類(lèi)，是將顆粒圖像對(duì)位后，根據(jù)相似性進(jìn)行歸類(lèi)，計(jì)算每一類(lèi)的二維類(lèi)平均圖。二維分類(lèi)算法有K均值聚類(lèi)算法及最大似然法。通過(guò)二維分類(lèi)，可評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量、粒子取向分布等樣品狀態(tài)。

粒子取向測(cè)定的準(zhǔn)確度是決定重構(gòu)分辨率的主要因素。電鏡照片包含大量噪音信號(hào)，是影響粒子取向確定的主要限制因素。大分子顆粒可提供足夠強(qiáng)的信號(hào)以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的對(duì)位及分類(lèi)，因此分子越大越容易區(qū)分異質(zhì)性。低信噪比限制對(duì)位及粒子取向測(cè)定的準(zhǔn)確度，使小分子結(jié)構(gòu)解析更加困難。

1.4.2 三維重構(gòu)

電鏡三維重構(gòu)的基本原理是DeRosier和Klug于1968年提出的中心截面定理[13]，它是指一個(gè)函數(shù)沿某方向投影函數(shù)的傅立葉變換等于此函數(shù)的傅立葉變換通過(guò)原點(diǎn)且垂直于此投影方向的截面函數(shù)。拍攝的電鏡照片，可視為樣品沿電子入射方向的二維投影，沿不同投影方向拍攝樣品不同取向的一系列電鏡照片，經(jīng)傅立葉變換，可得到一系列不同取向的截面，當(dāng)截面數(shù)足夠多時(shí)，可重構(gòu)出傅立葉空間的三維函數(shù)，再經(jīng)傅立葉逆變換，便可得到實(shí)空間中樣品的三維結(jié)構(gòu)。常用的三維重構(gòu)方法有角度重構(gòu)法(也稱(chēng)共價(jià)線(xiàn)法)[14]與隨機(jī)錐傾轉(zhuǎn)法(RCT法)[15]。角度重構(gòu)法適合于取向隨機(jī)分布的樣品，RCT法則適合于具有明顯優(yōu)勢(shì)取向的樣品。對(duì)于結(jié)構(gòu)未知的樣品，RCT法是獲得可靠初始模型的有效方法。

1.4.3 三維分類(lèi)

模型精修之前，可按照三維分類(lèi)原則對(duì)粒子集進(jìn)行分類(lèi)，即根據(jù)粒子與一個(gè)或多個(gè)參照模型的相似度進(jìn)行分類(lèi)。三維分類(lèi)的目的是為了區(qū)分粒子不同的取向、構(gòu)象狀態(tài)、結(jié)構(gòu)組成等。三維分類(lèi)的算法基于最大似然法原理[16]，常用軟件有RELION[17-18]及FREALIGN[19]等。通過(guò)三維分類(lèi)可去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，有助于獲得高分辨結(jié)構(gòu)。

1.4.4 模型精修

在獲得均一的粒子集及初始三維模型后，用“投影匹配”法進(jìn)行模型精修以提高分辨率。首先將每個(gè)粒子圖像與初始模型的一系列二維投影圖進(jìn)行比對(duì)，按照與每個(gè)粒子最為相似的投影圖取向，對(duì)粒子進(jìn)行平移及角度參數(shù)調(diào)整，調(diào)整后的粒子再用于重構(gòu)新的三維模型，新計(jì)算出來(lái)的三維模型又被用于下一輪的粒子參數(shù)優(yōu)化。如此反復(fù)，直到模型投影和原始的粒子圖像匹配。

顆粒對(duì)位及投影匹配時(shí)，以粒子結(jié)構(gòu)中體積較大較穩(wěn)定的部分為主，相對(duì)靈活的亞區(qū)分辨率相對(duì)較低。有時(shí)需要將參照模型甚至粒子圖像中較大的穩(wěn)定區(qū)域進(jìn)行掩蓋，只對(duì)靈活區(qū)域做精修，前提是目標(biāo)區(qū)域能夠進(jìn)行準(zhǔn)確對(duì)位，如核糖體中，小亞基相對(duì)于大亞基可呈不同的結(jié)合狀態(tài)。

1.4.5 分辨率評(píng)估和結(jié)構(gòu)解析

以FSC(Fourier shell correlation)曲線(xiàn)評(píng)估EM模型的分辨率，結(jié)果為模型整體分辨率。模型各部分結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性不同，分辨率可能存在局部差異。通常位于結(jié)構(gòu)中央、較穩(wěn)定的部分，分辨率較高；而處于結(jié)構(gòu)邊緣、較靈活的區(qū)域，分辨率較低。ResMap[20]軟件可評(píng)估局部分辨率。

要區(qū)分亞基邊界，要求分辨率達(dá)到～15 ?以上；高于10 ?可顯示α螺旋對(duì)應(yīng)的棒狀密度；～4 ?可顯示肽鏈骨架；接近3 ?，可識(shí)別大多數(shù)氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)，或雙鏈DNA/RNA的堆積堿基。近原子分辨率的EM密度圖，可用X-射線(xiàn)晶體學(xué)建立的一套方法，直接進(jìn)行原子模型的建立和精修。常用COOT[21]軟件建模，REFMAC[22]軟件進(jìn)行精修。對(duì)于分辨率在4.5～10 ?之間的EM密度圖(圖1)，將結(jié)構(gòu)域的已知高分辨結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合，可獲得準(zhǔn)原子模型。對(duì)于中等分辨率的密度圖，通過(guò)密度差減分析、晶體結(jié)構(gòu)對(duì)接等方法，可解析分子構(gòu)架方式。

2 革命性的技術(shù)進(jìn)步

近年來(lái)冷凍電鏡領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展主要源于兩方面的技術(shù)革新：高分辨成像設(shè)備——電子直接探測(cè)相機(jī)DDD (Direct electron detector)的應(yīng)用以及圖像處理技術(shù)的進(jìn)步[23]。最新一代的高分辨成像設(shè)備DDD，可直接檢測(cè)電子，無(wú)需進(jìn)行光電信號(hào)轉(zhuǎn)換，極大地提高了圖像信噪比和襯度[24]。再結(jié)合優(yōu)化的圖像處理方法，可解析過(guò)去研究難度較高極具挑戰(zhàn)的生物大分子機(jī)器(如核糖體、剪切體、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物等)以及小分子量蛋白質(zhì)(<200 ku)。

新的圖像處理工具可校正電子輻射導(dǎo)致的樣品漂移以及區(qū)分樣品的不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)。電子束照射會(huì)導(dǎo)致樣品漂移，使圖像模糊[25]；生物大分子結(jié)構(gòu)靈活，經(jīng)常存在組成或構(gòu)象不均一性，對(duì)樣品中不同的三維結(jié)構(gòu)如未加以區(qū)分，會(huì)導(dǎo)致重構(gòu)結(jié)構(gòu)模糊。這兩個(gè)問(wèn)題都導(dǎo)致結(jié)構(gòu)信息嚴(yán)重?fù)p失。Campbell等開(kāi)發(fā)了DDD的電影成像模式，以識(shí)別并校正電子束誘導(dǎo)的樣品漂移，從而提高單顆粒圖像的信噪比[26]。Scheres將貝葉斯算法用于單顆粒分析[27]，開(kāi)發(fā)了Relion軟件[17-18]，成為三維分類(lèi)及高分辨重構(gòu)的強(qiáng)大工具，廣受歡迎。高分辨低噪音圖像使圖像處理算法得以更好地執(zhí)行，得到更均一、分辨率更高的數(shù)據(jù)集，使每個(gè)顆粒的取向測(cè)定更準(zhǔn)確，兩方面共同作用的效果使重構(gòu)分辨率大大提高，超出人們預(yù)期。

目前，高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析可實(shí)現(xiàn)從頭建立原子模型、觀察化學(xué)小分子(如底物、配體、抑制劑等)、解析小分子蛋白復(fù)合物以及研究非均一樣品等。

3 總結(jié)與展望

冷凍電鏡單顆粒技術(shù)方法逐漸發(fā)展成熟，特別是在最近幾年之中，取得了突飛猛進(jìn)的技術(shù)進(jìn)步，使分辨率大幅提升、達(dá)到原子水平，正迅速發(fā)展成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)一項(xiàng)主流研究技術(shù)。如今小至93 ku的蛋白(異檸檬酸脫氫酶)已能通過(guò)cryo-EM解析近原子分辨率結(jié)構(gòu)。但在實(shí)際操作中有的樣品很難重構(gòu)得到高分辨結(jié)構(gòu)，特別是分子量較小、均一性差的樣品，小分子量蛋白解析結(jié)果與粒子特征是否有利于進(jìn)行準(zhǔn)確對(duì)位有關(guān)。然而即便較低分辨率的電鏡密度圖，也能提供一些頗有價(jià)值的結(jié)構(gòu)信息，尤其是對(duì)于結(jié)構(gòu)未知的樣品。EM重構(gòu)分辨率的提高是一個(gè)逐步改進(jìn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的過(guò)程，從樣品制備、數(shù)據(jù)收集到數(shù)據(jù)處理，每一步都需要精細(xì)控制、不斷優(yōu)化以至獲得最佳結(jié)果。

生物分子結(jié)構(gòu)靈活多變，不同功能狀態(tài)下，可能具有不同構(gòu)象或組裝方式，通過(guò)冷凍電鏡單顆粒技術(shù)觀察、甄別這些結(jié)構(gòu)變化，對(duì)于理解與功能相關(guān)的分子動(dòng)態(tài)很重要。冷凍電鏡單顆粒技術(shù)既能解析分子構(gòu)架又能提供分子動(dòng)態(tài)信息，對(duì)于研究生物大分子發(fā)揮功能的機(jī)制具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目前已吸引了越來(lái)越多的研究者應(yīng)用該技術(shù)于相關(guān)研究中。

圖1 EMDataBank數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)冷凍電鏡單顆粒技術(shù)解析的分辨率高于4 ?的EM密度圖數(shù)目(2008年至2016年9月數(shù)據(jù))Fig 1 Number of structures solved by single particle cryo-EM at a resolution of >4 ? (data released in EMDataBank from 2008 to September of 2016)

對(duì)冷凍電鏡單顆粒技術(shù)的廣泛關(guān)注將吸引更深入的技術(shù)研發(fā)。下一代直接電子探測(cè)設(shè)備將具備更高的信噪比，以期能夠用更少的數(shù)據(jù)量實(shí)現(xiàn)高分辨重構(gòu)，使粒子分類(lèi)更準(zhǔn)確，并且能夠?qū)π》肿恿繕悠愤M(jìn)行高分辨重構(gòu)。此外，迅速發(fā)展的相位板技術(shù)可提高電鏡圖像襯度，被用于記錄小分子量樣品的高襯度圖像[28]。Cryo-EM樣品制備方面，需要系統(tǒng)性地篩選條件或化學(xué)試劑，以增加樣品穩(wěn)定性、分散性及提高數(shù)據(jù)收集效率。同時(shí)，不同類(lèi)型載網(wǎng)(如金載網(wǎng)[29])及樣品支持膜(如石墨烯[30])的開(kāi)發(fā)以改善制樣效果、提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。最后，數(shù)據(jù)分析軟件的優(yōu)化，開(kāi)發(fā)更精準(zhǔn)的二維及三維分類(lèi)工具，使能夠有效區(qū)分樣品異質(zhì)性，實(shí)現(xiàn)高分辨重構(gòu)。

雖然生物分子自身固有的靈活性仍然是冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)的限制因素，但現(xiàn)代冷凍電鏡單顆粒技術(shù)能夠提供生物分子近生理?xiàng)l件下的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象動(dòng)態(tài)信息，對(duì)生物過(guò)程的分子機(jī)制予以前所未有的揭示。隨著樣品制備改進(jìn)、成像設(shè)備升級(jí)以及重構(gòu)算法優(yōu)化，未來(lái)將有望解析小于50 ku的分子。

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A brief introduction to single-particle cryo-EM of biological macromolecules

ZHANG Shi-chao, OUYANG Yan, LIU Shan-hui, ZHU Li

(School of Life Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) emerged as a tool to study structures of biological macromolecules (especially large complexes) ～30 years ago. Recently, due to the newly development of high-resolution imaging device and image processing methods, huge improvement in resolution has been achieved by cryo-EM single particle analysis. Nowadays it is possible to establish atomic or near-atomic structure models of lots of biological macromolecules with cryo-EM 3D reconstruction. As a result of this so-called revolutionary breakthrough, cryo-EM has been developing into a mainstream technique of structural biology in the last few years. This work introduces cryo-EM single-particle analysis of biological macromolecules and the new breakthrough in brief, and the future development is discussed as well.

cryo-EM; single particle; 3D reconstruction; protein structure

2016-09-21；

2016-09-29

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(31401101)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(lzujbky-2016-223)

張世超，博士研究生，研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，E-mail: zhangshch08@lzu.edu.cn

朱 莉，副教授，研究方向?yàn)殡婄R結(jié)構(gòu)生物學(xué)，E-mail: zhuli@lzu.edu.cn

Q6-33

A

2095-1736(2017)03-0074-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.074