桑 濱, 魯翠云, 李 超, 孫效文, 李丹彤

(1. 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 大連 116023; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所, 哈爾濱 150070)

微衛(wèi)星標(biāo)記分析3個(gè)耐寒鯉品種的遺傳多樣性

桑 濱1,2, 魯翠云2, 李 超2, 孫效文2, 李丹彤1

(1. 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 大連 116023; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所, 哈爾濱 150070)

耐寒品種的培育與養(yǎng)殖對(duì)于三北地區(qū)的鯉養(yǎng)殖業(yè)非常重要，對(duì)育成品種進(jìn)行遺傳分析有助于種質(zhì)資源的可持續(xù)利用。研究采用30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了3個(gè)遺傳背景相近的耐寒鯉品種松荷鯉(GG,CyprinuscarpioL.)、荷包紅鯉抗寒品系(HH,Cyprinuscarpiovar.wuyuanensis)與松浦鯉(SS,Cyprinuscarpiovar.Songpu)的遺傳多樣性。結(jié)果顯示：1)3個(gè)耐寒鯉品種GG、HH和SS平均有效等位基因數(shù)為4.392、4.501和4.518，平均觀測(cè)雜合度為0.801、0.815和0.809，平均多態(tài)信息含量為0.720、0.717和0.720，GG、HH和SS均屬高度多態(tài)水平(PIC>0.5)，3個(gè)群體偏離Hardy-Weinberg平衡的位點(diǎn)較少，種群結(jié)構(gòu)合理。2)計(jì)算3個(gè)耐寒鯉品種間的遺傳距離并繪制聚類圖，結(jié)果GG和HH先聚為一個(gè)分支，再與SS聚在一起?；赟tructure亞種群數(shù)檢驗(yàn)的分析結(jié)果顯示，當(dāng)K=2時(shí)，HH群體從3個(gè)群體中分離出來，GG和SS群體主要遺傳組分相同；當(dāng)K=3時(shí)，GG、HH和SS群體相互分離開，并且各自形成自己的遺傳組分。3)在26個(gè)標(biāo)記中檢測(cè)出品種特異等位基因73個(gè)，其中41個(gè)品種特異等位基因的頻率超過10%，進(jìn)而獲得基因型頻率大于10%的品種特異基因型161個(gè)，可用于3個(gè)耐寒鯉品種的種質(zhì)鑒定。

鯉；微衛(wèi)星；種質(zhì)鑒定；遺傳多樣性

鯉(CyprinuscarpioL.)是我國(guó)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的淡水性魚類，主要分布于東北、西北和華北的“三北”地區(qū)[1]。三北地區(qū)的年平均溫度低、冰封期長(zhǎng)等地域特點(diǎn)決定了該地區(qū)的鯉必須要耐高寒，以東北地區(qū)的黑龍江野鯉為代表，具有極強(qiáng)的抗寒和抗病能力，但生長(zhǎng)速度慢的特點(diǎn)限制了黑龍江野鯉的養(yǎng)殖和推廣。為開發(fā)適合三北地區(qū)大面積推廣養(yǎng)殖的鯉品種，黑龍江水產(chǎn)研究所利用雜交育種技術(shù)，將黑龍江鯉耐寒、荷包紅鯉配合力高、鏡鯉生長(zhǎng)速度快等特點(diǎn)集中于一身，培育出3個(gè)北方鯉養(yǎng)殖的當(dāng)家品種：荷包紅鯉抗寒品系、松浦鯉和松荷鯉(高寒鯉)[2]。由于3個(gè)鯉品種種源相近，僅通過體型以及個(gè)體性狀難以對(duì)其進(jìn)行區(qū)分，因此，開展鯉品種的分子鑒定極為重要。另外，用于鯉品種苗種生產(chǎn)的親本多采用群體中有較好經(jīng)濟(jì)性狀的個(gè)體，可能對(duì)其他生存相關(guān)的基因型產(chǎn)生負(fù)向效應(yīng)。已有研究報(bào)道松荷鯉和荷包紅鯉抗寒品系在人工繁育過程中遺傳多樣性降低[3-4]，松浦鯉養(yǎng)殖群體由于人工選擇力度較大經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)，環(huán)境適應(yīng)能力降低[5-6]，鯉養(yǎng)殖生產(chǎn)中出現(xiàn)的抗病力逐漸減弱和優(yōu)勢(shì)性狀不斷衰退的現(xiàn)象嚴(yán)重制約著鯉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。評(píng)估鯉品種的種質(zhì)資源好壞最直接的方法就是群體遺傳多樣性分析，因此，為保證鯉養(yǎng)殖品種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳，開展鯉養(yǎng)殖品種遺傳多樣性研究十分必要。

微衛(wèi)星標(biāo)記作為多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的共顯性分子標(biāo)記，適用于親緣關(guān)系較近的生物群體間的遺傳關(guān)系研究。盡管用微衛(wèi)星標(biāo)記分析荷包紅鯉抗寒品系、松浦鯉和高寒鯉的遺傳多樣性的研究較多[7-9]，但是由于研究中使用標(biāo)記的隨機(jī)性，尚不足以揭示3個(gè)品種的遺傳差異。因此，本研究從鯉微衛(wèi)星標(biāo)記庫(kù)中(http://www.carpbase.org)篩選了30個(gè)多態(tài)性高、條帶清晰并具有差異擴(kuò)增條帶的微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)此3個(gè)鯉養(yǎng)殖品種進(jìn)行了分子鑒定和遺傳多樣性分析，以期為鯉養(yǎng)殖品種的種質(zhì)鑒定、科學(xué)育種和資源保護(hù)提供可靠的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用魚均采自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實(shí)驗(yàn)站，從保種群體中隨機(jī)采集松荷鯉30尾(GG)、荷包紅鯉抗寒品系30尾(HH)以及松浦鯉30尾(SS)，剪取部分鰭條組織。將組織置于濾紙干燥以備提取基因組DNA[10]。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

用組織基因組DNA提取試劑盒(天根生物)提取基因組總DNA，紫外分光光度計(jì)(260/280)測(cè)定濃度和純度。將提取的DNA稀釋至100 ng/μL，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增與檢測(cè)

從鯉微衛(wèi)星標(biāo)記資源庫(kù)中，選擇多態(tài)性較高、擴(kuò)增穩(wěn)定的152個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記[11-13]，用6個(gè)個(gè)體進(jìn)行篩選，最終選擇了30個(gè)多態(tài)性較高、品種間有差異、條帶清晰且擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的標(biāo)記，用于3個(gè)鯉養(yǎng)殖品種的PCR擴(kuò)增。微衛(wèi)星引物的信息和擴(kuò)增情況如表1所示。PCR反應(yīng)體系為15 μL，包括終濃度為10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)、1.5 mmol/L MgCl2、50 mmol/L KCl、0.3 μmol/L引物與200 μmol/L dNTP、100 ng DNA模板和1 UTaqDNA聚合酶。反應(yīng)程序是94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)25次；最后72℃延伸5 min。8%Native-PAGE對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)，0.1%的AgNO3對(duì)其染色，拍照給出凝膠電泳結(jié)果。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Gel-Pro Analazer4.5軟件分析每個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記電泳條帶的長(zhǎng)度，獲得等位基因數(shù)據(jù)，匯總至Excel。利用Popgen32[14]軟件計(jì)算等位基因數(shù)(Observed number of alleles,N)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles,Ne)、觀測(cè)雜合度(Observed heterozygosity,Ho)和期望雜合度(Expected heterozygosity,He)。BOTSTEIN等[15]公式計(jì)算多態(tài)信息含量(Polymorphism information content, PIC):

式中Pj、Pi分別是群體的第j和第i個(gè)等位基因的頻率，n是某一個(gè)基因座位上的等位基因數(shù)。

圖1 松荷鯉(GG)、荷包紅鯉抗寒品系(HH)和松浦鯉(SS)在標(biāo)記HLJ1148的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Hardy-Weinberg平衡偏離通過χ2檢驗(yàn)估計(jì)，3個(gè)鯉養(yǎng)殖品種的Nei氏遺傳距離、遺傳相似系數(shù)(Genetic similarity index,I)、基因流(Nm)和群體間近交系數(shù)(FST)等遺傳分化情況由PopGen32軟件給出。

將Popgen32軟件生成的Nei氏遺傳距離帶入MEGA4.0軟件，利用UPGMA法構(gòu)建3個(gè)鯉養(yǎng)殖品種的遺傳關(guān)系聚類圖[16]。Structure2.3.4軟件[17]分析3個(gè)耐寒鯉品種的潛在亞種群數(shù)，借助遺傳結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)劃分最可能亞種群數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)3個(gè)耐寒鯉品種松荷鯉(GG)、荷包紅鯉抗寒品系(HH)和松浦鯉(SS)120尾樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在3個(gè)群體中共擴(kuò)增出724條穩(wěn)定、清晰的條帶，片段長(zhǎng)度在113～396 bp，每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)出等位基因數(shù)5～11個(gè)(表1)。部分Native-PAGE的結(jié)果如圖1所示。26個(gè)標(biāo)記檢測(cè)到品種特異等位基因73個(gè)，其中41個(gè)特異等位基因頻率超過10%。HLJ1093、HLJ1119、HLJ1148等6個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出GG群體特異等位基因7個(gè)，其中HLJ1148擴(kuò)增出的片段大小為172 bp和160 bp、HLJ1337的220 bp的等位基因頻率超過10%；HLJ385、HLJ1119、HLJ1120等6個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出HH群體特異等位基因7個(gè)，其中HLJ1120的236 bp和HLJ1148的208 bp等位基因頻率超過10%；HLJ385、HLJ1113和HLJ3938擴(kuò)增出SS群體特異等位基因3個(gè)，其中HLJ1113的164 bp等位基因的頻率達(dá)到10%。進(jìn)而獲得基因型頻率大于10%的品種特異基因型161個(gè)，可用于3個(gè)耐寒鯉品種的種質(zhì)鑒定。各標(biāo)記等位基因、特異基因型及其頻率見表2，等位基因按照從大到小排列，依次以A、B、C等字母表示。

表1 30對(duì)鯉微衛(wèi)星引物和PCR擴(kuò)增結(jié)果

表2 3個(gè)耐寒鯉品種在30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因頻率及特異基因型頻率

(續(xù)表2Continuedtable2)標(biāo)記Marker等位基因編號(hào)No.ofalleles等位基因/bpAllelesize等位基因頻率Allelefrequency特異基因型Specificgenotype基因型頻率GenotypefrequencyB2540.01670.18330.0834CE0.1000/0.0667C2420.21670.31670.2333CF0.10000.0667/D2320.13330.05000.2500BI/0.1667/E2280.18330.03330.1167FI0.1000//F2260.13330.0667/G2180.06660.0167/H2040.01670.01670.0333I1980.21670.28330.1833HLJ1093A2260.03330.21670.0334AA/0.1000/B2180.06670.0167/CC0.3000/0.1333C2140.56670.21670.3833AD/0.20000.0667D2100.18330.28330.3500DF/0.06670.1333E206/0.03330.0333F1940.10000.23330.1667G1900.0333/0.0333H1780.0167//HLJ1098A244/0.03330.1667BB/0.13330.0667B2240.21670.35000.2333AC//0.2000C2120.50000.21670.2333CC0.16670.0333/D2080.28330.11670.1667DE/0.1333/E200/0.13330.0833F192/0.15000.1167HLJ1113A1960.03330.16670.0333CC0.10000.0667/B1920.08330.13330.3500AD0.03330.2667/C1880.43330.23330.0833BD0.0333/0.2000D1800.21670.40000.2167DD0.03330.2000/E1720.06670.01670.0667DF//0.1000F164//0.1000G1600.16670.05000.1500HLJ1115A2320.1333/0.1500AD0.1000//B2240.0166/0.0500DE/0.13330.0667C2120.1333/0.0167CI0.1667//D2080.25000.17240.1333FI//0.1333E2040.01670.15520.1500DJ0.1000//F2000.01670.01720.1500IJ0.03330.1000/G1920.01670.05170.0334H1880.01670.0691/I1800.26670.18970.1833J1760.10000.1379/K1720.03330.10340.0833HLJ1116A3960.1167/0.1500CC0.1667/0.0333B3720.08330.18330.1167AE0.1000/0.0667C3600.36670.11670.1833BE/0.1667/D3440.13330.25000.3333EF/0.1333/E3360.25000.35000.2000F3240.05000.10000.0167HLJ1119A2060.05000.01670.0834BG0.10000.0333/B2020.10000.01670.0834EG/0.13330.0333C1900.0833/0.0333IK/0.1000/D1820.0667/0.1500E1700.10000.15000.0833F1660.0500//G1580.30000.25000.2000H1540.16670.28330.1000I150/0.10000.0833J142/0.0500/K1380.08330.13330.1833HLJ1120A3760.01670.06670.0667EI0.1667/0.1000B2960.06660.10000.0333FI/0.1000/C2760.0333/0.0833AJ/0.03330.1000D2680.0167/0.1333BK/0.1333/E2480.1833/0.1000F240/0.0667/G236/0.1000/H2120.01670.1000/I2080.60000.23330.1500J2040.06670.18330.4167K200/0.15000.0167

注：加下劃線的數(shù)字為群體特有的片段大小

2.2 3個(gè)耐寒鯉品種的遺傳參數(shù)分析

用Popgen32軟件計(jì)算3個(gè)耐寒鯉品種松荷鯉(GG)、荷包紅鯉抗寒品系(HH)和松浦鯉(SS)的遺傳參數(shù)(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)群體平均等位基因數(shù)(N)為6.633(HH)～6.733(GG)，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為4.392(GG)～4.518(SS)，平均觀測(cè)雜合度(Ho)為0.801(GG)～0.815(HH)，平均期望雜合度(He)為0.762(HH)～0.768(SS)，平均多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.717(HH)和0.720(GG和SS)，3個(gè)品種保種群體均屬于高度多態(tài)水平(PIC>0.5)[15]。對(duì)群體間遺傳參數(shù)進(jìn)行成對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示Ne在3個(gè)鯉群體間的差異性不顯著(P>0.05)；N在3個(gè)群體間的差異達(dá)到顯著水平，而GG和HH、HH和SS在30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)差異極顯著(P<0.01)；除此之外，HH和SS群體在He和PIC的差異均達(dá)到顯著水平，P分別為0.000和0.017；而GG和SS群體在Ho和PIC的差異達(dá)到顯著水平，P分別為0.04和0.05。

Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，GG群體在4個(gè)標(biāo)記顯著偏離平衡，其中HLJ1116、HLJ1119、HLJ1120表現(xiàn)為雜合子極顯著缺失；HH群體在10個(gè)標(biāo)記顯著偏離，其中HLJ1120和HLJ3938表現(xiàn)為雜合子顯著不足，HLJ1093、HLJ1120等8個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為雜合子顯著過剩；SS群體在4個(gè)標(biāo)記顯著偏離平衡，其中HLJ1120和HLJ3415表現(xiàn)為雜合子不足，HLJ3473和HLJE547表現(xiàn)為雜合子過剩。HLJ1120在3個(gè)群體均極顯著偏離平衡，表現(xiàn)為雜合子不足；標(biāo)記HLJ3291在GG和HH群體顯著偏離平衡，表現(xiàn)為雜合子過剩。3個(gè)群體的詳細(xì)統(tǒng)計(jì)參數(shù)見表3。

表3 3個(gè)鯉品種在30個(gè)標(biāo)記上的遺傳多樣性參數(shù)

(續(xù)表3 Continued table 3)

標(biāo)記MarkerGGNNeHoHePICPhweHHNNeHoHePICPhweSSNNeHoHePICPhweHLJ235285.6780.7330.8380.8010.58775.590.9330.8350.7970.06785.3250.7670.8260.7880.124HLJ265665.0000.8330.8140.7710.23865.0700.8670.8160.7740.049*64.6750.9330.7990.7540.224HLJ327663.4950.7330.7260.6810.12052.3870.6000.5910.5380.000**62.4930.7330.6090.5380.954HLJ329173.7980.7670.7490.7050.016*64.3580.9670.7840.7410.040*75.1430.8670.8190.7780.121HLJ335965.1140.9330.8180.7770.15863.0880.6330.6880.6360.25853.2470.7590.7040.6390.503HLJ341074.9450.7000.8110.7720.25575.7880.8330.8410.8050.06974.8000.9330.8050.7610.601HLJ341553.8300.9330.7510.6920.41985.6430.9000.8370.7990.20285.8070.80.8420.8050.001**HLJ346653.1200.7670.6910.6260.21641.9170.6000.4860.4470.52453.9300.8670.7580.7010.677HLJ347374.1480.8330.7720.7320.51976.3000.9310.8560.8210.28184.0050.8620.7640.7200.014*HLJ359776.0810.9000.850.8140.25576.0610.8670.8490.8150.05964.8000.9330.8050.7590.269HLJ363384.5460.7670.7930.7500.86353.1920.8670.6980.6220.57064.4260.8280.7880.7400.947HLJ363963.1320.7590.6930.6430.67563.7580.8000.7460.6900.001**62.1830.4070.5520.5090.303HLJ365675.8070.9670.8420.8040.11084.6390.7330.7980.7560.57674.3800.7500.7860.7380.738HLJ366253.1970.6670.6990.6300.63552.6050.9670.6270.5420.000**52.5530.6670.6190.5360.405HLJ393885.2630.8670.8240.7860.75185.5730.8330.8350.7970.002**95.3570.8670.8270.7910.261HLJE54762.6950.8670.6400.5950.33152.2840.7330.5720.5050.20942.1430.6670.5420.4800.000**平均Mean6.7334.3920.8010.7660.7200.3946.6334.5010.8150.7620.7170.2506.74.5180.8090.7680.7200.419

注：*表示顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)；**表示極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)

2.3 3個(gè)耐寒鯉品種的遺傳分化分析

3個(gè)鯉品種的群體間近交系數(shù)(FST)平均值為0.0527，表明5.27%的遺傳差異來自群體間，其中HH和SS群體的遺傳分化較大(FST=0.0418)，而GG和HH(FST=0.0391)、GG和SS(FST=0.0394)的遺傳分化相對(duì)較小。基因流(Nm)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果也得出了相似的結(jié)論，HH和SS群體間的基因流動(dòng)(Nm=5.7375)小于GG和HH(Nm=6.1403)以及GG和SS(Nm=6.0936)。GG、HH和SS的遺傳距離(Ds)和遺傳相似度(I)見表4，HH和SS間的遺傳距離最遠(yuǎn)(0.300)，其次為SS和GG(0.288)，GG和HH間遺傳距離最近(0.283)。利用UPGMA法構(gòu)建的群體遺傳關(guān)系聚類圖如圖2所示。GG和HH先聚類為一支，再與SS聚在另一支。Structure分析結(jié)果顯示，當(dāng)K=2時(shí)，HH群體從3個(gè)群體中分離出來，GG和SS群體主要遺傳組分相同；當(dāng)K=3時(shí)，GG、HH和SS群體相互分離開，并且各自形成自己的遺傳組分(圖3)。

表4 群體間遺傳距離與遺傳相似度

注：對(duì)角線下方的是遺傳相似度；對(duì)角線上方的是遺傳距離

圖2 依據(jù)群體間的遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖

圖3 利用Structure構(gòu)建的耐寒鯉品種結(jié)構(gòu)(顯示當(dāng)潛在亞種群等于2、3時(shí)種群的聚類關(guān)系)

注：縱坐標(biāo)為各群體間個(gè)體占其祖先成份的百分比；每個(gè)垂直條代表一個(gè)個(gè)體，鯉魚品種沿橫坐標(biāo)指示

3 討論

根據(jù)Barker[18]的微衛(wèi)星選擇標(biāo)準(zhǔn)，若較準(zhǔn)確地對(duì)群體遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估每個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)至少為4，本研究所使用的微衛(wèi)星標(biāo)記等位基因數(shù)為5～11，能夠較好地用于遺傳多樣性評(píng)估。其中26個(gè)標(biāo)記在3個(gè)鯉群體擴(kuò)增出特異等位基因，GG、HH、SS分別獲得了7個(gè)、7個(gè)和3個(gè)特異等位基因，其中3個(gè)、2個(gè)和1個(gè)特異等位基因的頻率超過10%；其余56個(gè)特異等位基因?yàn)?個(gè)品種共享而區(qū)別于第3個(gè)品種。在此基礎(chǔ)上，獲得了頻率大于10%的特異基因型，可用于3個(gè)抗寒鯉品種的分子鑒定。此結(jié)果表明以相似種源雜交形成的3個(gè)鯉耐寒品種均具有了各自獨(dú)特的等位基因及基因型，也說明3個(gè)品種經(jīng)過獨(dú)立選育，基本上形成了特異的遺傳結(jié)構(gòu)。

平均雜合度是衡量群體遺傳多樣性的重要參數(shù)，可以反映群體遺傳多樣性水平的高低[19]。本研究中3個(gè)耐寒鯉品種GG、HH、SS的平均期望雜合度值(0.766、0.763、0.768)均小于平均觀測(cè)雜合度值(0.801、0.815、0.809)，表現(xiàn)為雜合子過剩。本研究結(jié)果中，GG和HH的Ho(0.801、0.815)高于梁利群等[8]的研究結(jié)果(0.355、0.305)和杜長(zhǎng)斌等[4]的研究結(jié)果(0.4、0.38)，SS的Ho(0.809)也高于賈志英等[9]的研究結(jié)果(0.572)，造成此結(jié)果的原因可能與篩選到的微衛(wèi)星標(biāo)記的高度多態(tài)性和較多的標(biāo)記數(shù)量有關(guān)。根據(jù)Takezaki等[20]的研究，通過微衛(wèi)星標(biāo)記計(jì)算的Ho平均值應(yīng)為0.3～0.8，3個(gè)耐寒鯉品種的Ho均超出此范圍，可能是由兩個(gè)主要原因造成的，一是3個(gè)品種均為雜交選育種，每個(gè)品種至少含有2個(gè)以上的種源；二是雜合個(gè)體通常具有較高的生產(chǎn)性能，在以生長(zhǎng)和表型為目標(biāo)的人工選育群體中，易于造成雜合個(gè)體的富集，使雜合度偏高。平均多態(tài)信息含量(PIC)是另一個(gè)衡量群體遺傳多樣性常用的參數(shù)，Botstein等[15]認(rèn)為：當(dāng)PIC≥0.5時(shí)，為高度多態(tài)水平。3個(gè)耐寒鯉品種GG、HH、SS在30個(gè)標(biāo)記上的平均多態(tài)信息含量相對(duì)較高，依次為0.720、0.717和0.720，與梁利群等[8](GG、HH，遺傳多樣性豐富)和賈志英等[9](SS，較豐富的遺傳多樣性)結(jié)果相同。所有標(biāo)記除HLJ3466(在HH群體PIC=0.447)和HLJE547(在SS群體PIC=0.480)外，在3個(gè)群體中均屬高度多態(tài)位點(diǎn)(PIC>0.500)。這說明3個(gè)群體遺傳多樣性水平較高，同時(shí)也證明了以上多態(tài)位點(diǎn)對(duì)于3個(gè)耐寒鯉品種屬于高度多態(tài)位點(diǎn)。本研究結(jié)果表明3個(gè)耐寒鯉品種松荷鯉、荷包紅鯉抗寒品系和松浦鯉群體結(jié)構(gòu)合理，具備適應(yīng)變化多樣環(huán)境的能力，在遺傳育種和改良方面蘊(yùn)藏著巨大的潛能，同時(shí)說明黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)站以上3個(gè)耐寒鯉品種種質(zhì)資源良好。

群體間近交系數(shù)值是體現(xiàn)群體間的遺傳分化程度不可或缺的量度指標(biāo)。根據(jù)Wright[21]對(duì)遺傳分化指數(shù)和種群基因流系數(shù)(Nm)的界定，本研究中3個(gè)耐寒鯉品種間FST值較小(0.0527)而Nm值較大(4.4902)，因此屬于輕度遺傳分化水平，不同鯉群體之間存在一定的基因流動(dòng)，但因?yàn)榇嬖谄贩N間的隔離，基因流動(dòng)并不頻繁。群體聚類圖可以更直接地反應(yīng)群體間的遺傳分化，荷包紅鯉抗寒品系和松荷鯉可以聚類為一支，可能是因?yàn)榫^承了耐高密度養(yǎng)殖的荷包紅鯉的基因多于松浦鯉，或者松浦鯉群體選育過程中過多地繼承了德國(guó)鏡鯉的基因?qū)е缕鋯为?dú)聚類為一支。而Structure亞種群數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)K=2時(shí)，松荷鯉和松浦鯉遺傳組分接近，這與2個(gè)品種選育過程中和黑龍江鯉回交密切相關(guān)，也可能GG、SS群體選育過程中分別與散鱗鏡鯉、德國(guó)鏡鯉雜交而融入鏡鯉的遺傳組分有關(guān)；而K=3時(shí)，3個(gè)群體均形成了各自獨(dú)特的遺傳組分，形成了具有不同性狀優(yōu)勢(shì)的新品種。雜種優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)弱由雙親優(yōu)勢(shì)性狀是否得到互相補(bǔ)充決定，本研究對(duì)鯉品種進(jìn)行Structure亞種群數(shù)檢驗(yàn)的目的之一就是通過遺傳組分的分析從抗寒鯉材料中篩選遺傳組分差異相對(duì)較大的個(gè)體進(jìn)行雜交，為抗寒鯉品種的進(jìn)一步選育提供科學(xué)有效的指導(dǎo)。

群體遺傳多樣性分析作為評(píng)價(jià)品種環(huán)境適應(yīng)能力的手段，對(duì)養(yǎng)殖品種進(jìn)一步選育的指導(dǎo)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究選取了北方地區(qū)的抗寒鯉品種(松荷鯉、荷包紅鯉抗寒品系和松浦鯉)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析其遺傳多樣性并進(jìn)行種質(zhì)鑒定，發(fā)現(xiàn)26個(gè)標(biāo)記可根據(jù)擴(kuò)增得到的特異性片段大小對(duì)以上3個(gè)耐寒鯉品種進(jìn)行分子鑒定，15個(gè)標(biāo)記可通過獲得的基因型鑒別3個(gè)耐寒鯉品種，其遺傳多樣性良好，種群能穩(wěn)定地生存繁衍。鑒于不同微衛(wèi)星標(biāo)記在鯉品種間等位基因頻率和基因型頻率較低的特點(diǎn)，建議在利用特異性擴(kuò)增片段和基因型進(jìn)行種質(zhì)鑒定的工作中可通過增加樣本數(shù)、不同標(biāo)記組合或者結(jié)合其他鑒定方法來達(dá)到降低風(fēng)險(xiǎn)的目的。如果3個(gè)抗寒鯉品種中可用于種質(zhì)鑒定的低頻率基因型在選育過程中丟失，品種間不同的優(yōu)勢(shì)性狀可能會(huì)因此喪失，以至于種質(zhì)發(fā)生退化。因此，在鯉品種的選育過程中，除了利用分子標(biāo)記技術(shù)使具優(yōu)勢(shì)性狀的基因型得到純合之外，還應(yīng)該篩選遺傳組分差異比較大或者親緣關(guān)系比較疏遠(yuǎn)的個(gè)體進(jìn)行雜交以達(dá)到改善育種群體遺傳結(jié)構(gòu)的目的，這樣才能有效避免近親繁殖可能帶來的遺傳衰退。

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Genetic diversity of three cold-resistant varieties of common carp analyzed by microsatellite markers

SANG Bin1,2, LU Cui-yun2, LI Chao2, SUN Xiao-wen2, LI Dan-tong1

(1. College of Fisheries and Life, Dalian Ocean University, Dalian 116023; 2. Heilongjiang Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070， China)

Cultivation and breeding of cold resistant varieties are very important for carp farming in the Three-North Region, meanwhile, genetic analysis of cultivars is helpful to the sustainable utilization of the germplasm resources.Comparative analysis of genetic diversity was conducted using microsatellite markers on three cold-resistant varieties of common carp with similar genetic background,CyprinuscarpioL. (GG),Cyprinuscarpiovar.wuyuanensis(HH), andCyprinuscarpiovar.Songpu(SS).The results showed as following: (1) The average effective number of alleles of three cold-resistant varieties of common carp (GG, HH, SS) were 4.392, 4.501 and 4.518, respectively. Average observed heterozygosities were 0.801, 0.815 and 0.809, respectively. The average polymorphism information contents were 0.720 and 0.717, 0.720, respectively. Three cold-resistant varieties of common carp were of highly polymorphic level. Three populations deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium and the population structure were reasonable. (2) A tree diagram was constructed by clustering analysis according to genetic distance of three breeding carp. The results indicated that SS clustering was a separate branch firstly, followed by GG and HH. In accordance with the results of Structure analysis, HH separated as a group alone, GG and SS clustered together for the modelK=2.Whereas GG, HH, and SS were clustered into 3 different groups for the modelK=3.(3)seventy-three specific alleles were detected from 26 markers, of which 41 specific alleles frequency reached more than 10%. There were 161 specific genotypes with genotypic frequencies over 10%, which can be used for germplasm identification of 3 varieties of cold resistant carp. The purpose of this study was to provide a beneficial reference bases for the breeding and germplasm identification of common carp.

common carp; microsatellite; germplasm identification; genetic diversity

2016-05-09；

2016-08-02

農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目(2016X15)；國(guó)家水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺(tái)項(xiàng)目(2016DKA30470)

桑 濱, 碩士, 主要從事水產(chǎn)生物技術(shù)研究，E-mail:BinSang2016@163.com

李丹彤, 教授, 主要從事海洋生物技術(shù)的研究,E-mail:lidantong@dlou.edu.cn

Q75；Q959.46+8

A

2095-1736(2017)03-0024-09

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.024