劉 祥， 陳 琛， 陳春琳， 吳三橋

(陜西理工大學(xué) 中德天然產(chǎn)物研究所 陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心， 漢中 723001)

豬重要感染病毒蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原表位分析及三聯(lián)表位多肽疫苗的重組預(yù)測(cè)

劉 祥， 陳 琛， 陳春琳， 吳三橋

(陜西理工大學(xué) 中德天然產(chǎn)物研究所 陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心， 漢中 723001)

為設(shè)計(jì)豬重要感染病毒的蛋白表位多肽疫苗，選取豬感染病毒的候選疫苗蛋白：豬繁殖與呼吸綜合征病毒的GP5蛋白，豬圓環(huán)病毒2型的CAP蛋白，豬瘟病毒的E2蛋白。綜合ABCpred和BepiPred方案，預(yù)測(cè)候選蛋白的B細(xì)胞表位；利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法預(yù)測(cè)蛋白的CTL表位；采用MHC-Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合肽在線(xiàn)程序預(yù)測(cè)蛋白的Th表位。使用SOPMA方法與DNASTAR軟件分析候選蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步驗(yàn)證B/T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。然后，通過(guò)Protean程序重組拼接獲得的B/T細(xì)胞抗原表位。結(jié)果顯示GP5蛋白具有4個(gè)優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位，CAP、E2蛋白分別具有5個(gè)B細(xì)胞表位；GP5、CAP與E2蛋白各具有1個(gè)CTL表位；GP5、E2蛋白分別具有2個(gè)Th表位，CAP蛋白存在1個(gè)Th表位。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示預(yù)測(cè)獲得的B/T細(xì)胞表位均處于蛋白易于產(chǎn)生表位的暴露表面、無(wú)規(guī)則卷曲與轉(zhuǎn)角等位置，驗(yàn)證了B/T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。Protean程序重組拼接獲得優(yōu)勢(shì)的B/T細(xì)胞抗原表位。最終設(shè)計(jì)獲得抗原性較好的豬病毒三聯(lián)表位多肽，為豬易感病毒的多聯(lián)疫苗開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

豬病毒；表位疫苗；二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；抗原分析

豬呼吸道疾病是誘發(fā)豬死亡的重要原因之一，主要癥狀為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、生長(zhǎng)緩慢等，給豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。感染的病毒主要為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)[2]，豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)[3]以及豬瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)[4]。針對(duì)豬病毒感染的治療尚無(wú)高效藥物，主要為抗病毒劑如干擾素、白細(xì)胞介導(dǎo)素、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)移因子等，治療成本高[5]。研究發(fā)現(xiàn)豬病毒疾病防治根本途徑為免疫制劑[6]。目前，人們針對(duì)豬病毒蛋白開(kāi)展了一些研究，證實(shí)PRRSV、PCV2與CSFV病毒抗原性較好的蛋白分別為GP5、CAP和E2[7-9]，并進(jìn)行了免疫功能的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這些蛋白是很好的候選蛋白疫苗，但均處于研究的初步階段，商業(yè)化較少見(jiàn)[10]。而且豬病毒感染往往是混合型，給防治帶來(lái)一定難度，有必要開(kāi)發(fā)新型的蛋白疫苗。

表位疫苗是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型疫苗，具有安全、穩(wěn)定、產(chǎn)量高、免疫效果好，以及可人為設(shè)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)。在腫瘤、肝炎、流感等疾病防治上均有研究[11]，是疫苗研究的新方向。然而，表位疫苗在豬病毒感染的防治上尚未展開(kāi)。我們期望通過(guò)生物信息學(xué)方法，將豬病毒候選蛋白疫苗進(jìn)行B/T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)、重組拼接，以期設(shè)計(jì)安全、免疫簡(jiǎn)潔與高效的豬病毒蛋白表位多肽重組疫苗，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)豬單次免疫就可有效抵御3種病毒的感染。

1 材料與方法

1.1 材料

選取豬繁殖與呼吸綜合征病毒，豬圓環(huán)病毒2型，以及豬瘟病毒的候選蛋白疫苗，分別為GP5、CAP與E2，其N(xiāo)CBI網(wǎng)站公布的氨基酸序列登錄號(hào)分別為ACJ23261.1、AAW79866.1、NP_777498.1。

1.2 方法

1.2.1 B細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 采用BepiPred和ABCpred方法聯(lián)合預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位。最終B細(xì)胞表位為兩種方案共有的氨基酸序列[12]。

1.2.2 T細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)抗原表位采用量化矩陣與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法預(yù)測(cè)，選擇HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205分子結(jié)合肽，通過(guò)CTLpred程序預(yù)測(cè)。輔助T細(xì)胞(Th)抗原表位預(yù)測(cè)選擇結(jié)合肽類(lèi)型為DRB1-0101、DRB1-0102和DRB1-0301，預(yù)測(cè)的軟件為：http://www.imtech.res.in/raghava/propred/[13]。

1.2.3 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)采用SOPMA方法與DNASTAR軟件進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè)，從而檢測(cè)獲得各個(gè)蛋白B/T細(xì)胞表位信息。目的是驗(yàn)證獲得的B/T細(xì)胞表位是否處于蛋白抗原性較好的肽段位置。

1.2.4 重組表位疫苗的設(shè)計(jì) 將各個(gè)蛋白預(yù)測(cè)獲得的B/T細(xì)胞表位，按照B細(xì)胞表位、CTL細(xì)胞表位及Th細(xì)胞表位順序進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)表位之間通過(guò)4個(gè)甘氨酸(GGGG)進(jìn)行柔性連接，以盡量減少各自表位間的相互干擾。然后，通過(guò)DNASTAR軟件分析表位的不同排列方式，以各表位相對(duì)獨(dú)立且具有較好抗原性參數(shù)的組合方式，作為重組表位多肽的氨基酸序列。最后，將多肽序列翻譯為核酸序列，獲得重組表位多肽的核酸序列。

2 結(jié)果

2.1 B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

綜合BepiPred和ABCpred兩種方法預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位。BepiPred方法預(yù)測(cè)蛋白B細(xì)胞表位結(jié)果如表1所示；ABCpred方法預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。綜合BepiPred和ABCpred兩種方案的共同序列區(qū)段，最終獲得豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位區(qū)段為：32～36，98～101，164～168，184～192；豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白B細(xì)胞表位區(qū)段為：60～65，79～88，109～116，164～168，172～180；豬瘟病毒E2蛋白B細(xì)胞表位區(qū)段為：25～32，89～97，142～147，156～163，270～285。

表1 BepiPred方法預(yù)測(cè)蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置

表2 ABCpred方法預(yù)測(cè)蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置

2.2 T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)2.2.1 CTL細(xì)胞表位預(yù)測(cè) CTL抗原表位預(yù)測(cè)采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法，分子結(jié)合肽選擇HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205，結(jié)果見(jiàn)表3。綜合多肽共有的區(qū)段，獲得豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白的優(yōu)勢(shì)CTL細(xì)胞表位區(qū)段為119～127的ALICFVIRL；豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白CTL細(xì)胞表位區(qū)段為22～29的ILRRRPWL；豬瘟病毒E2蛋白CTL細(xì)胞表位區(qū)段為349～357的ALLGGRYVL。

2.2.2 Th細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法預(yù)測(cè)Th抗原表位，預(yù)測(cè)結(jié)合多肽種類(lèi)選擇DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*0301，結(jié)果見(jiàn)表4。綜合多肽共有的區(qū)段，獲得豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白優(yōu)勢(shì)Th細(xì)胞表位區(qū)段為28～36的LVNASNNNS，以及125～133的IRLAKNCMS；豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白Th細(xì)胞表位區(qū)段為185～193的LRLQTAGNV；豬瘟病毒E2蛋白Th細(xì)胞表位區(qū)段為227～232的LVNETG；以及348～354的VALLGGR。

表3蛋白CTL抗原表位預(yù)測(cè)

表4 蛋白Th抗原表位預(yù)測(cè)

2.3 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

為檢測(cè)獲得的3種蛋白B細(xì)胞與T細(xì)胞表位的準(zhǔn)確性，利用DNASTAR軟件和SOPMA方法對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，驗(yàn)證獲得的蛋白B/T細(xì)胞抗原表位是否處于易于產(chǎn)生抗體的無(wú)規(guī)則卷曲、暴露表面及轉(zhuǎn)角等位置。使用DNASTAR程序，從蛋白的親水性、可柔性、表面可極性與抗原指數(shù)方面，預(yù)測(cè)的3種蛋白抗原性結(jié)果如圖1～3所示。應(yīng)用SOPMA方法預(yù)測(cè)3種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖4～6所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的3種蛋白B/T細(xì)胞表位均處于抗原性較好的區(qū)段，支持預(yù)測(cè)的B/T細(xì)胞抗原表位的合理性。

2.4 表位多肽疫苗的重組

將預(yù)測(cè)獲得的3種細(xì)菌各自的B/T細(xì)胞表位，分別按照B細(xì)胞表位、CTL表位、Th表位順序進(jìn)行編號(hào)，再通過(guò)Protean程序分析線(xiàn)性表位的各種排列方式，以重組的多表位間相對(duì)獨(dú)立，抗原性參數(shù)較好為標(biāo)準(zhǔn)；并且各多肽間柔性接頭氨基酸采用4個(gè)甘氨酸(GGGG)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白表位排列順序?yàn)椋篹pitope4-epitope6-epitope7-epitope3-epitope5-epitope2-epitope1；豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白表位排列順序?yàn)椋篹pitope1-epitope3-epitope4-epitope6-epitope7-epitope2-epitope5；豬瘟病毒E2蛋白表位排列順序?yàn)椋篹pitope3-epitope4-epitope6-epitope7-epitope1-epitope8-epitope5-epitope2。再將3種菌各自預(yù)測(cè)完成的串聯(lián)表位進(jìn)一步拼合，并采用Protean程序進(jìn)行分析，獲得抗原性參數(shù)較好的重組表位多肽，如圖7所示。至此，設(shè)計(jì)獲得豬重要感染病毒的三聯(lián)表位疫苗多肽的序列為：SAATPLTRVGGGGLVNASNNNSGGGGIRLAKNCMSGGGGGGKVEGGGGALICFVIRLGGGGTAGYGGGGSNNNSGGGGTTVKTPGGGGSPITQGDRGGGGKPVLDGGGGILRRRPWLGGGGLRLQTAGNVGGGGFLPPGGGSNPGGGGDYFQPNNKRGGGGVSPTTLGGGGRRDKPFPHGGGGALLGGRYVLGGGGLVNETGGGGGGLTTTWKEGGGGVALLGGRGGGGERLGPMPCRPKEIVSSGGGGPSTEEMGDD(下劃線(xiàn)表示接頭氨基酸序列)；翻譯成核酸序列為：TCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTGGTGGCGGTGGCCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCGGTGGCGGTGGCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCGGTGGCGGTGGCGGAGGTAAGGTTGAGGGTGGCGGTGGCGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGGTGGCGGTGGCACCGCCGGATATGGTGGCGGTGGCAGCAACAACAACAGCGGTGGCGGTGGCACCACAGTCAAAACGCCCGGTGGCGGTGGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGTGGCGGTGGCAAACCTGTCCTAGATGGTGGCGGTGGCATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGGTGGCGGTGGCCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGGTGGCGGTGGCTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCGGTGGCGGTGGCGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAGGTGGCGGTGGCGTGAGCCCAACAACTCTGGGTGGCGGTGGCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCACGGTGGCGGTGGCGCACTGTTAGGAGGAAGATATGTCCTGGGTGGCGGTGGCTTGGTAAATGAGACAGGTGGTGGCGGTGGCGGTCTCACCACCACCTGGAAAGAAGGTGGCGGTGGCGTAGCACTGTTAGGAGGAAGAGGTGGCGGTGGCGAAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCCAAAGAGATTGTCTCTAGTGGTGGCGGTGGCCCATCAACTGAGGAAATGGGAGATGAC(下劃線(xiàn)為接頭氨基酸的核酸序列)。

圖1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白表位分子的抗原性分析

Fig 1 Antigenicity analysis of PRRSV GP5 protein epitopes molecular

圖2 豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白表位分子的抗原性分析

圖3 豬瘟病毒E2蛋白表位分子的抗原性分析

圖4 DNASTAR軟件預(yù)測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

c：無(wú)規(guī)則卷曲；e：β-片層；h：a-螺旋；t：β-轉(zhuǎn)角

圖5 DNASTAR軟件預(yù)測(cè)豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

c：無(wú)規(guī)則卷曲，e：β-片層，h：a-螺旋，t：β-轉(zhuǎn)角

圖6 DNASTAR軟件預(yù)測(cè)豬瘟病毒E2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

c：無(wú)規(guī)則卷曲；e：β-片層；h：a-螺旋；t：β-轉(zhuǎn)角

圖7 重組多表位分子的抗原性分析

3 討論

表位疫苗是利用體外表達(dá)或人工合成細(xì)菌、病毒蛋白結(jié)構(gòu)中具有免疫合性的片段而制成的疫苗[14]；具有安全、穩(wěn)定、免疫效果好，以及可人為設(shè)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)。在艾滋病、腫瘤、肝炎、寄生蟲(chóng)和流感等疾病防治上均有大量研究[11,15]。生物信息學(xué)可實(shí)現(xiàn)蛋白表位的預(yù)測(cè)、設(shè)計(jì)，增加試驗(yàn)的針對(duì)性，為人們合成表位疫苗奠定基礎(chǔ)[16-17]。表位預(yù)測(cè)類(lèi)型可分為線(xiàn)性表位與構(gòu)象型表位兩種[18]。線(xiàn)性表位基于蛋白的氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確度可達(dá)60 %；構(gòu)象型表位基于目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，對(duì)于未知結(jié)構(gòu)蛋白預(yù)測(cè)存在一定難度[19]?？傮w上，構(gòu)象型表位較線(xiàn)性表位研究缺乏，技術(shù)手段上也不成熟[20]，現(xiàn)行的表位預(yù)測(cè)大多針對(duì)線(xiàn)性表位。

目前，關(guān)于豬呼吸道病毒的表位疫苗研究尚處于起步階段。有人合成呼吸綜合征病毒GP5蛋白部分抗原，制備抗體進(jìn)行豬病毒的檢測(cè)[21]；吳勝昔等設(shè)計(jì)獲得了免疫原性較好的豬圓環(huán)病毒CAP表位多肽[8]。然而這些初步設(shè)計(jì)的表位疫苗，僅針對(duì)單個(gè)病毒，且免疫功能研究缺乏，對(duì)于防治豬呼吸道病毒疾病具有局限性。本研究從豬呼吸道病毒主要感染病毒著手，設(shè)計(jì)了三聯(lián)表位多肽疫苗，有望進(jìn)一步提高豬呼吸道病毒感染的防治效果。

B細(xì)胞表位是抗原被B細(xì)胞表面受體或抗體特異性識(shí)別并相互結(jié)合的多肽片段，其預(yù)測(cè)常見(jiàn)的方法主要應(yīng)用BepiPred、ABCpred及DNASTAR軟件。BepiPred主要利用氨基酸的性質(zhì)和隱形馬爾可夫模型預(yù)測(cè)線(xiàn)性表位[22]；ABCpred是基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，準(zhǔn)確率達(dá)65.9%[23]。前期，我們通過(guò)兩種方法的結(jié)合，對(duì)豬鏈球菌蛋白和溶藻弧菌外膜蛋白U開(kāi)展了B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)[12-13]。本研究采用BepiPred和ABCpred聯(lián)合預(yù)測(cè)的方式，對(duì)3種病毒的蛋白進(jìn)行了B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)。

T細(xì)胞表位包含有CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)表位和Th(T輔助細(xì)胞)表位，分別是抗原中與MHC-Ⅰ、MHC-Ⅰ類(lèi)分子結(jié)合的短肽[24-25]。CTL預(yù)測(cè)常采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法結(jié)合量化矩陣法[26]，在細(xì)菌、病毒蛋白CTL抗原表位預(yù)測(cè)上研究廣泛[12, 27]。Th表位預(yù)測(cè)方法在病毒蛋白、細(xì)菌蛋白均實(shí)現(xiàn)了成功預(yù)測(cè)[13,28]。但在豬呼吸道病毒T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)上尚未開(kāi)展。本試驗(yàn)借助于T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)的成熟方法，預(yù)測(cè)獲得了CTL、Th細(xì)胞表位，為防治豬呼吸道病毒感染提供科學(xué)依據(jù)。

表位間的柔性連接接頭使得各表位間相對(duì)獨(dú)立，具有分子剛性[29]。采用較多的柔性接頭氨基酸序列有GGGG、GGGGS、KK與AAY[30-31]。本研究采用GGGG氨基酸接頭，并通過(guò)Protean程序?qū)Σ煌砦黄唇臃绞竭M(jìn)行優(yōu)化，最終預(yù)測(cè)獲得抗原性較好的重組表位多肽，為豬易感病毒的多聯(lián)疫苗開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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The secondary structure, antigen epitope analysis and recombination prediction triple epitope peptide vaccine of porcine important infection virus protein

LIU Xiang, CHEN Chen, CHEN Chun-lin, WU San-qiao

(Chinese-German Joint Institute for Natural Product Research, Shaanxi University of Technology, Shaanxi Engineering Research Center of Tall Gastrodia Tuber and Medical Dogwood, Hanzhong 723001, China)

In order to design protein epitope polypeptide for important infectious virus of porcine, the candidate proteins vaccine of swine infection virus was selected. The selected proteins included GP5 protein of PRRSV (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), CAP protein of PCV2 (porcine circovirus type 2), and E2 protein of CSFV (classical swine fever virus). ABCpred and BepiPred prediction programs were used to predict B cell epitopes, quantitative matrix, the artificial neural network was used to predict CTL cell epitopes, and an online server prediction was used to analysis MHC class Ⅱ peptide binding affinity. The secondary structure further verifying the accuracy of B/T cell epitopes was analyzed by SOPMA and DNASTAR software. The B/T cell epitopes were recomposed by protean program. The results showed that GP5 protein had 4 B cell epitopes, CAP and E2 had 5 B cell epitopes, and GP5, CAP and E2 protein had 1 CTL cell epitopes. GP5 and E2 protein had 2 Th cell epitopes, and CAP protein had 1 Th cell epitopes. The secondary structure showed that most of the B/T cell epitopes were located in the exposed surface, the random coil and the corner, which verified the prediction accuracy of B/T cell epitopes. The B/T cell epitopes were recomposed by protean program, and triple epitope vaccine of porcine virus holding better antigen was designed finally, and laid the foundation for the development of swine virus multi vaccine.

porcine virus; epitope vaccine; secondary structure analysis; antigenic analysis

2016-05-16；

2016-05-27

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-088)；陜西理工大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目(SLGKY16-13)

劉 祥，博士，講師，主要從事蛋白質(zhì)組學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail：liuxiang888525@163.com

S852.6

A

2095-1736(2017)03-0018-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.018