裴 薇， 梁 易， 范 靜， 安紅強(qiáng)， 王萬(wàn)軍

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031)

鐵皮石斛多聚泛素基因Polyubiquitin1(DoUb1)的克隆及表達(dá)分析

裴 薇， 梁 易， 范 靜， 安紅強(qiáng)， 王萬(wàn)軍

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031)

采用RACE (rapid amplification of cDNA ends) 技術(shù)獲得鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)Polyubiquitin1 (DoUb1) ，該基因全長(zhǎng)1985 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?371 bp，編碼457個(gè)氨基酸殘基的親水性蛋白，分子質(zhì)量為51 179.7 ku，理論等電點(diǎn)pI為7.76；亞細(xì)胞定位分析表明該基因產(chǎn)物主要在細(xì)胞質(zhì)或線粒體基質(zhì)中發(fā)揮作用。DoUb1與水稻、玉米及谷子等單子葉植物的多聚泛素基因親緣關(guān)系較近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)分析結(jié)果顯示，DoUb1在鐵皮石斛幼苗根和葉中表達(dá)量較高，莖中表達(dá)量較低；在干旱脅迫和溫度脅迫過(guò)程中的表達(dá)量都低于正常狀況，在干旱脅迫的早期，表達(dá)量降低，6 h時(shí)達(dá)到最低，之后隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢升高；在溫度脅迫情況下，DoUb1具有與干旱脅迫相近的響應(yīng)特性，但低溫脅迫相比高溫脅迫下，DoUb1表達(dá)量更低，表明該基因?qū)Φ蜏孛{迫更敏感，結(jié)果為后期研究鐵皮石斛生長(zhǎng)發(fā)育提供一定基礎(chǔ)。

RACE；鐵皮石斛；Polyubiquitin；RT-qPCR

細(xì)胞內(nèi)永不停歇地進(jìn)行著蛋白質(zhì)的合成、更新與降解，蛋白質(zhì)的選擇性降解在這一過(guò)程中起著非常重要的作用。泛素(Ubiquitin)是這一過(guò)程中的一個(gè)重要成員。泛素是Goldstein首次于1975年從小牛胰臟中分離得到一個(gè)含76個(gè)氨基酸殘基的小肽，后來(lái)人們又發(fā)現(xiàn)該小肽廣泛存在于所有真核細(xì)胞中，并因而得名[1]。泛素基因家族可分為UbEP(UbiquitinExtensionProtein)和Polyubiquitin兩類。UbEP是只編碼1個(gè)泛素單位的泛素蛋白基因，而Polyubiquitin為多聚泛素蛋白基因，其編碼產(chǎn)物為多個(gè)串聯(lián)的泛素單位頭尾相連形成[2]。UbEP編碼的泛素單體通常作為分子伴侶參與核糖體的裝配過(guò)程，多聚泛素基因表達(dá)產(chǎn)物主要參與泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin-proteasome system, UPS)中的蛋白質(zhì)水解[3]。

在高等真核生物中，Polyubiquitin基因的表達(dá)相當(dāng)復(fù)雜，在不同的細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育時(shí)期和脅迫條件下，Polyubiquitin基因表達(dá)情況不同[4]。研究發(fā)現(xiàn)高等植物在應(yīng)對(duì)高溫、嚴(yán)寒和干旱等外界非生物脅迫或生物脅迫下均會(huì)產(chǎn)生各種脅迫應(yīng)答蛋白，而這些蛋白會(huì)隨著逆境的解除而被陸續(xù)降解[5]。泛素基因在逆境條件下表達(dá)會(huì)增加，異常蛋白降解速率加快，這種結(jié)果間接說(shuō)明泛素系統(tǒng)在生物逆境適應(yīng)中的作用[6]。

當(dāng)細(xì)胞所處的環(huán)境溫度突然升高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生熱激蛋白和大量的變性蛋白，當(dāng)細(xì)胞所處的環(huán)境溫度突然降低，或在干旱條件下，也會(huì)產(chǎn)生一些錯(cuò)誤折疊的蛋白，細(xì)胞首先會(huì)將變性蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白作為靶蛋白進(jìn)行泛素化標(biāo)記，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至蛋白酶體，并降解成短肽[7]。如果泛素鏈形成或者修飾過(guò)程中有任何的失調(diào)，均會(huì)導(dǎo)致生物體內(nèi)環(huán)境的紊亂，從而產(chǎn)生嚴(yán)重病害[8]。

鐵皮石斛是一種傳統(tǒng)的中國(guó)藥用植物，具有觀賞價(jià)值和廣泛的藥用價(jià)值[9]。本文結(jié)合PCR技術(shù)獲得了鐵皮石斛多聚泛素基因DoUb1并利用RT-qPCR技術(shù)，分析在溫度脅迫、干旱脅迫條件下對(duì)鐵皮石斛DoUb1基因表達(dá)的影響，為分析脅迫對(duì)鐵皮石斛發(fā)育影響的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛成熟種子接種于1/2MS培養(yǎng)基、25℃培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)獲得試管苗，選取具4片完全伸展葉片的試管植株備用。對(duì)備用植株分別進(jìn)行35℃高溫和5℃低溫以及50% PEG模擬干旱兩種類型脅迫處理，處理時(shí)間均為1～48 h。

1.2 鐵皮石斛總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成

使用Plant RNA Kit 試劑盒(Omega) 分別對(duì)備用植株的根、莖、葉組織以及脅迫處理和未脅迫處理的整苗植株提取總RNA。選擇D260 nm/D280 nm為1.8～2.0、凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果清晰的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按cDNA合成試劑盒(TAKARA)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 鐵皮石斛DoUb1 cDNA的獲取

根據(jù)鐵皮石斛原球莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的多聚泛素基因序列，利用Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)其3′RACE的5′端巢式PCR引物(Outer Primer：5′-ATTGATTGAGAGTGTGTATGTGGTTCC-3；Inner Primer:5′-TTGAGGCTCTGTTTCCTTGTA-3′)、3′端巢式PCR引物(Outer Primer：RP5′-GTCAACGATACGCTACCTAACG-3′，Inner Primer：RNP5′-TACGTACGGCATGACAGTG-3′)，5′RACE的5′端巢式PCR引物(Outer Primer：Oligo(T)11AP5′-AGGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTVN-3′，Inner Primer：T7 promoter 5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)，3′端巢式PCR引物(Outer Primer：5′-AGAACGACCTAAAGCGGG-3′；Inner Primer：5′-CAAGGAAACAGAGCCTCAACA-3′)。以cDNA為模板，使用EasyTaqDNA Polymerase (TRANSGEN BIOTECH)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μL (EasyTaqDNA Polymerase 0.15 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 19.35 μL、EasyTaqbuffer 2.5 μL)，擴(kuò)增條件(退火溫度以51℃～62℃梯度考察)為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，再經(jīng)過(guò)膠回收、T載體連接、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選并經(jīng)菌液PCR檢測(cè)無(wú)誤后，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證一致后，將測(cè)序數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接得到具全長(zhǎng)CDS的 cDNA序列。

1.4DoUb1的生物信息學(xué)分析

利用bioXM的ORF功能預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框[10]；利用NCBI(http：//www.ncbi.nim.nih.gov/)的BLAST在線分析工具選出與基因序列相近的其他物種序列，利用DNAMAN(LynnonBiosoft)對(duì)其進(jìn)行比對(duì)分析[11]；利用Protparam軟件對(duì)DoUb1氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)的分析；利用Bibsonomy軟件對(duì)多聚泛素進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[12]；使用在線工具Psort：http://psort.hgc.jp/對(duì)多聚泛素進(jìn)行亞細(xì)胞定位[13]。將DoUb1進(jìn)行Blastn比對(duì)，選取與其一致性在82%以上，不同植物的18條多聚泛素基因，使用MEGA6的鄰近法(NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[14]。

圖1 DoUb1 cDNA擴(kuò)增結(jié)果

A：3′RACE產(chǎn)物；B：5′RACE產(chǎn)物。M：Marker

1.5DoUb1在不同組織以及脅迫條件下的基因表達(dá)分析

通過(guò)Primer Primer5.0對(duì)已得到的克隆序列設(shè)計(jì)的定量引物為：上游引物F：5′-TCCATCTTGTTCTCCGCC9-3′，下游引物R：5′-TCCTTGTCCTGTATCTTAGCCT-3′。將提取的各類cDNA按10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增(SYBR green 5 μL、cDNA 0.5 μL、MilliQ ddH2O 2.9 μL、引物各0.8 μL)，反應(yīng)體系為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火10 s，72℃延伸25 s，45個(gè)循環(huán)；72℃延伸30 s。得出基因的相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1DoUb1 cDNA序列的獲得以及序列分析

RACE測(cè)序數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)拼接后得到1985 bp cDNA序列。圖1為3′RACE和5′RACE的PCR電泳圖，3′RACE測(cè)序得到1608 bp長(zhǎng)度的序列，5′RACE測(cè)序得到396 bp長(zhǎng)度的序列。拼接后的序列其5′端和3′端各有一段非編碼區(qū)，分別由402個(gè)和212個(gè)核苷酸組成，3′末端具有一個(gè)含18個(gè)A的poly(A)尾。利用BioXM軟件對(duì)其進(jìn)行序列分析，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1371 bp，位于403～1774 bp，編碼457個(gè)氨基酸蛋白殘基。經(jīng)NCBI Blastn比對(duì)，該基因與其他植物多聚泛素基因核苷酸序列相似性均在81%以上，故命名為DoPolyubiquitin1 (DoUb1)。將其編碼產(chǎn)物序列通過(guò)NCBI在線比對(duì)工具Blastp分析，保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示該產(chǎn)物是由6個(gè)泛素單位所組成，每個(gè)泛素單位由76個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，都含有保守的Ubq-E2、Ubq-UCH、Ubq-CUE作用位點(diǎn)(圖2)；序列比對(duì)結(jié)果顯示，該產(chǎn)物序列與其他物種的多聚泛素蛋白的“query cover”均在99%以上、“identical”在97%以上；選擇與DoUb1編碼產(chǎn)物比對(duì)結(jié)果中“Max. score”最高的5個(gè)物種的多聚泛素蛋白序列進(jìn)行同源分析，結(jié)果如圖3所示，此基因的結(jié)構(gòu)域非常保守，藍(lán)色部分表示比對(duì)結(jié)果完全相同，粉紅色部分和綠色部分表示比對(duì)結(jié)果部分同源，同源性極高，進(jìn)一步證明克隆得到的基因?yàn)槎嗑鄯核鼗颉?/p>

圖2 DoUb1保守域預(yù)測(cè)

圖3 不同物種氨基酸序列的多重比對(duì)

圖中各條序列的accesion number為：TuUb (Triticumurartu, gi|474093556)、ZmUb (Zeamays, gi|413926513)、OsUb (Oryzasativa, gi|530684260)、PsUb (Pucciniastriiformis, gi|909605082)、NtUb (Nicotianatomentosiformis, gi|697128365)

2.2DoUb1生物信息學(xué)分析結(jié)果

利用Protparam軟件對(duì)DoUb1氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明其分子質(zhì)量為51 179.7 ku，分子式為C2250H3747N637O704S6，總原子數(shù)為7344，理論等電點(diǎn)pI為7.76，帶負(fù)電荷的殘基數(shù)為66、正電荷殘基數(shù)為67。不穩(wěn)定系數(shù)為27.92，表明該蛋白狀態(tài)穩(wěn)定。疏水性分析結(jié)果表明，其疏水性最大值為1.133，親水峰最大值為-1.956，表明整個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出親水性(圖4)。利用Bibsonomy軟件對(duì)DoUb1進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋(alpha helix)占43.54%，延伸鏈(extended strand)占15.97%，無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)占40.48%。由此表明，α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈?zhǔn)堑鞍踪|(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分(圖5)。

圖4 DoUb1蛋白質(zhì)的疏水性分析

藍(lán)色：α螺旋；紅色：延伸鏈；紫色：無(wú)規(guī)則卷曲

使用在線工具Psort (http://psort.hgc.jp/)對(duì)DoUb1進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果顯示，其主要定位于細(xì)胞質(zhì)以及線粒體基質(zhì)，概率分別0.45和0.36，說(shuō)明該基因產(chǎn)物主要在細(xì)胞質(zhì)或線粒體基質(zhì)中發(fā)揮作用，可能主要參與高等植物細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，物質(zhì)運(yùn)輸?shù)取?/p>

圖6 不同物種多聚泛素基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖中各條序列的基因號(hào)所對(duì)應(yīng)的物種名稱為：gi|955717825(Setariaitalica)；gi|6013288(Oryzasativa)、gi|747099717(Sesamumindicum)、gi|1027097414(Prunusmume)、gi|702352129(Eucalyptusgrandis)、gi|670407636(Zeamays)、gi|743832386(Elaeisguineensis)、gi|971573297(Solanumtuberosum)、gi|734988342(Prunuspersica)、gi|694426526(Pyrus)、gi|802559699(Jatrophacurcas)、gi|1026010145(Capsicumannuum)、gi|657959169(Malus)、gi|697170903(Nicotiana)、gi|1021567367(Arachisipaensis)、gi|985444137(Citrussinensis)、gi|33323473(Musaacuminate)、gi|823131848(Gossypiumraimondii)

利用MEGA6構(gòu)建鐵皮石斛DoUb1與其他物種多聚泛素基因的進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖6所示。其中Ⅰ類為單子葉植物，Ⅱ類為雙子葉植物。DoUb1與水稻、玉米及谷子的多聚泛素基因聚為一簇，并與另2個(gè)植物多聚泛素基因(芭蕉、油棕)相鄰，而這6個(gè)物種都為單子葉植物；薔薇科雙子葉植物海棠、梨、桃和梅花的多聚泛素基因聚為一支；自花授粉雙子葉植物芝麻、煙草、辣椒和馬鈴薯的多聚泛素基因聚為一支。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果與植物分類學(xué)特征具有較高的一致性。

2.3DoUb1在不同組織以及脅迫條件下的基因表達(dá)分析

以鐵皮石斛Actin作為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR的分析，結(jié)果如圖7所示。DoUb1在鐵皮石斛幼苗根和葉中表達(dá)量較高，而在莖中的表達(dá)量較少，約為根中表達(dá)量的一半(圖7-A)。干旱初期基因表達(dá)量下降，到脅迫處理6 h，表達(dá)量降到最低，然后緩慢回升，表達(dá)量升高，說(shuō)明泛素基因與鐵皮石斛抗逆過(guò)程有關(guān)。由此可以推測(cè)，當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生時(shí)，產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，泛素可活化并標(biāo)記它們以供降解(圖7-B)。高溫脅迫使得鐵皮石斛泛素基因表達(dá)量逐漸降低，6 h表達(dá)量約為正常表達(dá)量的20%，達(dá)到最低值，而后又逐漸升高；而在低溫脅迫下，DoUb1在脅迫初期表達(dá)量急劇下降，脅迫1 h時(shí)約為正常表達(dá)量的4%，在6 h和48 h有一個(gè)表達(dá)量的升高，但低溫脅迫相比高溫脅迫，DoUb1表達(dá)量更低。由此說(shuō)明泛素基因在低溫脅迫下的響應(yīng)更為敏感(圖7-C)。

圖7 DoUb1在不同組織以及脅迫下的表達(dá)分析

A：不同組織DoUb1的表達(dá)水平；B：干旱脅迫下DoUb1的表達(dá)水平；C：溫度脅迫下DoUb1的表達(dá)水平

3 討論

植物在自然環(huán)境中通常會(huì)遭遇多種逆境脅迫的侵襲，即綜合逆境脅迫[15]。植物對(duì)于綜合脅迫的響應(yīng)不僅僅是對(duì)各種逆境反應(yīng)的簡(jiǎn)單加和，還有某些特殊機(jī)制[16]。在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，溫度脅迫和干旱脅迫是一種比較普遍的逆境，而且會(huì)對(duì)植物造成比較大的傷害[17]。泛素可以提高植物對(duì)脅迫抗性的作用[18]。泛素蛋白酶體系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)會(huì)參與眾多的調(diào)節(jié)過(guò)程，不僅在植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起作用，而且在溫度、干旱以及疾病等生物和非生物脅迫中也發(fā)揮了重要作用[19]。在鐵皮石斛中，通過(guò)對(duì)DoUb1的表達(dá)進(jìn)行分析，不同的脅迫條件下，泛素所對(duì)應(yīng)的機(jī)制不同，其表達(dá)量也有所變化。Ubiquitin能夠共價(jià)結(jié)合到底物蛋白上，對(duì)底物蛋白進(jìn)行翻譯后的修飾[20]。通常情況下，逆境脅迫下生物細(xì)胞內(nèi)無(wú)功能蛋白質(zhì)或錯(cuò)誤蛋白質(zhì)的積累增多，而及時(shí)清除這些無(wú)功能或錯(cuò)誤蛋白質(zhì)成為生物適應(yīng)逆境的重要方式[21]。在鐵皮石斛中，泛素基因的表達(dá)與植物抗逆性有關(guān)，在干旱以及溫度脅迫下，表達(dá)都會(huì)發(fā)生上調(diào)或下調(diào)的變化。泛素蛋白酶體系統(tǒng)，不僅是植物中蛋白高效專一降解最精致的調(diào)控機(jī)制之一，也是整個(gè)真核生物蛋白高效專一降解最重要的調(diào)控機(jī)制之一[22]。

非生物脅迫下，首先在泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme E1)的催化作用下獲得活性，再經(jīng)過(guò)酶以及一系列中間底物的催化過(guò)程，將其連接到靶蛋白上，最終完成錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解過(guò)程[23]。許多刺激和細(xì)胞內(nèi)上游信號(hào)事件可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)泛素化，泛素化在生物體內(nèi)復(fù)雜得多，主要是泛素與其他蛋白質(zhì)相互作用有較大的表面積，泛素能形成不同鏈的事實(shí)進(jìn)一步增大了其復(fù)雜性[24]。DoUb1為6個(gè)泛素分子形成的多聚泛素，其空間構(gòu)象與單泛素分子明顯不同，造成了其與底物蛋白分子不同的結(jié)合方式。泛素為難于標(biāo)記的靶點(diǎn)提供了一個(gè)切入點(diǎn)[25]。

多聚泛素基因能在分生組織、微管組織和衰老組織中被熱激和創(chuàng)傷等誘導(dǎo)脅迫下表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物主要參與泛素蛋白酶體途徑中的蛋白質(zhì)水解過(guò)程[26]。脅迫條件下，多聚泛素被激活以提供自由泛素，并且細(xì)胞優(yōu)先降解蛋白質(zhì)[27]。DoUb1在非生物脅迫下，表達(dá)量降低，可能是脅迫條件下對(duì)泛素基因的表達(dá)水平產(chǎn)生了一定影響，脅迫后期表達(dá)量慢慢回升，說(shuō)明其對(duì)脅迫反應(yīng)的調(diào)整性及適應(yīng)性，在蛋白質(zhì)降解過(guò)程中發(fā)揮積極作用。

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Cloning and expression analysis of aPolyubiquitingene (DoUb1) in theDendrobiumofficinaleKimuraetMigo

PEI Wei， LIANG Yi， FAN Jing， AN Hong-qiang， WANG Wan-jun

(College of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China)

Polyubiquitin1 (DoUb1) inDendrobiumofficinaleKimuraetMigo was achieved by RACE (rapid amplification of cDNA ends).DoUb1 contained 1985 bp nucleotides with a putative open reading frame encoding 457 amino acid residues. The predicted molecular weight and theoretical isoelectric point of pI were 51 179.7 ku and 7.76 respectively. Subcellular localization analysis showed that gene product played a major role in the cytoplasm or the mitochondrial matrix. Phylogenetic analysis showed that theDoUb1 has the closest relativon with monocotyledonous plants such asZeamays,SetariaitalicaandOryzasativa. Results of real-time quantitative PCR (RT-qPCR) showed that the expression ofDoUb1 was higher in roots and leaves than in stems;DoUb1 was down-regulated during drought stress and temperature stress, the expression level was reduced in the early stage of stresses and then slowly increased. For drought stress, and the expression level was at the lowest after PEG treatment for 6 h; for temperature stress, it had similar responsive characteristics to drought stress, but in the low temperature stress, the expression ofDoUb1 was lower than in high temperature stress. These results showed that the gene was more sensitive to low temperature stress.

RACE；DendrobiumofficinaleKimuraetMigo；Polyubiquitin； RT-qPCR

2016-06-15；

2016-07-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371232)

裴 薇，碩士研究生，主要從事植物發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail: 1141217319@qq.com

王萬(wàn)軍，教授，主要從事植物發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail: wanjunwang@home.swjtu.edu.cn

Q785;Q786

A

2095-1736(2017)03-0006-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.006