李鑫玲，龔明貴，李欣，張慧蕓，張仲欣

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南洛陽(yáng)471023）

超聲波輔助提取荷花粉總黃酮工藝優(yōu)化研究

李鑫玲，龔明貴，李欣，張慧蕓，張仲欣

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南洛陽(yáng)471023）

采用超聲波輔助提取荷花粉中的總黃酮，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面方法優(yōu)化總黃酮的最佳提取工藝，研究液固比、乙醇濃度、超聲處理溫度和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)超聲波功率250 W條件下，超聲波輔助提取荷花粉總黃酮最佳工藝參數(shù)為液固比18.5（mL/g），乙醇濃度82%，提取溫度74℃，提取時(shí)間53 min，總黃酮的提取率可達(dá)1.658 2%。

荷花粉；響應(yīng)面法；超聲波；黃酮

花粉作為植物的精華，含有蛋白質(zhì)、多種維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、多酚及黃酮和多糖等200多種人體必需的營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)[1]，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最全面的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，被譽(yù)為“完全營(yíng)養(yǎng)食品”、濃縮的營(yíng)養(yǎng)庫(kù)”[2]。作為一種新型的保健食品，它能降血壓、防止血管硬化，同時(shí)還具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是目前食用醫(yī)療保健研究的一大熱點(diǎn)[3]。黃酮化合物是次生代謝產(chǎn)物，是花粉中的重要營(yíng)養(yǎng)成分之一，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗疲勞及抗菌活性，同時(shí)還具有增強(qiáng)免疫力、清除體內(nèi)自由基等多重功效[4]。

荷花是睡蓮科植物蓮的蓓蕾，在我國(guó)分布廣泛，栽培面積大，品種繁多。荷花粉作為一種新興花粉保健品，黃酮類含量高、種類多，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有抗氧化、降血脂、護(hù)血管、預(yù)防癌癥和潤(rùn)膚美容的功效，備受廣大消費(fèi)者的青睞[5]。胡衛(wèi)成[6]等的研究結(jié)果表明，利用超聲波輔助提取可以強(qiáng)化提取效果，縮短提取時(shí)間，提高原料的利用率。目前，對(duì)于荷花粉黃酮的超聲輔助提取及條件優(yōu)化缺乏系統(tǒng)研究。

本試驗(yàn)以荷花粉為原料，利用響應(yīng)面法超聲波輔助對(duì)荷花粉中總黃酮的提取條件研究，并選擇出最優(yōu)的提取條件，這將為擴(kuò)大荷花粉的開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荷花粉：河南普瑞蜂業(yè)有限公司，烘干至恒重，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)100目分樣篩，即得荷花粉樣品；蘆?。–AS號(hào)：153-18-4）：上海源葉生物科技有限公司；硝酸鋁、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉和亞硝酸鈉均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 荷花粉總黃酮類化合物的含量測(cè)定

采用NaNO2-A1（NO3）3-NaOH顯色體系吸光光度法測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定樣品總黃酮的含量[7]。以蘆丁濃度（C：mg/mL）對(duì)吸光度（A）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A=0.013 8 C-0.026 5（R2=0.999 4）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、液固比對(duì)黃酮的提取率有顯著影響[8]，因此選取這5個(gè)因素作為考察指標(biāo)，分析不同提取條件對(duì)荷花粉總黃酮提取效果的影響。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 單因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Single factor level design

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在初步試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定適用于試驗(yàn)的因素范圍，然后進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。采用通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)[9]，用于評(píng)價(jià)液固比（X1）、乙醇濃度（X2）、提取溫度（X3）和提取時(shí)間（X4）4個(gè)獨(dú)立變量對(duì)荷花粉中總黃酮提取率（Y）的影響。因素水平編碼表見表2。

表2 因素水平編碼表Table 2 Factor level design

如表2所示，獨(dú)立變量編碼在5個(gè)水平（-2、-1、0、1、2），完整的設(shè)計(jì)包括 31個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，中心試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)7次（所有變量編碼為零）。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法中Central Composite原理進(jìn)行回歸試驗(yàn)，通過(guò)DPS（V3.01）和Design Expert 8.05統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以得到各變量和提取率之間的回歸方程。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，構(gòu)建擬合模型（見公式1），模型的顯著性通過(guò)回歸分析和方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，最終確定超聲法提取荷花粉總黃酮的最佳提取條件。

式中：Y 為提取率，%；β0為常系數(shù)；βi為線性系數(shù)；βii為線性二次系數(shù)；βij為交互系數(shù)；Xi和 Xj均為各獨(dú)立變量的水平編碼。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液固比對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響

參考相關(guān)文獻(xiàn)，固定超聲功率250 W[10-11]、乙醇濃度40%、提取溫度40℃、提取時(shí)間10 min，研究不同液固比 9、12、15、18、21、24 mL/g 對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響。液固比對(duì)荷花粉黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 液固比對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響Fig.1 Influence of solvent to solid ratio on the extraction yield of flavonoids from lotus powder

如圖1所示，當(dāng)液固比從9 mL/g增至18 mL/g時(shí)，總黃酮提取率顯著增加并達(dá)到最高點(diǎn)1.42%，隨后逐漸降低。因此選擇 16、17、18、19、20（mL/g）5 個(gè)水平用于響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響

固定超聲功率250 W、液固比18 mL/g、提取溫度40℃、提取時(shí)間10 min。研究不同乙醇濃度40%、50%、60%、70%、80%、90%對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響。乙醇濃度對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響Fig.2 Influence of ethanol concentration on the extraction yield of flavonoids from lotus powder

從圖2可以看出，黃酮提取率隨著乙醇濃度逐漸增大，當(dāng)濃度增至80%時(shí)達(dá)到最高，繼續(xù)增大，提取率降低。另外，隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大，溶劑中的脂溶性物質(zhì)也不斷增多，這將給進(jìn)一步提純帶來(lái)麻煩?？紤]到成本和提取率，較適乙醇濃度為80%。

2.1.3 超聲處理溫度對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響

固定超聲功率250 W、液固比18 mL/g、乙醇濃度80%、提取時(shí)間10 min，研究不同超聲處理溫度40、50、60、70、80、90℃對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響。超聲處理溫度對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 超生處理溫度對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響Fig.3 Influence of ultrasonic treatment temperature on the extraction yield of flavonoids from lotus powder

如圖3所示，隨著溫度的增加，總黃酮提取率逐漸上升，然后在70℃時(shí)達(dá)到峰值，繼續(xù)增大提取溫度，提取率則不斷下降。這種現(xiàn)象可以解釋為，隨著溫度的升高，溶劑的黏性下降、分子運(yùn)動(dòng)加劇，有利于生物活性物質(zhì)從植物細(xì)胞釋放。然而，更高的溫度促進(jìn)了一些熱敏物質(zhì)的降解[12]。因此選擇 60、65、70、75、80 ℃ 5個(gè)水平用于響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響

固定超聲功率250 W、液固比18 mL/g、乙醇濃度80%、提取溫度 70℃，研究不同提取時(shí)間 10、20、30、40、50、60 min對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響。提取時(shí)間對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)荷花粉總黃酮提取率的影響Fig.4 Influence of extraction time on the extraction yield of flavonoids from lotus powder

從圖4可以看出，隨著提取時(shí)間從10 min增至50 min，總黃酮提取率顯著增大，當(dāng)增至50 min時(shí)達(dá)到一個(gè)峰值，隨后逐漸降低。充足的浸提時(shí)間可以提高黃酮化合物的溶出率，但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又會(huì)造成活性成分的損失[13]。因此選擇 40、45、50、55、60 min 5 個(gè)水平用于響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 模型擬合與統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在超聲功率250 W條件下，采用DPS v7.05數(shù)據(jù)處理軟件，根據(jù)表2設(shè)定的因素和水平，實(shí)施31次試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Second-order rotation combination experimental design with experimental results

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，構(gòu)建擬合模型，得到黃酮的提取得率（Y）為響應(yīng)值，液固比（X1）、乙醇濃度（X2）、提取溫度（X3）、和提取時(shí)間（X4）為自變量的回歸方程為：Y=-77.754 23+1.489 29X1+0.640 60X2+0.607 33X3+0.645 48X4+0.005875X1X2+0.006125X1X3-0.001375X1X4-0.001175X2X3-0.002375X2X4+0.000275X3X4-0.063348X12-0.003 283 93X22-0.004 333 93X32-0.004 233 93X42

方差分析用于檢測(cè)模型的顯著性和回歸方程的擬合程度，分析結(jié)果見表4。

表4 試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model equation

P值用于檢測(cè)各因素對(duì)Y值的影響是否顯著，同時(shí)也用于檢測(cè)各因素之間的交互作用是否顯著。P值越小模型越顯著[14]，由表4可知，P值小于0.000 1，說(shuō)明該模型對(duì)本試驗(yàn)是合適的。決定系數(shù)（R2=0.983 8）接近1，說(shuō)明該模型與實(shí)際數(shù)據(jù)相關(guān)性較好；調(diào)整后的R2為0.969 6，說(shuō)明回歸方程中對(duì)荷花粉總黃酮得率的影響有96.96%可以通過(guò)該模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，僅有3%的變化因素不能通過(guò)該模型進(jìn)行解釋。

失擬是指回歸方程中未包含的變化因素，由方差分析結(jié)果可得，失擬項(xiàng)（F=1.300 849，P=0.388 7＞0.05）不顯著，進(jìn)一步證明回歸方程的可行性[15]。

由表4可知，回歸方程顯著（P＜0.01），失擬不顯著（P＞0.05），說(shuō)明該方程能較好模擬各因素對(duì)荷花粉總黃酮提取效果的影響提取的各個(gè)因素X1（液固比）X2（乙醇濃度）X3（提取溫度）和X4（提取時(shí)間）對(duì)提取率的影響都達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）因素對(duì)提取率的影響不存在線性關(guān)系，它們中的一些交互項(xiàng)對(duì)提取率的影響是顯著的。研究結(jié)果還表明，影響荷花粉中總黃酮提取率最重要的參數(shù)是X3（提取溫度）和X4（提取時(shí)間），其次是X2（乙醇濃度）和X1（液固比），其中X3（提取溫度）＞X4（提取時(shí)間）＞X2（乙醇濃度）＞X1（液固比）。

2.2.2 響應(yīng)面分析

選取2個(gè)交互的因素對(duì)荷花粉總黃酮提取率進(jìn)行響應(yīng)面分析，其它兩個(gè)因素被保持在0水平。液固比和提取溫度交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面見圖5，乙醇濃度和提取時(shí)間交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面見圖6。

由圖5可知，當(dāng)其它兩個(gè)因素在零水平保持不變，液固比和乙醇濃度的交互作用顯著；由圖7可以看出，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨著乙醇濃度的增加提取率顯著升高，另外當(dāng)乙醇濃度不變時(shí)，提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。

響應(yīng)面分析結(jié)果顯示，荷花粉中總黃酮提取率顯著增加取決于乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度，而固液比對(duì)提取率沒有顯著的影響，這與方差分析結(jié)果相一致。

2.2.3 優(yōu)化與驗(yàn)證

通過(guò)使用Design Expert 8.05統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，獲得荷花粉總黃酮提取率的最佳工藝參數(shù)為液固比 18.55∶1（mL/g），乙醇濃度 81.90%，提取溫度73.74℃，提取時(shí)間52.64 min，提取率預(yù)測(cè)值為1.668 91%；考慮到試驗(yàn)的可操作性，將最佳工藝參數(shù)修正為液固比18.5∶1（mL/g），乙醇濃度 82%，提取溫度74℃，提取時(shí)間53 min。采用最佳工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到總黃酮的提取率的均值為（1.658 2±0.007）%，與預(yù)測(cè)值基本相符。

圖5 液固比和提取溫度交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface plots for the effect of liquid/solid ratio and extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids

圖6 乙醇濃度和提取時(shí)間交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface plots for the effect of ethanol concentration and extraction time on the extraction yield of total flavonoids

3 結(jié)論

通過(guò)Central Composite設(shè)計(jì)試驗(yàn)得出回歸模型決定系數(shù)（R2=0.983 8）接近1，說(shuō)明該模型與實(shí)際數(shù)據(jù)相關(guān)性較好，可以通過(guò)該模型進(jìn)行預(yù)測(cè)荷花粉黃酮的提取率；影響荷花粉中總黃酮提取率最重要的參數(shù)是X3（提取溫度）和X4（提取時(shí)間）；超聲輔助提取荷花粉總黃酮最佳工藝參數(shù)為液固比18.5（mL/g），乙醇濃度82%，超聲處理溫度74℃，提取時(shí)間53 min，總黃酮的提取率可達(dá)1.658 2%，與預(yù)測(cè)值基本相符。

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Process Optimization Study on Lotus Powder Flavonoids Extraction by Ultrasonic Assisted

LI Xin-ling，GONG Ming-gui，LI Xin，ZHANG Hui-yun，ZHANG Zhong-xin
（Food Materials Engineering Technology Research Center of Henan Province，College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，Henan，China）

This study aimed to optimize the ultrasonic treatment parameters for total flavonoids extracted from lotus power by single factor tests and response surface methodology.Effects of liquid-solid ratios，ethanol concentration，ultrasonic treatment temperature and time on extraction yield of total flavonoids were studied.Results showed that the optimum ultrasonic assisted extraction parameters were liquid-solid ratios of 18.5（mL/g），ethanol concentration of 82%，ultrasonic treatment temperature of 74℃，extraction time of 53 min under ultrasonic power 250 W.Extraction yield of total flavonoids achieved 1.658 2%under the optimum parameters.

lotus powder；response surface methodology；ultrasonic wave；flavonoid

2016-10-08

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.015

李鑫玲（1982—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。