張斌，劉博華，溫祿云

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物功能因子提取工藝研究

張斌，劉博華，溫祿云

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物為成熟子實(shí)體采摘后的培養(yǎng)基殘基、菌絲體殘?bào)w，主要活性成分與子實(shí)體相近，為蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素、腺苷類及蛋白質(zhì)等。采用雙頻超聲波輔助提取技術(shù)、酶工程技術(shù)，對(duì)北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物中的蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、多肽等功能因子進(jìn)行提取。干燥提取物中多糖含量25.4%、蟲(chóng)草素含量0.6%、蟲(chóng)草酸含量5.2%、多肽含量23.7%。

北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物；雙頻超聲波；酶工程

北冬蟲(chóng)夏草又名北冬蟲(chóng)夏草、北蟲(chóng)草、蟲(chóng)草花，拉丁學(xué)名為Cordycepsmilitaris，野生北冬蟲(chóng)夏草是一種寄生于鱗翅目和鞘翅目昆蟲(chóng)蛹提上的大型真菌，與傳統(tǒng)中藥材冬蟲(chóng)夏草（Cordycepssinensis）同屬于子囊菌亞門，麥角菌目，蟲(chóng)草菌屬[1]。北冬蟲(chóng)草天然資源的世界性分布數(shù)量很少，由子座（草的部分）、核菌（蟲(chóng)的尸體部分）組成，多以蛾蛹或蠶蛹為寄主[2]。既是一種珍稀的食用菌，又是一種珍貴的中藥材。2009年，經(jīng)中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)，北冬蟲(chóng)夏草可以作為新資源食品，可直接食用，也可作為食品原料，在酒類、罐頭、調(diào)味品、飲料中應(yīng)用[3]，這為北冬蟲(chóng)夏草資源的開(kāi)發(fā)和利用起到了十分積極的作用。

1986年吉林省蠶業(yè)通過(guò)在家蠶和昨蠶上培養(yǎng)北蟲(chóng)草成功獲得子實(shí)體[4]。90年代后，以大米培養(yǎng)基為主的固態(tài)培養(yǎng)基栽培法逐漸普及，這也是目前北冬蟲(chóng)夏草最主要的人工培養(yǎng)方式。收獲北冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體后，培養(yǎng)基殘基通常被作為廢棄物處理，據(jù)統(tǒng)計(jì)可知栽培時(shí)北蟲(chóng)草子實(shí)體干重與蟲(chóng)草基干重之比為1∶3或1∶4，廢棄培養(yǎng)基勢(shì)必造成資源的極大浪費(fèi)，堆積后發(fā)酸發(fā)臭對(duì)環(huán)境也產(chǎn)生一定的影響。隨著北蟲(chóng)草栽培產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，對(duì)北蟲(chóng)草固體培養(yǎng)殘基如何進(jìn)行產(chǎn)品加工開(kāi)發(fā)、對(duì)活性成分的提取利用己成為迫切需要解決的問(wèn)題。培養(yǎng)基殘基中仍含有部分蟲(chóng)草子實(shí)體和大量菌絲體，目前己有利用北蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基釀制功能型醋[5]、功能型保健醬油[6]等報(bào)道，但總體來(lái)說(shuō)，剩余基質(zhì)的利用率仍然較低。

經(jīng)檢測(cè)，北蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基中的營(yíng)養(yǎng)成分與功能因子種類與子實(shí)體一致，均含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖等[7]（見(jiàn)表1），雖含量較低，但其數(shù)量巨大，價(jià)格低廉，來(lái)源豐富，因此從剩余基質(zhì)中提取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和功能因子，具有一定的研究?jī)r(jià)值。

表1 北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物中主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量對(duì)比Table 1 The content of main nutrients of Cordycepsmilitaris by-products

1 材料與方法

1.1 材料

人工培養(yǎng)北冬蟲(chóng)夏草采收后的培養(yǎng)基殘基：天津東方中濱農(nóng)業(yè)科技有限公司；中性蛋白酶（2×106U/g）、無(wú)水乙醇（均為食品級(jí)）：北方霞光食品添加劑有限公司；氫氧化鈉、硫酸鋁、苯酚、濃硫酸、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、L-鼠李糖、乙腈（均為分析純）：天津贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠；蟲(chóng)草素標(biāo)品（色譜純）：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 主要儀器設(shè)備

酶解罐、雙頻超聲波發(fā)生器：天津市食品研究所有限公司自制；DZ-1AI電熱烘干箱、全波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)、凱氏定氮儀：天津市泰斯特儀器有限公司；YLS-16A快速水分測(cè)定儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司；LC-100高效液相色譜儀：日本島津公司；DGT-ZF-3雙效蒸發(fā)器：天津德固特科技有限公司；離心式噴霧干燥器：常州力馬干燥設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

培養(yǎng)基殘基→分選→破碎→雙頻超聲波輔助提取、酶解→滅酶→過(guò)濾→濃縮→噴霧干燥

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 分選

去除在運(yùn)輸及貯藏過(guò)程中發(fā)生霉變或被污染的培養(yǎng)基。

1.3.2.2 破碎

加入培養(yǎng)基干基重量5倍～10倍的水，使用高剪切破碎機(jī)進(jìn)行打漿破碎。破碎后的物料無(wú)明顯顆粒（≥0.2 cm3）。

1.3.2.3 雙頻超聲波輔助提取及酶解

將破碎的料漿置于加裝25 kHz和40 kHz雙頻超聲波裝置的提取罐，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5，升溫至40℃～60℃，加入一定量中性蛋白酶，開(kāi)啟攪拌，選擇超聲波功率200 W～400 W，處理20 min～60 min后，關(guān)閉超聲，繼續(xù)酶解2 h～5 h。

1.3.2.4 滅酶

將物料升溫至85℃，保持20 min，滅酶、殺菌。

1.3.2.5 過(guò)濾

酶解后的料液使用40目濾布進(jìn)行粗濾，濾液使用80目板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾。

1.3.2.6 濃縮

濾液使用雙效蒸發(fā)器濃縮至可溶性固形物≥25%。

1.3.2.7 噴霧干燥

使用離心式噴霧干燥器進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度150℃，出風(fēng)溫度80℃，噴霧干燥后的粉末水分含量≤5%。取樣進(jìn)行多糖、粗蛋白含量、多肽含量（5000Da～10 000 Da）、游離氨基酸含量、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素的測(cè)定。

1.3.3 超聲波輔助工藝提取正交分析

根據(jù)丘泰球、曾榮華等[8-10]的研究結(jié)果25 kHz與40 kHz的雙頻超聲波對(duì)于植物中功效成分的提取效果最佳，因此本研究采用超聲頻率為25 kHz與40 kHz雙頻超聲波進(jìn)行輔助提取，以料液比1∶8（g/mL），超聲功率300 W、處理40 min、溫度55℃，pH7.0為基礎(chǔ)條件，進(jìn)行料液比=1∶5、1 ∶6、1 ∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g/mL），超聲波功率 200、250、300、350、400 W，處理 20、30、40、50、60、70、80、90 min，處理溫度 45、50、55、60、65 ℃等單因素的水平試驗(yàn)。處理后直接取料液，6 000 r/min離心10 min后，取上清液，進(jìn)行多糖檢測(cè)，通過(guò)與預(yù)先檢測(cè)的未提取前物料的多糖含量計(jì)算提取率，確定各因素最佳條件為料液比、超聲波功率、處理溫度、處理時(shí)間在各自因素水平上的最佳條件為：1∶8（g/mL）、300 W、50 min、60 ℃。

據(jù)此設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，因素包括：料液比、超聲波功率、處理溫度、處理時(shí)間，因素水平表見(jiàn)表2。

表2 雙頻超聲波輔助提取優(yōu)化條件試驗(yàn)因素和水平Table 2 Dual-frequency ultrasound assisted extraction optimization condition test factors and levels

1.3.4 酶解工藝正交分析

采用的中性蛋白酶活力為2×105U/g，建議使用量為0.2%～0.8%，pH值為6～8，酶解溫度45℃～65℃。在最佳雙頻超聲波輔助提取條件下，以中性蛋白酶0.5%、（以物料干基重計(jì)），pH7.0，酶解溫度50℃、酶解4 h為基礎(chǔ)條件，進(jìn)行中性蛋白酶添加量0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%，pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，酶解時(shí)間 2、3、4、5、6、7 h，酶解溫度 40、45、50、55、60、65℃單因素的水平試驗(yàn)。處理后直接取料液，6 000 r/min離心10 min后，取上清液，進(jìn)行總氮及氨基酸態(tài)氮的檢測(cè)，通過(guò)計(jì)算水解度，確定各因素最佳條件為中性蛋白酶添加量、pH值、值酶解溫度、酶解時(shí)間為在各自因素水平上的最佳條件為：0.5%、7.0、55℃、4 h。

據(jù)此設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，因素包括：中性蛋白酶添加量、pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度，因素水平表見(jiàn)表3。

表3 酶解工藝條件試驗(yàn)因素和水平Table 3 Enzyme hydrolysis condition test factors and levels

2 結(jié)果與討論

2.1北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物超聲波輔助提取工藝條件研究

北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物超聲波輔助提取正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

由正交試驗(yàn)可知，所選各因素在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物功能因子的提取效果有不同的影響，各因素對(duì)提取率影響的順序?yàn)镈＞B＞C＞A，最佳的提取條件為A2B2C2D3。即料液比為1∶8（g/mL），超聲波功率300 W，處理時(shí)間50 min，處理溫度65℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，提取率為91.7%，多糖提取效果優(yōu)于正交試驗(yàn)結(jié)果。

表4 北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物超聲波輔助提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 C.militaris by-product of ultrasonic assisted extraction of orthogonal test results

2.2 酶解工藝條件研究

酶解工藝條件研究正交試驗(yàn)見(jiàn)表5。

表5 北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物超聲波酶解正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of orthogonal test of C.militaris by-product ultrasonic enzyme

由表5可知，所選各因素在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的酶解效果有不同的影響，各因素對(duì)水解度影響的順序?yàn)锳＞B＞C＞D，最佳的酶解條件為A3B3C3D2，即中性蛋白酶添加量0.6%、pH7.5、酶解時(shí)間為5 h、酶解溫度為55℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，水解度為35.7%，優(yōu)于正交試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物提取物營(yíng)養(yǎng)成分及功能因子分析

取3個(gè)批次噴霧干燥后的提取物粉末進(jìn)行多糖、粗蛋白、多肽、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素含量的測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物提取物功能因子含量Table 6 C.militaris by-product Extract function factor content%

由表6可知，北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物提取物多糖含量少于北冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體，粗蛋白含量、多肽含量、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素均明顯高于干燥子實(shí)體。經(jīng)酶解處理后的副產(chǎn)物提取物多肽含量是未經(jīng)酶解處理子實(shí)體的近10倍，蟲(chóng)草酸含量超過(guò)子實(shí)體含量近50%，蟲(chóng)草素含量超過(guò)子實(shí)體含量1倍。通過(guò)將北冬蟲(chóng)夏草培養(yǎng)基殘基進(jìn)行提取與酶解，不僅將廢物綜合利用，同時(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大幅提升。

3 結(jié)論

通過(guò)研究，北冬蟲(chóng)夏草副產(chǎn)物功能因子提取的最佳工藝為將采收后的北冬蟲(chóng)夏草培養(yǎng)基殘基按干物質(zhì)重量加入8倍凈化水，使用高剪切破碎機(jī)破碎，使用10目篩網(wǎng)過(guò)濾后加入至安裝25 kHz和40 kHz雙頻超聲波發(fā)生裝置的提取罐內(nèi)進(jìn)行提取，首先開(kāi)啟攪拌，調(diào)節(jié)pH值至7.5，之后將物料升溫至65℃，加入干基重0.6%的中性蛋白酶，開(kāi)啟超聲波發(fā)生裝置進(jìn)行輔助提取。超聲波功率300 W，開(kāi)啟50 min，處理溫度65℃。超聲波輔助提取結(jié)束后，將溫度降至55℃繼續(xù)進(jìn)行酶解，酶解310 min后，將料液升溫至85℃并保溫20 min滅酶、殺菌。經(jīng)檢測(cè)多糖提取率為91.7%，水解度為35.7%，干燥提取物中多糖含量為22.0%、粗蛋白含量45.6%、多肽含量23.7%、蟲(chóng)草酸含量5.2%、蟲(chóng)草素含量0.6%。

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The Research of Cordycepsmilitaris By-products Function Factor Extraction Process

ZHANG Bin，LIU Bo-hua，WEN Lu-yun
（Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

Cordycepsmilitaris by-products is medium after picked fruit bodyand mycelium.Main active ingredient is similar to fruiting body including Cordycepsmilitaris polysaccharide，cordyceps acid，cordycepin，adenosine，protein，etc.The research adopts the dual-frequency ultrasound assisted extraction technology，enzyme engineering technology，extract of Cordycepsmilitaris polysaccharide，cordycepin，cordyceps acid，polypeptide，from C.militaris by-products.In the dry extract，polysaccharide content was 25.4%，cordycepin content was 0.6%，cordyceps acid content was 5.2%，polypeptide content was 23.7%.

Cordycepsmilitaris by-products；dual-frequency ultrasound；enzyme engineering technology

2017-03-31

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.013

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（16YFFCZ00170）

張斌（1984—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：保健、功能食品加工技術(shù)。