王敏，李廣益，邢燕，李婷婷，王勤

（淄博市疾病預(yù)防控制中心，山東淄博255026）

玉米制品中黃曲霉毒素的柱前和柱后衍生方法對比

王敏，李廣益，邢燕*，李婷婷，王勤

（淄博市疾病預(yù)防控制中心，山東淄博255026）

玉米制品中黃曲霉毒素測定的2種衍生化方法（柱前衍生和柱后衍生）進(jìn)行比較。樣品經(jīng)過MycrosepTM226多功能凈化柱凈化，采用Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）色譜柱進(jìn)行分離，熒光檢測器檢測。柱前衍生法：樣品提取液經(jīng)凈化后，采用三氟乙酸進(jìn)行衍生后測定。柱后碘衍生法：樣品提取液經(jīng)凈化后，經(jīng)高效液相色譜分離、柱后碘衍生，熒光檢測器檢測。結(jié)果表明：柱前衍生法，黃曲霉毒素G1、B1檢出限為0.05 μg/kg，黃曲霉毒素G2、B2檢出限為 0.015μg/kg，r＞0.999 1，回收率在 75.4%～84.2%之間；柱后碘衍生法，黃曲霉毒素 G1、B1檢出限為 0.08 μg/kg，黃曲霉毒素G2、B2檢出限為0.015 μg/kg，r＞0.999 2，回收率在75.2%～85.7%之間。2種衍生方法在線性范圍、精密度、回收率等方面較相似，表明柱前衍生法和柱后碘衍生法均適用于玉米制品中的黃曲霉毒素檢測。

黃曲霉毒素；柱前衍生；柱后衍生；對比

黃曲霉毒素是黃曲霉菌和寄生曲霉在一定溫度、濕度條件下產(chǎn)生的真菌毒素，世界衛(wèi)生組織的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)于1993年將黃曲霉毒素劃定為Ⅰ類致癌物。常見的黃曲霉毒素有 B1、B2、G1、G2，其中 B1的毒性和量均為最大。我國GB 2761-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》中規(guī)定玉米及其制品中的黃曲霉毒素B1限量標(biāo)準(zhǔn)為20 μg/kg，但標(biāo)準(zhǔn)尚未列出食品中黃曲霉毒素 B2、G1、G2的限量規(guī)定[1]。因此，有必要建立穩(wěn)定可靠、靈敏度高的方法，為建立食品中黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

我國食品中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的檢測方法主要有薄層色譜法[2]和高效液相色譜法（HPLC）[3-4]以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-6]。其中，HPLC法因?yàn)槠浞椒?zhǔn)確、靈敏，被廣泛采用。HPLC法檢測黃曲霉毒素，需衍生提高其熒光強(qiáng)度。目前，常用的衍生化方法有柱前衍生法、柱后鹵衍生法、柱后紫外光衍生法以及柱后電化學(xué)衍生法等方法。本研究選取玉米制品作為研究樣品，樣品經(jīng)過前處理后，分別用2種衍生化方法（柱前衍生法和柱后碘衍生法）進(jìn)行衍生，熒光檢測器檢測，并對2種衍生化方法進(jìn)行了驗(yàn)證和比較。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

e2695型高效液相色譜儀配熒光檢測器、Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）色譜柱：Waters公司；乙腈（色譜純）：迪馬；多功能凈化柱：MycrosepTM226柱：Romer Labs公司；混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液為B1：1.0 μg/mL，B2：0.3 μg/mL，G1：1.0 μg/mL，G2：0.3 μg/mL，貯存溫度：-10℃，定值單位：美國O2Si smart solutions，有效期至2017年3月?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度為B1：0.10μg/mL，B2：0.03μg/mL，G1：0.10μg/mL，G2：0.03μg/mL。

1.2 色譜分離條件及衍生條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；柱溫：40 ℃；激發(fā)波長：360 nm，發(fā)射波長：440 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.2.1 柱前衍生法

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution conditions

1.2.2 柱后碘衍生法

以甲醇-乙腈-水（25∶10∶65，體積比）為流動相，流速0.8 mL/min；衍生溶液為0.05%碘溶液（取碘0.5 g，加入甲醇100 mL使溶解，用水稀釋定容至1 000 mL，即得），流速0.5 mL/min，衍生反應(yīng)溫度70℃。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.3.1 柱前衍生法

準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 1、2、10、20、100、200 μL于10 mL刻度吸管中，氮?dú)鈸]干。加入200 μL正己烷和 100 μL 三氟乙酸，混勻 30 s后，（40±1）℃水浴衍生15 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL樣品瓶中，氮?dú)獯蹈珊笥靡译?水（15∶85，體積比）定容至 1.0 mL，進(jìn)樣 20 μL，測定峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ng/mL）X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 柱后碘衍生法

準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 1、2、10、20、100、200 μL于1.5 mL樣品瓶中，用乙腈-水（15∶85，體積比）定容至1.0 mL，進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ng/mL）X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 樣品液的制備

1.4.1 柱前衍生法

準(zhǔn)確稱取試樣5.0 g左右于50 mL離心管，加入20 mL乙腈-水（84∶16，體積比）提取，5 000 r/min離心5 min，移取約8 mL提取液經(jīng)過功能凈化管凈化后，從收集池內(nèi)準(zhǔn)確移取2 mL凈化液于棕色具塞小瓶中，60℃水浴下氮?dú)獯蹈?，加?00 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，混勻 30 s后，（40±1）℃水浴衍生 15 min。氮?dú)獯蹈?，? mL乙腈-水（15∶85，體積比）溶解，混勻30 s，過 0.22 μm 水膜，待測。

1.4.2 柱后碘衍生法

準(zhǔn)確稱取試樣5.0 g左右于50 mL離心管，加入20 mL乙腈-水（84∶16，體積比）提取，5 000 r/min離心5 min，移取約8 mL提取液經(jīng)過功能凈化管凈化后，從收集池內(nèi)準(zhǔn)確移取2 mL凈化液于棕色具塞小瓶中，60℃水浴下氮?dú)獯蹈?，? mL乙腈-水（15∶85，體積比）溶解，混勻 30 s，過 0.22 μm 水膜，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

柱前衍生法和碘柱后衍生法的色譜圖見圖1。

圖1 柱前衍生法（A）和柱后碘衍生法（B）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of pre-column derivatization（A）and post-column derivatization（B）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

線性范圍及檢出限見表2。

表2 黃曲霉毒素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍（柱前衍生法和柱后碘衍生法）Table 2 Regression equations，correlation coefficients and linear ranges of aflatoxins（pre-columnderivatization and post-column derivatization with iodine）

結(jié)果表明：柱前衍生法，黃曲霉毒素G1、B1檢出限為 0.05 μg/kg，在 0.15 μg/kg～30 μg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，黃曲霉毒素 G2、B2檢出限為 0.015 μg/kg，在0.05 μg/kg～10 μg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；柱后碘衍生法，黃曲霉毒素 G1、B1檢出限為 0.08 μg/kg，在0.25 μg/kg～50 μg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，黃曲霉毒素 G2、B2檢出限為 0.015 μg/kg，在 0.05 μg/kg～10 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 方法回收率和精密度

在已知不含黃曲霉毒素的玉米制品中分別加入10、100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，按1.4節(jié)樣品液的制備試驗(yàn)方法進(jìn)行提取、凈化和檢測，重復(fù)測定6次，計(jì)算各種黃曲霉毒素的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，其結(jié)果見表3。

表3 方法回收率及精密度（n=6）Table 3 Recoveries and precision

2.4 樣品測定

采用上述2種方法分別對市售10份玉米制品進(jìn)行測定，均未檢出黃曲霉毒素。

3 結(jié)論與討論

本研究采用兩種衍生化方法對玉米制品中的黃曲霉毒素進(jìn)行了檢測，并對兩種方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明柱前衍生和柱后碘衍生法測定黃曲霉毒素在線性范圍、重復(fù)性、回收率等方面較相似，兩種方法均適用于玉米制品中的黃曲霉毒素檢測。柱前衍生法無需專門的柱后衍生裝置，但前處理過程中需要對樣品進(jìn)行衍生，較為繁瑣；碘衍生化法需要添加專門的柱后衍生泵來輸送衍生液，而且每天都需要配制腐蝕性的碘溶液。柱前衍生法對于小批量的樣品比較適用，柱后衍生法在大批量樣品時候可以節(jié)省大量的人力，具體工作時，可根據(jù)樣品量的大小以及實(shí)驗(yàn)室儀器的配備情況等選擇合適的方法。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2761-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011

[2]柳其芳.酶聯(lián)免疫吸附法和薄層色譜法聯(lián)合分析黃曲霉毒素B1的研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2006,6(2)：246-248

[3]李軍,于一茫,田苗,等.免疫親和柱凈化-柱后光化學(xué)衍生-高效液相色譜法同時檢測糧谷中的黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素 A[J].色譜,2006,24(6)：581-584

[4]馮靚,蔡增軒,譚瑩,等.HPLC同時測定食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(3)：511-513

[5]宮小明,任一平,董靜,等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定花生、糧油中18種真菌毒素[J].分析測試學(xué)報(bào),2011,30(1)：6-12

[6]朱聰英,應(yīng)永飛,韋敏鈺.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中黃曲霉毒素的研究[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2010,31(4)：240-246

Comparison of Pre-column Derivatization and Post-column Derivatizationfor Aflatoxin in Corn Products

WANG Min，LI Guang-yi，XING Yan*，LI Ting-ting，WANG Qin
（Zibo Center for Disease Control and Prevention，Zibo 255026，Shandong，China）

To compare 2 derivatization methods for determination of aflatoxin in corn products（pre-column derivatization and post-column derivatization）.The samples were purified by MycrosepTM226 multifunction purification column，separated by Waters Symmetry C18 （4.6 mm×250 mm，5.0 μm）and the fluorescence detector was used.Pre-column derivatizationmethod：sample extraction solution was determined by the use of three fluorine acetic acid for derivatization after purification.Post-column derivatization with iodine：the sample extract was purified by high performance liquid chromatography，and then detected by fluorescence detector.For pre-column derivatization，the detection limit of aflatoxin G1，B1was 0.05 μg/kg，the detection limit of aflatoxin G2，B2was 0.015 μg/kg ，r>0.999 1，and the recovery rate was between 75.4%and 84.2%；for post-column derivatization，the detection limit of aflatoxin G1，B1was 0.08 μg/kg，the detection limit of aflatoxin G2，B2was 0.015 μg/kg ，r>0.999 2，and the recovery rate was between 75.2%and 85.7%.The 2 methods are similar in terms of linear range，precision，recovery and so on.The results showed that the pre-column derivatization and post-column derivatization are all suitable for the detection of aflatoxin in corn products.

aflatoxin；pre column derivatization；post column derivatization；comparison

2016-10-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.030

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2015PH035）；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013WS0028）

王敏（1985—），女（漢），主管技師，碩士研究生，研究方向：公共衛(wèi)生理化檢驗(yàn)。

*通信作者：邢燕，主管技師。