岳玉秀

（吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林四平136001）

小根蒜揮發(fā)油抑菌活性的研究

岳玉秀

（吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林四平136001）

在研究小根蒜揮發(fā)油的抑菌活性試驗(yàn)中，選擇了青霉、釀酒酵母、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌4種常見的霉菌、真菌、細(xì)菌為受試菌種，采用了濾紙片法進(jìn)行抑菌活性分析。結(jié)果表明，小根蒜揮發(fā)油對這4種菌種都有明顯的抑制作用，根據(jù)抑菌圈直徑大小可以判斷其對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果相對較強(qiáng)；而對于青霉菌和釀酒酵母菌抑制效果一般。用分光光度計(jì)對不同濃度的抑菌液培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基進(jìn)行比色測定，測定OD值，OD值越低抑菌性越好。結(jié)果顯示，小根蒜揮發(fā)油抑菌液對釀酒酵母最低抑菌濃度為1.25%，對青霉最低抑菌濃度為0.63%，對大腸桿菌最低抑菌濃度為0.63%，對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度為0.31%。

小根蒜揮發(fā)油；菌種；抑菌活性

小根蒜作為一種藥食同源的山野菜，含有多種生物活性成分[1]，具有通陽開痹、溫中理氣、健胃整腸，抗菌消炎等多種珍貴的保健食療價(jià)值[2]。小根蒜中提取油可在養(yǎng)生與醫(yī)療保健中獲得較大應(yīng)用[3-5]。本試驗(yàn)選擇資源豐富的野生藥用植物小根蒜為材料，對抑菌物質(zhì)進(jìn)行有效提取，實(shí)現(xiàn)了小根蒜的深度開發(fā)利用，豐富了其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)確定了小根蒜提取油的抑菌活性，為開發(fā)純天然、無污染的植物源防腐劑提供依據(jù)[6-7]。對提取出來的小根蒜揮發(fā)油的抑菌活性進(jìn)行確定，并且確定了小根蒜揮發(fā)油對青霉、釀酒酵母、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

小根蒜揮發(fā)油：吉林工程職業(yè)學(xué)院生物工程分院實(shí)驗(yàn)室提取；丙三醇（分析純）：杭州邦易化工有限公司；牛肉膏（分析純）、蛋白胨（分析純）、瓊脂粉（分析純）：天津市化學(xué)試劑二廠；葡萄糖（分析純）：濟(jì)寧百川化工有限公司；氯化鈉（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硝酸鈉（分析純）：新鄉(xiāng)市中信化工有限公司；磷酸氫二鉀（分析純）、硫酸鎂（分析純）、氯化鉀（分析純）、硫酸亞鐵（分析純）：北京化工廠；蔗糖（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 供試菌種

本試驗(yàn)選用常用菌種：青霉、釀酒酵母、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（菌種均由吉林工程職業(yè)學(xué)院生物工程分院實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.3 培養(yǎng)基

細(xì)菌用牛肉膏一蛋白胨培養(yǎng)基；酵母菌用PDA培養(yǎng)基；霉菌用察氏培養(yǎng)基。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1 000 mL，加熱溶解，用酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮切塊）300 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1 000 mL。將馬鈴薯去皮切塊，加1 000 mL蒸餾水，煮沸25 min。用紗布過濾，補(bǔ)加蒸餾水至1 000 mL。加入葡萄糖和瓊脂，加熱溶化，分裝，121℃高壓滅菌20 min。

查氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀 0.5 g、硫酸亞鐵 0.01 g、蔗糖 30 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，加熱溶解，分裝后在121℃條件下滅菌20 min。

1.4 設(shè)備與儀器

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、SPX-250B-D型振蕩培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；LSC-239CW型立式冷藏陳列柜：星星集團(tuán)有限公司提供；UV2300型紫外可見分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司提供；O1J2003-04型立式壓力蒸汽滅菌筒：上海東亞壓力容器制造有限公司提供；KYC-100C型空氣恒溫?fù)u床：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司提供；DW-FL90型數(shù)字酸度計(jì)：上海鵬順科學(xué)儀器有限公司提供；FA2004型電子天平：上海上平儀器公司提供；DM-1000型光學(xué)顯微鏡：Leica Microsystems產(chǎn)品；MC-PYl 8A型多功能電磁爐：廣東美的生活電器制造有限公司提供。

1.5 方法

1.5.1 原料預(yù)處理

配制20%的丙三醇水溶液，再用其配制0.05 g/mL的小根蒜揮發(fā)油試樣。

1.5.2 菌種的活化

取出冷藏狀態(tài)不同的菌種，在無菌環(huán)境中各接種150 μL到已滅菌的5 mL液體培養(yǎng)基中，根據(jù)不同菌種的最佳培養(yǎng)溫度設(shè)置震蕩培養(yǎng)箱的溫度，將接種后的液體培養(yǎng)基放入對應(yīng)的培養(yǎng)箱中，震蕩培養(yǎng)24 h，如此反復(fù)，直至得到第三代菌懸液。

1.5.3 抑菌效果測定

采用濾紙片擴(kuò)散法測定小根蒜揮發(fā)油抑菌效果。用濾紙（定性）制作成直徑為6 mm的圓形紙片，放入無菌室中紫外照射30 min，再將其分兩份，分別浸泡于含5%小根蒜揮發(fā)油溶液和20%丙三醇溶液中放置到無菌室備用。把平板放入烘箱160℃，進(jìn)行滅菌4 h，取出放到無菌室中備用，待冷卻后將固體培養(yǎng)基快速倒進(jìn)平板里等待液體自動凝固，在無菌室中，采用涂布平板法，將配制好的菌懸液震蕩搖勻，用無菌移液槍吸取150 μL菌懸液，將其均勻地涂布于平板固體培養(yǎng)基中，再將濾紙片放置在含菌平板上，每個(gè)紙片相隔一定間距，每種菌設(shè)3個(gè)重復(fù)，并設(shè)空白對照（一個(gè)平板放3張浸有小根蒜揮發(fā)油溶液的濾紙片再放入和1張浸有20%丙三醇溶液的濾紙片）然后將其倒置于培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，真菌28℃，48h，細(xì)菌37℃，24h。時(shí)間到達(dá)測量抑菌圈的直徑，取平均值。

1.5.4 最低抑菌濃度的測定

用分光光度計(jì)對不同濃度的抑菌液培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基進(jìn)行比色測定，測定OD（吸光值）值，OD越低抑菌性越好，從不同濃度小根蒜揮發(fā)油液培養(yǎng)的培養(yǎng)基的OD值變化，可以判斷出最低抑菌濃度。具體操作：配制出25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.562 5%一系列濃度的小根蒜揮發(fā)油抑菌液，在無菌環(huán)境下，稱取9mL已滅菌的液體細(xì)菌培養(yǎng)基，分裝試管。用無菌移液槍取不同濃度的小根蒜揮發(fā)油抑菌液1 mL，加入到液體培養(yǎng)基的試管中，搖勻，此時(shí)液體培養(yǎng)基中，小根蒜揮發(fā)油抑菌液的濃度都降低10倍。每一系列接種1種菌，接種量為3%，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。對照系列不接菌，適宜溫度下，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)24 h，每4小時(shí)進(jìn)行OD（吸光值）值測定，釀酒酵母、青霉培養(yǎng)48 h，每8小時(shí)進(jìn)行OD值測定，波長580 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 小根蒜揮發(fā)油抑菌效果的影響

小根蒜揮發(fā)油對幾種菌落的抑制作用結(jié)果如表1所示。

表1 小根蒜揮發(fā)油（AMB）對菌種的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of AMB volatile oil on strains

從表中可以反映出，小根蒜護(hù)發(fā)油對釀酒酵母菌、大腸桿菌、青霉、金黃色葡萄球菌菌種都有抑制的作用。根據(jù)抑菌圈直徑大小初步可以判斷其對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果相對較強(qiáng)；而對于青霉菌和釀酒酵母菌抑制效果一般。

2.2 小根蒜揮發(fā)油最低抑菌濃度的測定

不同濃度小根蒜揮發(fā)油抑菌液對釀酒酵母的抑菌效果見圖1。

圖1 不同濃度小根蒜揮發(fā)油抑菌液對釀酒酵母的抑菌效果Fig.1 Antibacteria effect of different concentrations AMB votatile oil antibacterial liquid on Saccharomyces cerevisiae

由圖1可知，從對照組的OD值曲線，可以看出小根蒜揮發(fā)油抑菌液所有濃度受試對釀酒酵母都有一定的抑菌作用。而在濃度≤1.25%時(shí)，OD值隨時(shí)間變化明顯升高，表明在此濃度以下，小根蒜揮發(fā)油抑菌液抑菌效果不顯著。當(dāng)濃度大于此濃度時(shí)，吸光值上升緩慢，表明在一定程度上有效的抑制釀酒酵母生長繁殖。確定小根蒜揮發(fā)油抑菌液對釀酒酵母最低抑菌濃度為1.25%。

不同濃度小根蒜揮發(fā)油抑菌液對青霉的抑菌效果見圖2。

圖2 不同濃度小根蒜揮發(fā)油抑菌液對青霉的抑菌效果Fig.2 Antibacteria effect of different concentrations AMB votatile oil antibacterial liquid on Penicillium

由圖2可知，小根蒜揮發(fā)油抑菌液濃度≤0.63%時(shí)，OD值變化十分明顯升高，幾乎與對照組相似，這說明青霉生長繁殖沒有被有效的抑制。而當(dāng)濃度超過此濃度時(shí)，吸光值則上升非常緩慢，表明在一定程度上有效的抑制青霉生長繁殖。確定小根蒜揮發(fā)油抑菌液對青霉最低抑菌濃度為0.63%。

不同濃度小根蒜揮發(fā)油抑菌液對大腸桿菌的抑菌效果見圖3。

圖3 不同濃度小根蒜揮發(fā)油抑菌液對大腸桿菌的抑菌效果Fig.3 Antibacteria effect of different concentrations AMB votatile oil antibacterial liquid on Escherichia Coli

由圖3可知，在小根蒜揮發(fā)油抑菌液濃度≤0.63%時(shí)，大腸桿菌液體培養(yǎng)基的OD值明顯升高，表明在此濃度以下，小根蒜揮發(fā)油抑菌液抑菌效果不顯著。當(dāng)濃度大于此濃度時(shí)，吸光值上升緩慢，表明在一定程度上有效的抑制大腸桿菌生長繁殖。確定小根蒜揮發(fā)油抑菌液對大腸桿菌最低抑菌濃度為0.63%。

不同濃度小根蒜揮發(fā)油抑菌液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果見圖4。

圖4 不同濃度小根蒜揮發(fā)油抑菌液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.4 Antibacteria effect of different concentrations AMB votatile oil antibacterial liquid on Staphylococcus aureus

由圖4可知，在小根蒜揮發(fā)油抑菌液濃度≤0.31%時(shí)，金黃色葡萄球菌液體培養(yǎng)基的OD值明顯升高，表明在此濃度以下，小根蒜揮發(fā)油抑菌液抑菌效果不顯著。當(dāng)濃度大于此濃度時(shí)，吸光值上升緩慢，表明在一定程度上有效的抑制金黃色葡萄球菌生長繁殖。確定小根蒜揮發(fā)油抑菌液對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度為0.31%。

3 結(jié)論與討論

在研究小根蒜揮發(fā)油的抑菌活性試驗(yàn)中，采用了濾紙片分析法根據(jù)抑菌直徑長短的指標(biāo)來判斷抑菌活性。結(jié)果表明，小根蒜揮發(fā)油菌種青霉、釀酒酵母、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌都有明顯的抑制作用，但抑制效果大小不同，根據(jù)抑菌圈直徑大小可以判斷其對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果相對較強(qiáng)；而對于青霉菌和釀酒酵母菌抑制效果一般。用分光光度計(jì)對不同濃度的抑菌液培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基進(jìn)行比色測定，測定OD值，OD值越低抑菌性越好，從不同濃度小根蒜揮發(fā)油液培養(yǎng)的培養(yǎng)基的OD值變化，可以判斷出最低抑菌濃度。結(jié)果顯示，小根蒜揮發(fā)油抑菌液對釀酒酵母最低抑菌濃度為1.25%。小根蒜揮發(fā)油抑菌液對青霉最低抑菌濃度為0.63%。小根蒜揮發(fā)油抑菌液對大腸桿菌最低抑菌濃度為0.63%，小根蒜揮發(fā)油抑菌液對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度為0.31%。

從抑菌活性試驗(yàn)得出的結(jié)論上可以看出，小根蒜揮發(fā)油有一定的抑菌效果，這一結(jié)論與其他參考文獻(xiàn)即研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，但本試驗(yàn)只針對青霉、釀酒酵母、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌4種菌種進(jìn)行試驗(yàn)，暫時(shí)不能籠統(tǒng)概括小根蒜揮發(fā)油對其他霉菌、真菌、細(xì)菌具有抑菌活性。

[1]姚玉霞.苣荬菜、小根蒜營養(yǎng)成分分析[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào),2003,25(2)：173-174

[2]姜曉莉,工淑玲.小根蒜的營養(yǎng)價(jià)值與開發(fā)利用[J].特種經(jīng)濟(jì)動植物,2000(6)：22

[3]吳朝霞,夏天爽,李琦,等.同時(shí)蒸餾法提取艾葉揮發(fā)油及其抑菌性研究[J].食品研究與開發(fā),2010,31(8)：19-22

[4]王雅,趙萍,任海偉,等.微波輔助萃取葫蘆巴莖葉揮發(fā)油工藝優(yōu)化及抗氧化性研究[J].食品科學(xué),2011,32(16)：326-329

[5]Mimaki Yoshihiro,Kawashima Kazuhiro,Kanmoto Toshihiro,et al.Steroidal glycosides from Allium albopilosum and A.ostrowskianum[J].Phytochemistry,1993,34(3)：799

[6]張志軍,劉西亮,李會珍,等.植物揮發(fā)油提取方法及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國糧油學(xué)報(bào),2011,26(4)：118-122

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Study on Bacteriostasis Activity of the Allium macrostemon Bunge Volatile Oil

YUE Yu-xiu
（Jilin Engineering Vocational College，Siping 136001，Jilin，China）

In the research of Allium macrostemon Bunge volatile oil antibacterial activity test，Penicillium and Saccharomyces cerevisiae，Escherichia coli，Staphylococcus aureus were selected，four kinds of common mold，fungi，bacteria as test strain，and the filter paper method was used to analysis of antibacterial activity.Results showed that Allium macrostemon Bunge volatile oil had obvious inhibitory effect on the four kinds of strain.According to the diameter size of the inhibition zone，it could be judged that the inhibitory effect on Escherichia coli and Staphylococcus aureus were relatively stronger；while on the effect Penicillium and Saccharomyces cerevisiae were modest.Taking colorimetric determination to different concentrations of antibacterial liquid culture medium with spectrophotometer determined the OD value，the lower value，the better antibacterial activity.The results showed that the minimum inhibitory concentration of Allium macrostemon Bunge volatile oil antibacterial liquid on Saccharomyces cerevisiae was 1.25%，on Penicillium was 0.63%，on Escherichia coli was 0.63%and on Staphylococcus aureus was 0.31%.

Allium macrostemon Bunge volatile oil；strain；antibacterial activity

2016-10-04

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.005

岳玉秀（1984—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品加工與安全。