呂晨，陳鑫，朱雄白，林文軍，王路，黃正湘，楊勝武

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

miR-21在人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS體外侵襲中的作用及其機(jī)制

呂晨，陳鑫，朱雄白，林文軍，王路，黃正湘，楊勝武

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325015）

目的：探討miR-21在人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS體外侵襲中的作用及其機(jī)制。方法：培養(yǎng)人正常成骨細(xì)胞系hFOB 1.19和人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）比較2組細(xì)胞miR-21的表達(dá)差異。通過miR-21-up慢病毒感染U2OS細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)感染前后U2OS細(xì)胞中miR-21的表達(dá)變化。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-21對(duì)U2OS細(xì)胞侵襲的影響，并通過Western blot檢測(cè)驗(yàn)證在U2OS細(xì)胞中miR-21對(duì)于靶基因PTEN是否具有調(diào)控作用及miR-21對(duì)U2OS細(xì)胞中侵襲相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9表達(dá)的影響。結(jié)果：qRT-PCR結(jié)果表明miR-21在骨肉瘤細(xì)胞系U2OS中高表達(dá)（P＜0.05）。Transwell檢測(cè)結(jié)果表明上調(diào)miR-21的表達(dá)能夠明顯促進(jìn)U2OS細(xì)胞的侵襲（P＜0.05）。Western blot檢測(cè)表明PTEN在骨肉瘤細(xì)胞中低表達(dá)，且與miR-21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。miR-21可促進(jìn)侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論：miR-21可通過抑制PTEN蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS的侵襲。

miR-21；骨肉瘤；PTEN；基質(zhì)金屬蛋白酶；侵襲

骨肉瘤是一種好發(fā)于兒童和青少年的骨原發(fā)性惡性腫瘤，約占兒科腫瘤的5%[1]，男性發(fā)病率略高于女性。骨肉瘤好發(fā)于長管狀骨的干骺端，以股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端最多見。骨肉瘤惡性程度高，預(yù)后極差。近年來，隨著輔助檢查和手術(shù)技術(shù)的提高，特別是新的化療藥物的使用，骨肉瘤5年生存率從20%提高到70%。然而，由于骨肉瘤早期就可出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，臨床單純骨肉瘤截肢術(shù)后患者的5年生存率仍然不容樂觀[2-3]。目前，骨肉瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制仍未明確。因此，迫切需要尋找一種新的可以預(yù)測(cè)腫瘤進(jìn)展的有效分子標(biāo)記物，探討其作用機(jī)制，并用于指導(dǎo)臨床預(yù)后。

microRNA（miRNA）是一類存在于動(dòng)植物以及病毒中可調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長21～23個(gè)核苷酸。研究[4]表明miRNA可通過與其靶基因mRNA 3’端非翻譯區(qū)完全或部分的匹配結(jié)合，使后者降解或抑制其翻譯過程，從而發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用。研究表明，miRNA和骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展以及耐藥性有著密切的關(guān)系[5-6]。根據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道，多種腫瘤標(biāo)本以及細(xì)胞系都檢測(cè)出miR-21表達(dá)水平的異常升高，包括神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、婦科腫瘤、生殖系統(tǒng)腫瘤等，因此miR-21是目前公認(rèn)的一個(gè)致癌性miRNA。但目前有關(guān)miR-21與骨肉瘤的相關(guān)性研究甚少。為了更好地探究miR-21在骨肉瘤進(jìn)展中的作用，本研究通過比較miR-21在正常人成骨細(xì)胞系hFOB 1.19和人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS中的表達(dá)差異，以及通過上調(diào)miR-21的表達(dá)，研究miR-21的表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲的影響，并對(duì)miR-21調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞侵襲的機(jī)制進(jìn)行初步的探討，為骨肉瘤的靶向治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和主要試劑：人正常成骨細(xì)胞系hFOB 1.19由SUBRAMANIAM博士惠贈(zèng)[8]，人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM/High-glucose培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素等購自美國Gibco公司，pGCMV-rno-miR-21-up慢病毒表達(dá)載體購自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司，Hairpin-itTMmiRNAs RT-PCR Quantitation試劑盒（探針法）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，兔抗大鼠PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen）單克隆抗體購自美國CST公司，兔抗大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2/9多克隆抗體購自美國Protein Tech公司，兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體購自北京康為世紀(jì)生物有限公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物有限公司，Transwell小室購自美國Millipore公司，結(jié)晶紫購自北京索萊寶生物技術(shù)公司。

1.1.2 主要儀器：超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、培養(yǎng)皿、孔板、微量加樣器、37 ℃水浴箱、4/-20 ℃冰箱、-80 ℃冰箱、低速離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、羅氏480熒光定量PCR儀、ECL發(fā)光系統(tǒng)等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人正常成骨細(xì)胞系hFOB 1.19采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS采用含10%胎牛血清的DMEM/Highglucose培養(yǎng)基培養(yǎng)；2組細(xì)胞均放置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。細(xì)胞每2 d換液1次，當(dāng)貼壁細(xì)胞融合度達(dá)80%左右用胰酶消化制成細(xì)胞懸液，按1:3傳代。

1.2.2 miR-21-up慢病毒感染人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS：將對(duì)數(shù)生長期的U2OS細(xì)胞接種于6孔板（密度約3× 104/mL），于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%。 配置病毒感染液：miR-21-up慢病毒（1860-5，miR-21-up）20 μL，陰性對(duì)照慢病毒（CON063，NC）10 μL，polybrene 1 μL，Enhanced infection solution 2 mL。miR-21-up慢病毒及陰性對(duì)照慢病毒載體感染U2OS細(xì)胞12 h后，更換為正常含10%血清的DMEM/High-glucose培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h后熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞感染情況（綠色熒光蛋白GFP表達(dá)情況）。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)miR-21的表達(dá)：收集感染前后各組細(xì)胞，分別加入1 mL Trizol。按照Trizol使用說明書提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)總體積20 μL，RNA模板量1 μg。選取U6 snRNA作為內(nèi)參，采用探針法定量PCR反應(yīng)：反應(yīng)體積20.0 μL，向0.2 mL PCR管內(nèi)加入cDNA 2.0 μL、2×Real-time PCR Master Mix 10 μL、miR-21 Primer set 0.4 μL（U6 snRNA Primer set 0.4 μL）、miR-21 Probe 0.2 μL（U6 snRNA Probe 0.2 μL）、Taq DNA polymerase 0.2 μL、Sterilized H2O27.2 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，然后95 ℃/12 s、62 ℃/40 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。計(jì)算miR-21相對(duì)于U6 snRNA的表達(dá)比率，基因引物見表1。

表1 qRT-PCR反應(yīng)引物序列

1.2.4 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：Transwell小室（孔徑8 μm）微孔膜上表面預(yù)先均勾涂抹Matrigel人工基底膜20 μL，37 ℃孵箱孵育30 min使基底膜凝固。收集各組細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，以25×104/mL密度將細(xì)胞鋪至小室上室，下室加入含10%血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出小室，以棉簽輕輕拭去微孔膜上層細(xì)胞，對(duì)微孔膜下細(xì)胞染色：PBS浸泡清洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS浸泡清洗至紫色消失，顯微鏡下觀察微孔膜并隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)非重復(fù)視野下細(xì)胞數(shù)，取均值。每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集各組細(xì)胞，細(xì)胞裂解液4 ℃裂解，12 000 r/min離心，取上清蛋白液。BCA法蛋白液濃度測(cè)定，10% SDS-PAGE電泳分離總蛋白，電泳結(jié)束后取出分離膠，通過轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉2 h，后加入兔抗大鼠PTEN（1:1 000）、MMP-2/9（1:500）、GAPDH（1:2 000）抗體，4 ℃搖床封閉過夜。TBST洗3次，HRP標(biāo)記的抗兔二抗（1:5 000）室溫?fù)u床孵育2 h。TBST洗3次，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用Graph Pad Prism 6作圖軟件作圖，2組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-21在U2OS細(xì)胞中的表達(dá) 采用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-21的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hFOB 1.19、U2OS細(xì)胞中miR-21的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00± 0.00、5.80±0.44。與hFOB 1.19細(xì)胞相比，U2OS細(xì)胞中miR-21的mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 miR-21-up慢病毒感染U2OS細(xì)胞 通過參照吉?jiǎng)P基因公司提供的《慢病毒使用操作手冊(cè)Version 2.0》，miR-21-up及NC感染U2OS細(xì)胞（MOI=20），感染96 h后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。與正常U2OS細(xì)胞比較，未見病毒對(duì)感染后細(xì)胞生長狀態(tài)有明顯影響。倒置熒光顯微鏡下觀察，可見絕大多數(shù)細(xì)胞成功表達(dá)GFP（表達(dá)率超過80%），見圖1，結(jié)果表明，miR-21-up慢病毒成功感染了U2OS細(xì)胞。

圖1 miR-21-up慢病毒感染U2OS細(xì)胞（×100）

2.3 qRT-PCR檢測(cè)感染前后細(xì)胞miR-21的表達(dá)情況

通過qRT-PCR檢測(cè)慢病毒感染前后各組細(xì)胞miR-21的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組和陰性對(duì)照組比，miR-21-up組miR-21的表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），陰性對(duì)照組與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 miR-21-up慢病毒感染前后miR-21相對(duì)表達(dá)量

2.4 miR-21對(duì)U2OS細(xì)胞體外侵襲的影響 采用Transwell檢測(cè)miR-21對(duì)U2OS體外侵襲的影響，結(jié)果顯示，正常組、陰性對(duì)照組、miR-21-up組發(fā)生侵襲的U2OS細(xì)胞數(shù)量分別為54.3±6.0、49.7±7.5、103.7±7.1。miR-21-up組細(xì)胞的侵襲能力較正常組、陰性對(duì)照組均明顯升高（P＜0.05），而陰性對(duì)照組與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

2.5 miR-21靶基因預(yù)測(cè)以及Western blot檢測(cè) 通過生物信息學(xué)軟件分析，我們發(fā)現(xiàn)PTEN可能是miR-21的一個(gè)靶基因[9]。通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PTEN在U2OS細(xì)胞中的表達(dá)較hFOB 1.19細(xì)胞明顯降低（P＜0.05），見圖4A。通過Western blot檢測(cè)比較慢病毒感染前后各組細(xì)胞PTEN表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miR-21-up組PTEN的表達(dá)量較正常組、陰性對(duì)照組均明顯降低（P＜0.05），而陰性對(duì)照組與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4B。

2.6 miR-21對(duì)U2OS細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響采用Western blot檢測(cè)慢病毒感染前后各組細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miR-21-up組MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)量較正常組、陰性對(duì)照組均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），陰性對(duì)照組與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖3 Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力變化（×200）

圖4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞PTEN表達(dá)變化

3 討論

骨肉瘤惡性程度高，預(yù)后差，即使采用手術(shù)聯(lián)合化療，治療效果仍不佳?；蛩降闹委熞恢笔枪侨饬鲅芯恐械臒狳c(diǎn)，尋求有效的治療靶點(diǎn)是研究的關(guān)鍵。miRNA是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼單鏈小RNA分子，因其表達(dá)具有時(shí)序性、時(shí)間和組織特異性以及保守性等特點(diǎn)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可作為癌基因或者抑癌基因調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)[10]。研究報(bào)道m(xù)iRNA與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)效應(yīng)相關(guān)[11-12]。由于miR-21在絕大多數(shù)腫瘤中的表達(dá)均顯著增加，且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，因而成為近年來miRNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。YANG等[13]報(bào)道m(xù)iR-21通過下調(diào)PTEN表達(dá)促進(jìn)人大腸癌細(xì)胞的增殖；BAO等[14]研究表明miR-21通過抑制PTEN和hSulf-1的表達(dá)，激活A(yù)KT/ERK通路，促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展；ZHANG等[15]報(bào)道m(xù)iR-21通過下調(diào)PTEN表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。但目前關(guān)于miR-21是否參與調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移及其具體分子機(jī)制的報(bào)道很少。ZIYAN等[16]報(bào)道在骨肉瘤組織中miR-21的表達(dá)與腫瘤抑制基因RECK的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。VANAS等[17]研究表明miR-21可通過抑制Sprouty2的表達(dá)，進(jìn)而提高骨肉瘤細(xì)胞對(duì)卡鉑治療的敏感性。因此，我們推測(cè)miR-21在骨肉瘤中同樣呈現(xiàn)高表達(dá)，并與骨肉瘤的發(fā)生、進(jìn)展等密切相關(guān)。

圖5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)變化

我們前期的研究通過比較miR-21在人骨肉瘤細(xì)胞系（MG63、U2OS、143B、SaO2）與正常人成骨細(xì)胞系（hFOB1.19）的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)miR-21在U2OS細(xì)胞中的表達(dá)量最高，而在MG63細(xì)胞中的表達(dá)量最低（數(shù)據(jù)未提供），研究結(jié)果與VANAS等[17]研究相一致。因此，我們選擇miR-21表達(dá)差異最大的2組細(xì)胞系（MG63、U2OS）進(jìn)行后續(xù)研究。我們已經(jīng)證實(shí)miR-21在骨肉瘤細(xì)胞系MG63中的作用[9]。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明miR-21在U2OS細(xì)胞的表達(dá)較hFOB 1.19細(xì)胞明顯增加。為探討miR-21對(duì)U2OS細(xì)胞侵襲的影響，本研究成功構(gòu)建miR-21-up慢病毒載體，并成功感染U2OS細(xì)胞，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)證實(shí)感染后的U2OS細(xì)胞中miR-21的表達(dá)明顯上調(diào)。本研究采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)推測(cè)miR-21在U2OS細(xì)胞侵襲中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-21可顯著地提高U2OS細(xì)胞的侵襲能力。

PTEN是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，是繼p53基因后另一個(gè)較為廣泛地與腫瘤發(fā)生密切關(guān)系的基因[18]。PTEN蛋白在細(xì)胞生長、凋亡、遷移、侵襲等方面具有重要作用[19]。研究表明，PTEN作為抑癌基因，通過調(diào)控細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲[20]。近些年來，關(guān)于PTEN在骨肉瘤進(jìn)展中的作用研究逐漸增多[21]。LEVINE等[22]報(bào)道PTEN在狗骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)降低；TIAN等[23]報(bào)道m(xù)iR-23a可以通過抑制PTEN的表達(dá)促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲。本研究通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白在人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS中的表達(dá)較正常人成骨細(xì)胞系hFOB 1.19明顯降低，并且PTEN蛋白的表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)miR-21的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。研究結(jié)果表明，miR-21在U2OS細(xì)胞中能顯著地負(fù)調(diào)控PTEN的表達(dá)，推斷miR-21可通過抑制PTEN的表達(dá)促進(jìn)U2OS細(xì)胞侵襲。

MMPs是一類以Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子的蛋白酶類，其主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)，維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡[24]。腫瘤細(xì)胞能通過分泌MMPs，穿透細(xì)胞外基質(zhì)基底膜形成侵襲轉(zhuǎn)移。因而，MMPs與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[25]。MMP-2和MMP-9是MMP家族中參與體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)降解的最主要的兩個(gè)蛋白，兩者能有效地分解基底膜的主要成分IV型膠原纖維和層黏連蛋白，在細(xì)胞侵襲、遷移等生物學(xué)過程中起到了更多的特殊作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞中MMPs的分泌與PTEN表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。LI等[26]研究表明PPAR-gamma可激活PTEN的表達(dá)從而抑制MMP-2的分泌，抑制胰腺癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移；CHEN等[27]研究發(fā)現(xiàn)PTEN可以通過抑制MMP-9的表達(dá)而抑制肝細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)miR-21的表達(dá)呈正相關(guān)；同時(shí)，與細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。因此，我們認(rèn)為miR-21可通過抑制PTEN的表達(dá)，促進(jìn)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，提高U2OS細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，本研究證實(shí)miR-21可通過靶向調(diào)控PTEN基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)侵襲相關(guān)蛋白MMPs的分泌，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞U2OS的侵襲，這為早期治療骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移等提供新的思路。我們相信隨著基因技術(shù)的發(fā)展，miR-21可作為評(píng)估骨肉瘤惡性程度、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的重要分子生物標(biāo)志，不僅可以為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)后提供預(yù)測(cè)，并且可以作為新的靶向藥物應(yīng)用于臨床中。但本研究亦存在不足之處，即體內(nèi)微環(huán)境在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用，后期研究需要通過更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-21在骨肉瘤早期侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

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（本文編輯：趙翠翠）

Role and mechanism of miR-21 in human osteosarcoma cell line U2OS invasion in vitro

LYU Chen, CHEN Xin, ZHU Xiongbai, LIN Wenjun, WANG Lu, HUANG Zhengxiang, YANG Shengwu.

Department of Orthopedics, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To study the role and mechanism of miR-21 on regulating invasion in osteosarcoma cell line U2OS in vitro.Methods:The cultivation of human fetal osteoblastic cell line hFOB1.19 and human osteosarcoma cell line U2OS. qRT-PCR was used to detect the expression of miR-21 in the previous two groups. miR-21-up lentivirus infected U2OS cells. qRT-PCR was then used to detect the expression of miR-21 between the miR-21-up-infected U2OS cells and no-infected U2OS cells. Transwell chamber invasion assay was used to observe the effect of miR-21 in U2OS cells invasion. Western blot analysis was used to verify miR-21’s role in regulating the expression of PTEN and invasive associated protein MMP-2/MMP-9 in U2OS cells.Results:qRTPCR results showed that the expression of miR-21 was signifi cantly increased in U2OS cells (P＜0.05). Transwell assay results showed that overexpression of miR-21 could signifi cantly promote U2OS cells invasion (P＜0.05). Western blot analysis results showed that the expression of PTEN was decreased in U2OS cells and negative correlated with miR-21 (P＜0.05). Western blot results analysis also showed that miR-21 could signifi cantly improve the expression of MMP-2/9 (P＜0.05).Conclusion:miR-21, which targets PTEN, promotes U2OS invasion by activating the expression of MMP-2/9.

miR-21; osteosarcoma; PTEN; matrix metalloproteinases; invasion

R730.54

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.07.005

2016-09-14

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY14H060007）。

呂晨（1989-），男，江蘇鹽城人，住院醫(yī)師，博士。

楊勝武，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：yangshengwu188@sina.com。