趙家銘，王麗麗，馬作斌，王昌華，鄭文靜

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新中心，遼寧沈陽 110161）

分子標(biāo)記輔助選育攜帶抗稻瘟病基因Pi65（t）的水稻新品種

趙家銘，王麗麗，馬作斌，王昌華，鄭文靜

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新中心，遼寧沈陽 110161）

港育129攜帶主效抗稻瘟病基因Pi65（t），以港育129為父本，遼星1號(hào)為母本，F(xiàn)1代與遼星1號(hào)回交，用連鎖標(biāo)記InDel-1對(duì)BC1F2代進(jìn)行篩選，從中選取農(nóng)藝性狀與遼星1號(hào)相似且攜帶純合Pi65（t）的單株進(jìn)行花藥培養(yǎng)，獲取優(yōu)質(zhì)抗病新品系遼粳168，2014年參加遼寧省水稻區(qū)域試驗(yàn)晚熟組，2017年通過遼寧省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定。

稻瘟病分子育種抗病基因

由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是一種世界性的稻作病害，在世界各水稻產(chǎn)區(qū)每年都有不同程度的發(fā)生（Zeigler RS et al．，1994）［1］。該病發(fā)生時(shí)產(chǎn)量一般減少10%～20%，較嚴(yán)重的地區(qū)可達(dá)40%～50%，局部區(qū)域甚至顆粒無收（Kush GS et al．，2009；Liu J L et al．，2010）［2～3］。我國(guó)北方粳稻年栽培面積達(dá)466．7萬hm2以上，占全國(guó)粳稻生產(chǎn)面積近60%。近20年來，盡管在高產(chǎn)育種上有巨大突破，但由于稻瘟病菌復(fù)雜多變，且品種抗譜狹窄，加之品種單一化大面積種植，導(dǎo)致很多育成的超級(jí)稻品種推廣幾年即喪失了抗性。改良這些主栽水稻品種的抗性，同時(shí)不改變其原有的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等優(yōu)良農(nóng)藝性狀，是廣大育種者一直追求的目標(biāo)。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的普及，利用雜交、回交，采用分子標(biāo)記輔助導(dǎo)入及聚合主效抗稻瘟病基因已成為目前抗病育種的主要方向（Fukuoka S et al．，2009）［4］。

多年來，抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助育種也取得了巨大的成就，攜帶不同抗病基因的水稻品種已在生產(chǎn)中不同程度得到應(yīng)用（王忠華等，2004；陳學(xué)偉等，2004；胡景濤等，2010；郭振華等，2013；梁毅等，2013；田紅剛等，2016；王飛等，2016）［5～12］。港育129是由遼寧省東港市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心育成并于2009年經(jīng)遼寧省品種審定委員會(huì)審定的水稻品種，經(jīng)人工接種，該品種對(duì)遼寧地區(qū)流行的多個(gè)生理小種均表現(xiàn)抗病。項(xiàng)目組前期利用SLAF-BSA技術(shù)從港育129中定位到一個(gè)抗稻瘟病基因Pi65（t），并篩選到一個(gè)與該基因緊密連鎖的分子標(biāo)記InDel-1（Zheng et al．，2016）［13］，本研究以港育129和遼星1號(hào)為親本，通過雜交、回交及后代的分子標(biāo)記輔助選擇及花藥培養(yǎng)育成了一個(gè)水稻新品種，其農(nóng)藝性狀與遼星1號(hào)較為相似，且攜帶主效抗稻瘟病基因Pi65（t）。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗病供體親本港育129，感病受體親本遼星1號(hào)，均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雜交與回交

2010年初在海南以港育129號(hào)為父本，以遼星1號(hào)為母本雜交獲得F1。2010年夏在沈陽以遼星1號(hào)為母本，以F1為父本回交，獲BC1F1，2010年冬BC1F1在海南自交，獲BC1F2。

1.2.2 雜交后代的分子標(biāo)記輔助選擇

從BC1F2中選擇株型與遼星1號(hào)相似的單株，采用改良的CTAB法提取葉片DNA，利用In-Del-1F：5’-ATCTTACCTC AACATTGCC-3’和In-Del-1R：5’-AGACATGTTG AAGACGCCT-3’進(jìn)行基因擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下：2×Taq PCR Master Mix（艾德萊PC0902）10 μl，10 μm的引物各0．5 μl，100 μg／ml的模板DNA 1 μl，ddH2O 8 μl［14］。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸70 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。取4 μl PCR產(chǎn)物，利用6%聚丙烯酰氨凝膠電泳鑒定各個(gè)體基因型，篩選只獲得一條長(zhǎng)約140 bpPCR產(chǎn)物的個(gè)體，從田間取其單核靠邊期花藥，按照鄭文靜等的方法進(jìn)行花藥培養(yǎng)［15］。

20世紀(jì)80年代，根策爾拜入激光發(fā)明者之一、諾貝爾獎(jiǎng)得主、物理學(xué)家查爾斯·湯斯（Charles Townes）的門下，進(jìn)入加州大學(xué)伯克利分校作博士后研究。他曾在最近的一次電話訪談中表示：“湯斯對(duì)我很好，我覺得自己就像是他的小兒子一樣。”正是從那時(shí)起，根策爾對(duì)銀河系中心的這個(gè)黑暗天體產(chǎn)生了興趣。

1.2.3 純合品系的產(chǎn)量比較試驗(yàn)

將通過花藥培養(yǎng)獲得的純合品系連同對(duì)照品種遼星1號(hào)種植于田間，小區(qū)面積4．8 m2，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，秋季收獲，測(cè)產(chǎn)。

1.2.4 品種區(qū)域試驗(yàn)

2012年至2013年在沈陽、東港和莊河分別進(jìn)行了品種比較試驗(yàn)及小面積示范，選出產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)及高抗稻瘟病的材料創(chuàng)新1號(hào)（品比編號(hào)DH170）。2014年參加遼寧省水稻區(qū)域試驗(yàn)晚熟組預(yù)備試驗(yàn)，2015～2016年參加遼寧省水稻區(qū)域試驗(yàn)晚熟組，更名為遼粳168。2016年同時(shí)參加遼寧省水稻生產(chǎn)試驗(yàn)晚熟組。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用Pi65（t）連鎖標(biāo)記InDel-1檢測(cè)BC1F2代個(gè)體

在抗病鑒定圃中種植港育129／遼星1號(hào)BC1F2群體（單株插秧），根據(jù)株型及生育期等從BC1F2中選擇農(nóng)藝性狀與遼星1號(hào)相似的單株，取葉片提取DNA，利用InDel-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)記錄各單株的稻瘟病抗病結(jié)果，由圖1可見，BC1F2群體中各個(gè)體在Pi65（t）位點(diǎn)呈現(xiàn)分離，其中與港育129基因型一致的即只擴(kuò)增出1條長(zhǎng)度約140 bp片段的個(gè)體均對(duì)稻瘟病表現(xiàn)抗病。

2.2 品種比較試驗(yàn)結(jié)果

取所篩選的篩選25個(gè)攜帶純合Pi65（t）的單株單核靠邊期花藥，通過花藥培養(yǎng)獲取再生植株800余株，冬季移栽于海南后收獲205個(gè)純合株系。從中選取了農(nóng)藝性狀與遼星1號(hào)接近的12個(gè)品系DH1、DH23、DH31、DH32、DH36、DH86、DH109、DH110、DH130、DH170、DH180和DH201，以遼星1號(hào)為對(duì)照進(jìn)行產(chǎn)量比較試驗(yàn)，方差分析結(jié)果表明，參試水稻品系間產(chǎn)量差異達(dá)顯著水平（表1）；其中DH170平均產(chǎn)量771．37 kg／667m2，較對(duì)照遼星1號(hào)增產(chǎn)顯著，在14個(gè)品系中排名第1；而DH1、DH23、DH32、DH36、DH86、DH109、DH110、DH130、DH180和DH201產(chǎn)量與遼星1間差別不顯著；DH31平均產(chǎn)量為587．12 kg／667m2，顯著低于其它品系（表2）。

2.3.1 參試過程及產(chǎn)量表現(xiàn)

2014年將排名第1的品系DH170命名為“創(chuàng)新1號(hào)”，參加了遼寧省水稻區(qū)域試驗(yàn)預(yù)備試驗(yàn)（晚熟組）。試驗(yàn)結(jié)果表明該品系在丹東、莊河和普蘭店對(duì)稻瘟病均表現(xiàn)高抗，且平均產(chǎn)量683．5 kg／667m2，比對(duì)照金禾1號(hào)增產(chǎn)8．3%，在32個(gè)參試品種中排名第1位。

2015～2016年創(chuàng)新1號(hào)更名為遼粳168，參加遼寧省水稻區(qū)域試驗(yàn)（晚熟組），14點(diǎn)次均增產(chǎn)，兩年平均產(chǎn)量613．4 kg／667m2，比對(duì)照金禾1號(hào)增產(chǎn)11．7%；2016年參加同組生產(chǎn)試驗(yàn)，平均產(chǎn)量555．2 kg／667m2，比對(duì)照金禾1號(hào)增產(chǎn)8．8%。

2.3.2 農(nóng)藝性狀

生育期162 d左右，屬晚熟品種。苗期葉色濃綠，葉片上沖，株高110．0 cm，株型緊湊，分蘗力較強(qiáng)，主莖16片葉，半散穗型，穗長(zhǎng)17．4 cm，穗粒數(shù)119．9粒，千粒重26．8 g，穎殼黃褐色，有芒。

2.3.3 米質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（杭州）測(cè)定，糙米率82．3%，精米率72．9%，整精米率71．4%，粒長(zhǎng)5．2 mm，籽粒長(zhǎng)寬比2．0，堊白粒率3%，堊白度0．2%，透明度2級(jí)，堿硝值7．0，膠稠度69 mm，直鏈淀粉17．6%，蛋白質(zhì)7．7%，米質(zhì)優(yōu)。

2.3.4 抗病檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)2015～2016兩年田間穗頸瘟病情鑒定調(diào)查，抗穗頸瘟。

圖1 分子標(biāo)記Indel-1在港育129／遼星1號(hào)BC1F2群體中基因型

表1 各品系產(chǎn)量方差分析

表2 參試各品系產(chǎn)量比較 （kg／667m2）

3 討論

傳統(tǒng)的水稻抗病育種依賴于表型鑒定和抗性鑒定的結(jié)果進(jìn)行選擇，要求育種者具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，需要多年的育種周期，并且還受病原菌、溫濕度、光照等氣候因素影響，選擇的結(jié)果容易造成誤差，甚至造成抗性基因的丟失，選擇效率往往較低［16］。分子標(biāo)記輔助選擇育種是基于標(biāo)記基因型進(jìn)行分析和選擇，其篩選結(jié)果不受環(huán)境因素影響，故能極大提高抗病植株選擇的準(zhǔn)確性和育種效率［17］。楊豐宇等在研究中利用共顯性標(biāo)記對(duì)稻瘟病抗性表型的選擇效率可達(dá)到100%［16］。孫永建等利用分子標(biāo)記輔助選擇的方法改良了水稻恢復(fù)系R997對(duì)稻瘟病的抗性，認(rèn)為這種育種方法既能縮短基因定位研究與育種應(yīng)用的距離，又可以減少費(fèi)用和育種年限，提高篩選效率［18］。

本研究利用抗稻瘟病基因Pi65（t）的連鎖標(biāo)記InDel-1輔助選擇，成功從港育129／遼星1號(hào)BC1F2群體中篩選出12個(gè)攜帶純合Pi65（t）且農(nóng)藝性狀與感病親本遼星1號(hào)相似的品系，經(jīng)鑒定，這些材料均對(duì)稻瘟病表現(xiàn)抗病，表明利用InDel-1進(jìn)行抗病基因Pi65（t）的前景選擇效率及準(zhǔn)確性均較高。由于本研究選用的抗病育種親本港育129與遼星1號(hào)農(nóng)藝性狀相似，兩品種間僅存在生育期、產(chǎn)量及抗性方面的差異，故在雜交后代的背景選擇方面僅根據(jù)田間調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷即可獲取理想的結(jié)果。但在抗病分子改良的過程中，如果父母本間差異較大、后代分離較為顯著時(shí)，除利用抗病基因的連鎖標(biāo)記進(jìn)行前景選擇外，尚需利用芯片或不用品種間的多態(tài)性SSR標(biāo)記來鑒定不同材料的遺傳背景，從而可獲得抗性提高且農(nóng)藝性狀與需改良感病親本相似的個(gè)體，最大限度保持原有品種的優(yōu)異性狀。

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S511．03

B

1002－1728（2017）03－0028－04

10．3969／j．issn．1002－1728．2017．03．006

2017－06－08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31571993）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFD0100500）

趙家銘（1981－），男，遼寧海城人，碩士，副研究員，從事水稻抗病分子改良工作。E-mail：zhaojiaming2011＠126．com

鄭文靜（1974－），女，吉林公主嶺人，博士，研究員。E-mail：zwj27＠126．com