林松峰

ISO 15189 在核酸檢測性能驗證方法中的應用價值

林松峰

目的探討經(jīng)血傳播疾病的核酸檢測采用磁珠法-實時熒光PCR檢測方法，針對這些方法進行性能驗證，以符合國際標準化組織（ISO）15189的申報要求。方法針對血液篩查檢測的核酸檢測系統(tǒng)，進行重復性實驗、靈敏度、特異性、符合率、符合性、檢出限、抗干擾試驗及穩(wěn)定性等8個方面進行驗證。結(jié)果8個方面的性能驗證數(shù)據(jù)與相應的標準進行比較，所有性能驗證結(jié)果都符合相應標準的要求。結(jié)論針對核酸檢測采用的性能驗證方法能夠滿足ISO 15189的要求，還能提高實驗室對檢測系統(tǒng)性能指標的認識，對實驗室技術(shù)管理水平的提高起到重要作用。

ISO 15189；性能驗證；核酸檢測；血液篩查檢測

輸血傳播感染性疾病的預防和控制是全社會關(guān)注的焦點，而在酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）基礎(chǔ)上增加核酸檢測已成為血站實驗室的共識，其可縮短病原體檢出的窗口期，檢出獻血者中存在的隱匿性感染[1]，降低經(jīng)輸血傳播疾病的風險，進一步保障血液安全[2]。但是，核酸檢測試劑的檢測性能能否滿足實驗室的預期，檢測系統(tǒng)的有效運轉(zhuǎn)能否達到實驗室的要求[3]，成為檢測者需要考慮的問題。IOS 15189要求實驗室必須對檢測系統(tǒng)進行性能驗證，本研究就本實驗室在IOS 15189擬申請的過程中，對核酸檢測方法的性能驗證進行分析和探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 樣本選擇①重復性：試劑的陰、陽性對照；②精密度：商品化標準品；③靈敏度及特異性：商品化血清評價盤；④符合性：室間質(zhì)評標本；⑤最低檢出限：商品化檢出限標準品和陰性血清；⑥干擾試驗：脂肪血：添加相同濃度標準品的脂肪血漿和正常血漿進行平行檢測，溶血：添加相同濃度標準品的溶血標本和正常標本進行平行檢測；⑦穩(wěn)定性實驗：選擇丙型肝炎病毒（HCV RNA）項中等陽性，即循環(huán)閾值（CT值）在30～35之間的樣本，根據(jù)離心時間和保存時間的長短進行分組平行檢測。

1.2 試劑及輔料乙型肝炎病毒（HBV DNA）、HCV RNA、人類免疫缺陷病毒（HIV1RNA）（1+2型）、核酸檢測試劑及質(zhì)控試劑（羅氏診斷）。①核酸系列血清評價盤（康側(cè)斯坦）；②精密性試驗：HBV DNA核酸血清標準物質(zhì)50 IU/ml、HCV RNA核酸血清標準物質(zhì) 200 IU/ml、HIV1RNA核酸血清標準物質(zhì)1000 IU/ml（康側(cè)斯坦）；③檢出限試驗：HCV RNA核酸血清標準物質(zhì)[世界衛(wèi)生組織（WHO）標準品]；HBV DNA核酸血清標準物質(zhì)；HIV1RNA核酸血清標準物質(zhì)（康側(cè)斯坦）；④真空采血管（科華）。

1.3 儀器CobasS201核酸檢測系統(tǒng)（羅氏診斷）。

1.4 實驗方法①重復性：在不少于 10 d的情況下進行20次檢測。②精密度：一批次內(nèi)檢測標準品20次，計算批內(nèi)精密度；連續(xù)20 d的檢測數(shù)據(jù)，計算批間精密度。③靈敏度及特異性：一批次完成對血清盤的檢測。④符合性：對參加的衛(wèi)計委臨檢中心室間質(zhì)評結(jié)果進行統(tǒng)計分析。⑤最低檢出限：檢出限標準品在同一批次檢測27孔。⑥干擾試驗：脂肪血：使用陰性脂肪血漿，添加標準品（HBV DNA 6.9 IU/ml、HCV RNA 50 IU/ml、HIV1RNA 150 IU/ml）。溶血：使用陰性血漿倍比稀釋溶血標本，添加標準品（HBV DNA 6.9 IU/ml、HCV RNA 50 IU/ml、HIV1RNA 150 IU/ml）。⑦穩(wěn)定性試驗：將HCV RNA項中等陽性（CT值在30～35之間）樣本，室溫分別放置0、4、8、24和48 h離心。將離心后的陽性樣本2～8 ℃放置0、1、2、3、4 d后進行檢測。

1.5 判定標準①重復性：20次檢測結(jié)果不能出現(xiàn)＞1次不符合說明書要求的情況。②精密度：批內(nèi)精密度應≤2％，批間精密度應≤3％。③靈敏度、特異性和符合率判定標準：均為100％。④符合性判定標準：衛(wèi)計委室間質(zhì)評的結(jié)果符合性≥80％。⑤最低檢出限判定標準：應滿足26孔為陽性（95％置信區(qū)間），且滿足廠家最低檢出限（HBV DNA 2.3 IU/ml、HCV RNA 6.8 IU/ml、HIV1RNA 50 IU/ml）要求。

1.6 干擾試驗①脂肪血標準應滿足：脂肪血檢測值與對照組檢測值偏倚小于+7.5％；三酰甘油含量≤3300 mg/dL時，均不會干擾試劑的靈敏度和特異性。②溶血標準應滿足：溶血檢測值與對照組檢測值偏倚小于+7.5％；血紅蛋白含量≤500 mg/dL時，均不會干擾試劑的靈敏度和特異性。③穩(wěn)定性試驗判定標準：檢測值與對照組檢測值偏倚小于+7.5％。

2 結(jié)果

2.1 重復性陰、陽性對照實驗結(jié)果20次，其檢測結(jié)果為100％，均符合標準。見表1。

表1 重復性檢測結(jié)果

2.2 精密度檢測20次，均符合標準。見表2。

表2 精密度檢測結(jié)果

2.3 靈敏度、特異性和符合率采用血型盤，其包含36份標本，通過計算，靈敏度、特異性、符合率均為100％。見表3。

表3 靈敏度、特異性和符合率檢測結(jié)果

2.4 符合性實驗室參加衛(wèi)計委臨檢中心 2015年度第一次室間質(zhì)評，合計10份標本，其中HIV1RNA反應性2例，HBV DNA反應性3例，HCV RNA反應性3例，符合性為100％。

2.5 最低檢出限該檢測系統(tǒng)在本實驗室的最低檢出限，其中HBV、HIV1均滿足生產(chǎn)商的要求（95％置信度）；HCV經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件分析其95％最低檢出限為16.03 IU/ml，不符合說明書要求。見表4。

表4 最低檢出限檢測結(jié)果

2.6 干擾試驗

2.6.1 脂肪血檢測結(jié)果 經(jīng)試驗驗證，380 mg/dL的三酰甘油對各項檢測均無明顯影響，且偏倚均未超過+7.5％。見表5。

表5 脂肪血檢測結(jié)果

2.6.2 溶血檢測結(jié)果 經(jīng)試驗驗證，血紅蛋白濃度為2800 mg/dL的溶血標本對各項檢測無影響，且偏倚均未超過+7.5％。見表6。

表6 溶血檢測結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性

2.7.1 室溫放置后的穩(wěn)定性評價 每份樣品檢測3次，取均值與對照組（0 h）相比，檢測值（CT）偏倚均小于+7.5％，符合預期。見表7。

表7 室溫放置后的檢測結(jié)果

2.7.2 離心后冷藏放置的穩(wěn)定性評價 每份樣品檢測3次，取均值與對照組（0 d）相比，CT值偏倚均小于+7.5％，符合預期。見表8。

表8 離心冷藏放置后的檢測結(jié)果

3 討論

實驗室的方法學驗證是申請 ISO 15189時必須提供的數(shù)據(jù)材料，能如實反映實驗室的檢測水平，其中的重要因素即為試劑與其配套設(shè)備組成的檢測系統(tǒng)，根據(jù)要求只有符合實驗室預期的檢測系統(tǒng)才能應用于檢測，并且對驗證的性能指標和驗證方法的選擇有著比較明確的說明[4]，而血站實驗室根據(jù)行業(yè)標準[5]的要求也需要對檢測方法進行驗證，方法確認應盡可能全面，并通過客觀證據(jù)（以性能特征形式）證實滿足試驗預期用途的要求[6]。

另外，樣本的選擇也十分重要，要能反映驗證指標的特性，要有溯源性，從而全面地保證驗證的客觀性。而在實際的驗證過程中發(fā)現(xiàn)，在HCV RNA的最低檢出限試驗中，無論康側(cè)斯坦還是WHO的標準品均不能在本實驗室復現(xiàn)說明書標注的檢測下限，經(jīng)與生產(chǎn)商溝通，其向?qū)嶒炇姨峁┳C明材料說明該試劑最低檢出限符合要求。其次，脂肪血和溶血標本對于核酸檢測的影響是非常重要的[7]，但是通過本試驗數(shù)據(jù)可以看出，一定濃度的脂肪血和溶血對試驗的干擾在一定程度上是可以接受的。在實際工作中，標本的采集、處理、保存不當，均會造成核酸酶污染的假陽性或病毒核酸降解的假陰性，從而影響檢測結(jié)果的真實性[8]，故標本的前處理關(guān)系到檢驗結(jié)果的準確與穩(wěn)定。為此設(shè)計了穩(wěn)定性試驗以模擬超限情況對中強度陽性標本的影響，數(shù)據(jù)表明偏倚是符合預期的，但并不能說明超限的外部條件對低濃度陽性標本的影響可以忽略不計，尤其是HCV RNA的穩(wěn)定性較差，短時常溫保存都會造成病毒核酸的降解[9]，故核酸標本應該始終處于合理的保存溫度，并在規(guī)定時限內(nèi)完成檢測。通過對各項指標的驗證，確認系統(tǒng)的分析靈敏度已經(jīng)達到了生產(chǎn)商的檢測要求，實驗室已經(jīng)具備了系統(tǒng)所要求的檢測能力[10]。同時，對于試劑、物料的選擇也有一定的參考作用，以提高實驗室的整體檢測水平，進一步保證臨床輸血的安全。

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[5] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.血站技術(shù)操作規(guī)范(2015版)[S].北京:中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會, 2015.

[6] 中國合格評定國家認可委員會.醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準(CNAS-CL02:2012)[S].北京:中國合格評定國家認可委員會,2014.

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10.12010/j.issn.1673-5846.2017.02.047

遼寧省血液中心，遼寧沈陽 110044

林松峰（1977.4-），本科學歷，醫(yī)務工作人員，主管檢驗師。研究方向：檢驗方面。E-mail：lxn060109@163.com