范婉思張貞嬋胡建焜

高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸的含量

范婉思1張貞嬋2胡建焜1

目的為提高復(fù)方金銀花顆粒的質(zhì)量控制，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方金銀花顆粒中藥效成分的綠原酸含量。方法色譜柱：DIKMA Diamomsil（TM）C18柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈：0.3％磷酸（15:85）（v/v）；流速：1.00 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm；柱溫：30 ℃。采用高效液相色譜法對(duì)復(fù)方金銀花顆粒中的綠原酸研究進(jìn)行，包括（系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)、線(xiàn)性關(guān)系考察、精密度考察、穩(wěn)定性考察、重現(xiàn)性考察、加樣回收試驗(yàn)10批復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定）。結(jié)果復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸進(jìn)樣量在一定范圍內(nèi)與峰面積呈線(xiàn)性關(guān)系（r=0.9999），本方法中綠原酸檢測(cè)的平均加樣回收率為97.02％，RSD值為0.52％（n=6）。結(jié)論高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸含量具有簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可作為復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸質(zhì)量控制的依據(jù)。

復(fù)方金銀花顆粒；綠原酸；高效液相色譜法；含量測(cè)定

金銀花是我國(guó)傳統(tǒng)的常用大宗藥材之一，特別是在非典時(shí)期發(fā)揮了極其重要的作用，以金銀花配方的中藥制劑也是人們家用的常備藥品。2015年版《中國(guó)藥典》金銀花的來(lái)源為忍冬科植物忍冬（Lonicerajaponica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[1]。金銀花、連翹、黃芩等三味藥系復(fù)方金銀花顆粒組成藥材，該復(fù)方制劑常用于熱感、扁桃體炎、咽炎、目痛等癥狀[2]。復(fù)方金銀花顆粒中金銀花為主藥，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫及解毒抗炎作用，其主要活性成分為綠原酸[3-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，綠原酸具有廣譜抗菌、增強(qiáng)免疫及解熱抗炎等多種藥理活性[5-8]?，F(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中，復(fù)方金銀花顆粒定性鑒定綠原酸簡(jiǎn)單快捷，但隨著我國(guó)對(duì)中成藥質(zhì)量控制水平的提高，化學(xué)定性方法已無(wú)法滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)的要求。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜（HPLC）法，尋求一種高效可控的方法，測(cè)定復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸的含量，以便更好控制經(jīng)典中成藥的質(zhì)量。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器VARIAN 210型高效色譜儀，色譜柱：DIKMA Diamomsil（TM）C18（250 mm×4.60 mm，5 μm），1/10萬(wàn)電子天平（GR-202，A&D日本）。

1.2 試藥 甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水；綠原酸對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：130715-201016；復(fù)方金銀花顆粒：修正藥業(yè)集團(tuán)長(zhǎng)春高新制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1310301、1212041、1205012；10批次復(fù)方金銀花顆粒實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：1501-1510。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：ULTIMATE×B C18（250 mm× 4.60 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈：0.3％磷酸（15:85），檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm，流速：1.0 ml/min，柱溫：30 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的配制精密稱(chēng)取在 120 ℃減壓干燥至恒重的綠原酸對(duì)照品11.6 mg，置100 ml容量瓶中。定容時(shí)選用甲醇作為溶劑，并對(duì)綠原酸進(jìn)行溶解，最終定容置刻度線(xiàn)，搖勻，即為對(duì)照母液（濃度116 μg/ml）。再精密吸取對(duì)照母液4 ml，置10 ml容量瓶，用甲醇稀釋定容置刻度，按照要求搖勻，即為對(duì)照品溶液（46.4 μg/ml），微孔濾膜濾過(guò)備用。

2.3 復(fù)方金銀花顆粒供試樣液的配制精密稱(chēng)取復(fù)方金銀花顆粒0.5 g，適量甲醇溶解于錐形瓶，精密稱(chēng)定錐形瓶總重量，超聲30 min，稱(chēng)重，甲醇補(bǔ)足重量，并將其混勻，濾紙過(guò)濾，精密量取1.0 ml，置10 ml容量瓶，用甲醇稀釋定容置刻度，按照要求搖勻，微孔濾膜過(guò)濾，即為復(fù)方金銀花顆粒供試樣液。

2.4 測(cè)定紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)設(shè)定將配制好的綠原酸對(duì)照品溶液，在紫外可見(jiàn)區(qū)域內(nèi)200～600 nm處進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸在326 nm處有最大吸收峰，且用供試品溶液掃描發(fā)現(xiàn)輔料對(duì)其不存在干擾，故選定326 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)分別取上述綠原酸對(duì)照、復(fù)方金銀花顆粒供試品、按處方量制備缺金銀花的陰性對(duì)照樣品。按照液相操作要求進(jìn)行進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)供試液在相同位置上與綠原酸對(duì)照有相同的峰，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.6 線(xiàn)性關(guān)系考察分別精密量取綠原酸對(duì)照儲(chǔ)備液（116 μg/ml）1、2、3、4、5、6、7、8 ml，置10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，液相進(jìn)樣，采用流速為每分鐘1.0 ml，測(cè)定綠原酸峰面積。以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：Y=28.088 X+0.886（r=0.9997），進(jìn)樣量在0.200 μg～1.800 μg之間時(shí)，該回歸曲線(xiàn)有良好的線(xiàn)性關(guān)線(xiàn)。

圖1 綠原酸測(cè)定HPLC

2.7 精密度考察密量取綠原酸對(duì)照儲(chǔ)備液（116 μg/ml）5 ml，置10 ml容量瓶中，用甲醇定溶，配得對(duì)照品溶液（濃度58 μg/ml）。進(jìn)樣20 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定綠原酸平均峰面積為26.4838，RSD為0.68％。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱(chēng)6份復(fù)方金銀花顆粒1.002 g，配制方法參照2.3項(xiàng)下方法，于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣20 μl，測(cè)定綠原酸平均峰面積為19.0098，RSD為1.99％。

2.9 重現(xiàn)性考察精密量取綠原酸對(duì)照儲(chǔ)備液（116 μg/ml）4 ml，置10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，濾過(guò)，即為對(duì)照品溶液（濃度46.4 μg/ml）。供試液的配制：取1310301批復(fù)方金銀花顆粒0.5 g，共6份，參照見(jiàn)2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行配制溶液，進(jìn)樣20 μl，測(cè)定6份供試品綠原酸平均含量為26.4314 mg/g，RSD為1.07％。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)取 1310301批復(fù)方金銀花顆粒0.5 g，共6份，精密稱(chēng)定，置50 ml容量瓶中，加甲醇接近刻度時(shí)超聲 30 min，取出放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾紙過(guò)濾，前5 ml棄去，余液收集，從中精密吸取1 ml移入10 ml容量瓶，再精密加入綠原酸對(duì)照儲(chǔ)備液（116 μg/ml）2 ml后用甲醇稀釋到刻度，搖勻、微孔濾膜濾過(guò)，既得。測(cè)定：取上述樣液分別進(jìn)樣20 μl，測(cè)定峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方金銀花顆粒供試品中綠原酸的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 10批復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸含量測(cè)定結(jié)果

2.11 復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸含量測(cè)定取10個(gè)不同批號(hào)復(fù)方金銀花顆粒，精密稱(chēng)定，配制方法見(jiàn)2.3項(xiàng)下供試品樣液的配制方法，得供試品樣液。取以上對(duì)照液和10份樣品供試液分別進(jìn)樣，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-2％磷酸、乙腈-1％冰醋酸、乙腈-3％磷酸等流動(dòng)相，最終確定乙腈-3％冰醋酸（15:85）作為流動(dòng)相，流速為1.0 ml//min，分離效果良好。取綠原酸對(duì)照在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果表明綠原酸在326 nm處有最大吸收峰，因此，選擇326 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。10個(gè)不同批次的產(chǎn)品中綠原酸的含量在為 1.00％～1.39％，考慮到測(cè)定偏差等多種因素，綠原酸含量應(yīng)不低于0.9％。本實(shí)驗(yàn)曾以乙酸乙酯、甲醇作為提取溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用甲醇作為提取溶劑時(shí)，所得的綠原酸和黃芩苷的量大，樣品中的成分提取比較完全，因此，本實(shí)驗(yàn)確定用甲醇作為提取溶劑。本實(shí)驗(yàn)將樣品分別超聲30、60、80 min后測(cè)定綠原酸的含量，結(jié)果含量無(wú)明顯差別，故確定超聲時(shí)間為 30 min。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了 10批復(fù)方金銀花顆粒，HPLC法測(cè)定發(fā)現(xiàn)，不同批次間，綠原酸含量差異小，僅有1507批次的復(fù)方金銀花顆粒存在綠原酸含量差異，但差異不大。用 HPLC法測(cè)定復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸的含量，具有準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好，且操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，可作為復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸質(zhì)量控制的依據(jù)。

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Determination of Chlorogenic Acid in Compound Lonicera Granules by HPLC

Fan Wansi Zhan Zhenchan Hu Jiankun

Compound Lonicera Granules;Chlorogenic acid;HPLC;Determination

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.02.007

1廣東省中醫(yī)院藥劑科，廣東廣州 510120

2廣州白云山和記黃埔中藥有限公司質(zhì)量管理部，廣東廣州 510515

范婉思（1983-），本科學(xué)士，中藥師。研究方向：臨床中藥學(xué)。E-mail：chasefan@163.com

【Objective】ObjectiveTo establish the method for the determination chlorogenic acid in Compound Lonicera Granules.which provides a reliable method for the quality control of Compound Lonicera Granules.MethodsThe HPLC method was used.Column:DIKMA Diamomsil(TM)C18(5 μm,250 mm×4.6 mm).The mobile phase: acetonitrile -0.2％ phosphonic acid=(20:80)(v/v).The flow speed:1.0 ml.min-1.The wavelength was at 326 nm.The column temperature:30 ℃.Study on chlorogenic acid of compound Compound Lonicera Granules which included (the system suitability test,linear relation test,precision,stability,reproducibility of investigation,chlorogenic acid recovery test the 10 batch of the same factory compound Lonicera granules was determined).ResultsThe regression equation of chlorogenic acid was linear in the range of 0.232 μg～1.856 μg(r=0.9999),the average recovery method was 97.02％,RSD was 0.52％(n=6).ConclusionThe method was stable and accurate.It is suitable to determine chlorogenicacid in Compound Lonicera Granule and can be applied to the content control for compoud lonicera granules.