史晴晴于紅梅

（河北省廊坊市第四人民醫(yī)院，河北廊坊065700）

·研究報(bào)告·

白芍總苷對(duì)腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡抑制作用的研究*

史晴晴△于紅梅

（河北省廊坊市第四人民醫(yī)院，河北廊坊065700）

目的觀察白芍總苷對(duì)腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響。方法設(shè)假手術(shù)組、模型組、白芍總苷低、中、高劑量組，每組20只大鼠；采用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注模型。缺血2 h后再灌注，灌注前0.5 h灌胃給藥。再灌注24 h后采用盲法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，剝?nèi)∧X組織后測(cè)定含水量和梗死體積，檢測(cè)凋亡神經(jīng)細(xì)胞，測(cè)定凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，白芍總苷中、高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低（P＜0.01）、神經(jīng)功能明顯改善，腦組織含水量和梗死體積均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；白芍總苷低、中、高劑量組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量呈不同程度減少，其中白芍總苷中、高劑量組凋亡指數(shù)（AI）顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；白芍總苷中、高劑量組促凋亡基因Bax表達(dá)顯著下調(diào)、抑凋亡基因Bcl-2顯著上調(diào)、Bcl-2/Bax值顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），促凋亡蛋白Caspase-3、NF-κB表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論白芍總苷對(duì)腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有抑制作用，從而表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)可能是其重要的作用機(jī)制。

白芍總苷細(xì)胞凋亡局灶性腦缺血再灌注

隨著人口老齡化的加速以及高血壓病、高脂血癥等患病率的提高，缺血性腦卒中已經(jīng)發(fā)展成為我國人民生命健康的主要威脅之一，緊急藥物溶栓和介入手術(shù)是臨床上的常用技術(shù)手段，但血管在通后所繼發(fā)的“缺血再灌注”損傷仍嚴(yán)重影響著該類患者預(yù)后。Wang Y等研究發(fā)現(xiàn)繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦組織缺血再灌注損傷重要的病理基礎(chǔ)，因此以抑制細(xì)胞凋亡為靶點(diǎn)研究新型藥物，或許是降低缺血再灌注損傷的新途徑［1］。白芍總皂苷作為中藥白芍的主要藥理活性成分具有多重的藥理作用，如免疫抑制、抗氧化、抗炎等［2-3］。張華龍等發(fā)現(xiàn)在心肌缺血再灌注后細(xì)胞發(fā)生凋亡過程中給予白芍總苷能夠顯著抑制凋亡的發(fā)生，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用［4］。然而白芍總苷相同病因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞損傷是否具有相同作用鮮見文獻(xiàn)報(bào)道，本研究將就這一問題進(jìn)行觀察?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD清潔級(jí)大鼠，雄性，體質(zhì)量260～300 g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物自由飲水和進(jìn)食，晝夜節(jié)律為12 h。

1.2 藥劑與儀器白芍總苷膠囊（寧波立華制藥有限公司）；TUNEL試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Caspase-3、NF-κB單克隆抗體（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 造模與分組模型制備與給藥，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將100只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)組、模型組與白芍總苷低、中、高劑量組，每組20只大鼠；采用線栓法建立腦缺血再灌注大鼠模型［5］；假手術(shù)組行手術(shù)通路但不插入栓線；缺血2 h后再灌注，于再灌注前30 min灌胃給藥，白芍總苷低、中、高劑量組分別給予50、100、200 mg/kg白芍總苷溶液灌胃；假手術(shù)組和模型組同步灌胃給予等體積0.9％氯化鈉注射液。

1.4 觀察指標(biāo)神經(jīng)功能評(píng)分于再灌注24 h后進(jìn)行，參照10分制評(píng)分方法行盲法評(píng)分。腦組織含水量和梗死體積的測(cè)定，分別記錄腦組織濕重（W）與干重（D），腦含水量（％）=［（W-D）/W］×100％；大腦組織沿冠狀切片，厚度約2 mm，置于2％的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液中避光孵育0.5 h（梗死區(qū)呈蒼白色），運(yùn)用圖像分析軟件計(jì)算大腦組織梗死百分比。TUNEL染色法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況。RT-PCR法檢測(cè)Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)。Western blotting法測(cè)定Caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分、腦組織含水量及梗死體積比較見表1。模型組大鼠各指標(biāo)較假手術(shù)組均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，白芍總苷中、高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量和梗死體積百分比均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡狀況比較見表2。模型組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多；白芍總苷各組腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)量較模型組呈不同程度減少，其中以白芍總苷高劑量組最為顯著，結(jié)果見圖1。凋亡指數(shù)（AI）計(jì)算結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織細(xì)胞AI較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，白芍總苷中、高劑量組AI顯著降低（P＜0.01）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分、腦組織含水量及腦組織梗死體積比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分、腦組織含水量及腦組織梗死體積比較（±s）

與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別n腦含水量（％）神經(jīng)評(píng)分（分）腦梗死體積（％）假手術(shù)組2077.9±1.4模型組2086.1±1.9**0.0±0.00.0±0.0 8.5±0.9**27.9±2.8**白芍總苷低劑量組2084.3±2.2 8.1±1.225.2±3.4白芍總苷中劑量組206.3±0.8△△21.5±2.6△80.7±1.8△白芍總苷高劑量組2078.4±2.0△△4.8±0.5△△17.9±2.1△△

圖1 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況（TUNEL，400倍）

表2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞AI比較（±s）

表2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞AI比較（±s）

組別n假手術(shù)組20模型組20白芍總苷低劑量組20 AI（％）4.3±1.7 57.6±8.4**51.2±10.9白芍總苷中劑量組2028.1±6.3△△白芍總苷高劑量組2022.7±5.9△△

2.3 各組大鼠腦組織Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)結(jié)果比較見表3。模型組mRNA表達(dá)較假手術(shù)組均顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2/Bax值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，白芍總苷中、高劑量組Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)且Bax mRNA顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2/Bax值顯著升高（P＜0.01）。

2.4 各組大鼠腦組織Caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)比較見圖2和表4。模型組腦組織Caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)較假手術(shù)組均顯著上調(diào)（P＜0.01）；而與模型組比較，白芍總苷中、高劑量組Caspase-3、NF-κB均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax值比較（±s）

表3 各組大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax值比較（±s）

組別nBcl-2/Bax Bcl-2（×10-3）Bax（×10-3）假手術(shù)組200.49±0.21模型組200.34±0.15**30.9±5.863.1±14.8 37.4±9.5*109.5±22.6**白芍總苷低劑量組200.42±0.23 43.1±10.9100.8±19.2白芍總苷中劑量組2054.6±13.0△88.5±17.4△△0.62±0.29△△白芍總苷高劑量組200.84±0.36△△61.3±12.7△△73.0±15.6△△

圖2 各組大鼠腦組織NF-κB、Caspase-3蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠腦組織中Caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠腦組織中Caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)比較（±s）

組別n Caspase-3/β-actinNF-κB/β-actin假手術(shù)組20模型組20 0.16±0.040.13±0.07 0.63±0.19**0.48±0.17**白芍總苷低劑量組200.54±0.230.40±0.15白芍總苷中劑量組200.44±0.18△0.32±0.12△白芍總苷高劑量組200.23±0.15△△0.27±0.09△△

3 討論

流行病學(xué)顯示，缺血性腦血管疾病發(fā)病率逐年上升，而其致死率仍居高不下，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。采用及時(shí)溶栓以恢復(fù)血流再灌注能夠挽救部分“缺血半暗帶區(qū)域”神經(jīng)細(xì)胞?！叭毖俟嘧p傷”并發(fā)癥對(duì)神經(jīng)元造成的損傷嚴(yán)重影響著患者預(yù)后。這是個(gè)復(fù)雜的損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Wang Y等研究發(fā)現(xiàn)繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦組織缺血再灌注損傷重要的病理機(jī)制［1］。

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序化死亡過程，由多種基因參與調(diào)控，其中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）為抑凋亡基因而Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）是促進(jìn)凋亡的基因，兩者相輔相成共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程［6］；Bcl-2不僅對(duì)線粒體損傷具有直接的保護(hù)作用，還間接抑制促凋亡調(diào)控蛋白Caspase-3激活［7］、抑制Bax細(xì)胞毒性作用，從而表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用［8］；Bax能夠破壞線粒體滲透性而導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放增加、激活Caspase-9，表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用；因此Bax/ bcl-2值更加能夠體現(xiàn)Bax和bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用［9］。NF-κB是一種多效能核轉(zhuǎn)錄因子，Zhang Q等研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的激活可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞功能如吞噬和浸潤等，從而激活凋亡信號(hào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［10］。然而，在正常情況下核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB已無活性狀態(tài)存在于胞質(zhì)中，當(dāng)受到刺激激活形成多聚體，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，入核發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，誘導(dǎo)促凋亡信號(hào)釋放而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10-15］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，白芍總苷100～200 mg/kg能夠顯著改善大鼠腦缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙、減少腦組織的含水量并顯著減少腦組織梗死范圍。TUNEL染色結(jié)果顯示：白芍總苷能夠抑制腦缺血再灌注大鼠腦組織細(xì)胞凋亡并顯著降低AI，上調(diào)抑凋亡基因的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡基因表達(dá)。結(jié)果提示白芍總苷對(duì)腦缺血再灌注損傷的抑制作用，可能是通過改善神經(jīng)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)可能是其重要的作用機(jī)制。

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Inhibitory Effects of Total Glucosides of Paeony on Apoptosis in the Rats with Cerebral Ischemia-reper-fusion

SHI Qingqing，YU Hongmei.The Fourth People’s Hospital of Langfang，Hebei，Langfang 065700，China.

Objective：To study the inhibitory effects of total glucosides of paeony（TGP）on neuronal apoptosis in the rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods：The rats were divided into the sham group，the model group，and TGP（50，100，200 mg/kg）groups，20 rats in each.The model of focal cerebral ischemic reperfusion was established with Zea-longa occluding suture；0.5h before reperfusion，the drugs were given by intragastric administration.Twenty-four hours after reperfusion，the neurological deficits，ratio of infarct volume，water content of the brain were evaluated；the neurocyte apoptosis were observed and Apoptosis Index（AI）was determined；the expression of bcl-2 mRNA，Bax mRNA and caspase-3，NF-κB protein were detected.Results：Compared with the model group，the neurological scores of TGP medium，high-dose groups decreased significantly（P＜0.01）；neurological function improved significantly；the ratio of infarct volume and brain water content decreased significantly（P＜0.05 or P＜0.01）；the neurocyte apoptosis of TGP groups were significantly improved；and AI of TGP medium，high-dose groups decreased significantly；the expression of bcl-2 mRNA was significantly up-regulated and the expression of Bax mRNA was significantly down-regulated；the ratio of bcl-2/Bax was significantly increased；the expression of caspase-3，NF-κB protein was significantly down-regulated（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：TGP can reduce focal cerebral ischemia reperfusion injury by inhibiting neuronal apoptosis and shows a certain protection.Regulating the expression of apoptosis related genes and proteins may be an important mechanism.

TGP；Apoptosis；Focal；Cerebral ischemia-reperfusion

R743.9

A

1004-745X（2017）06-0973-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.06.010

2017-03-01）

河北省廊坊市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2016013151）

△通信作者（電子郵箱：lfsysqq@163.com）